李海清 ，徐 芳 ，吳麗春 ，李明博 ，戴 艷

（ 1.黑龍江省醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱，150000；2.佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯，154007）

牙根吸收是牙齒壓低過程中最常見的并發(fā)癥之一[1]。臨床上，早期很難檢測到牙根吸收并且牙根吸收沒有有效的治療措施[2]，因此尋找一種早期檢測牙根吸收并且可以監(jiān)測牙根吸收的發(fā)生、發(fā)展及修復(fù)的指標(biāo)對于正畸臨床具有重要意義。牙本質(zhì)磷蛋白（dentin phosphoproteins ,DPP）屬于牙本質(zhì)的特異性蛋白[3]，參與牙本質(zhì)的生物礦化與再礦化[4]，在牙根吸收過程中，這些蛋白質(zhì)會釋放到齦溝液中[5]，因此在牙根吸收過程中齦溝液中的DPP發(fā)生變化。本研究檢測了一個加力周期齦溝液中DPP含量的變化及組織學(xué)上牙根吸收的情況，探討DPP與牙根吸收發(fā)生、發(fā)展及修復(fù)的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 建立新西蘭大白兔正畸壓低牙齒致根吸收的模型

隨機取66只月齡相同（4個月大），體重4±0.3Kg，雄性新西蘭大白兔（黑龍江省哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗動物有限公司），0.1%的戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉，用手術(shù)刀沿口角至左側(cè)下頜第一磨牙根尖部將組織切開，暴露根尖部骨組織，在下頜骨下緣上2mm，植入支抗釘，支抗釘直徑4mm,長度16mm，植入支抗釘時避免破壞牙根根尖部。再用高速渦輪手機在新西蘭大白兔左側(cè)下頜第一磨距牙頜面1/3處磨深約 0．5 mm的固位溝，用 1 根直徑 0.2 mm 的結(jié)扎絲，結(jié)扎絲套上橡皮鏈，環(huán)繞固位溝與左側(cè)下頜第一磨牙擰緊，將橡皮鏈拉伸，用SP strain gauge進(jìn)行測力（可重復(fù)性達(dá)95%以上），測力計測釋放 50 g 力值的橡皮鏈套入支抗釘（圖 1）。

圖 1 大鼠正畸牙移動致牙根吸收模型Figure 1 Root-absorption model of orthodontic tooth movement in rats

1.2 齦溝液的采集與 DPP 濃度檢測

上述新西蘭大白兔隨機分為不加力組33只和加力50g組33只，分別于第 0d、3d、6d、9d、12d、15d、18d、21d、24d、27d、30d 提取左側(cè)下頜第一磨牙齦溝液，并進(jìn)行樣本處理，將預(yù)先準(zhǔn)備好的20號吸潮指尖裝于一個 EP 管內(nèi)，稱重，高溫高壓消毒后烘干備用。將兔麻醉并固定，然后清潔吹干實驗牙，將吸潮指尖分別放入實驗牙近、遠(yuǎn)中的頰、舌側(cè)齦溝內(nèi)，輕輕放入不加壓，放置 30 s 后取出，按此方法間隔 2 min ，重復(fù) 3次取平均值。將取液后的吸潮指尖放入于 EP 管稱重，儲存在－70 ℃冰箱備用。兩次稱重值之差為齦溝液的重量 G。根據(jù)濃度C為1 mg/μL 換算體積 V＝G/C。取出冷凍待檢樣本平衡至室溫，每個 EP 管加入 0.01 mol/L，pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液120μL，浸泡并震蕩lh，1500r/min×15 min離心。使用大白兔牙本質(zhì)磷蛋白定量 ELASA試劑盒，雙抗體夾心 ABC－ELASA 法測出450nm 處OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出標(biāo)本中 DPP 濃度。

1.3 組織標(biāo)本制備，染色與圖像分析

取齦溝液后，將4%多聚甲醛經(jīng)新西蘭大白兔的心臟灌注，處死。切取下頜骨組織（左側(cè)下頜磨牙區(qū)及其周圍牙槽骨組織），經(jīng)4%多聚甲醛液固定48 h后，10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）常溫脫鈣6周，然后經(jīng)過一系列梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，最終將標(biāo)本沿磨牙長軸進(jìn)行近遠(yuǎn)中向連續(xù)切片，每張厚約6μm。選取可見到左側(cè)下頜第一磨牙根尖部的組織切片，行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色以觀察牙根吸收陷窩面積和破牙骨質(zhì)細(xì)胞數(shù)量。HE 染色測量牙根表面吸收陷窩面積，Motic3000顯微攝影系統(tǒng)于100倍下攝片，采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對牙本質(zhì)面積進(jìn)行分析，此分析是通過計算牙根吸收相對面積來表達(dá)，公式如下：根吸收相對面積＝一個視野內(nèi)根吸收面積／該視野內(nèi)根面總長度。抗酒石酸酸性磷酸酶主要來源于破骨細(xì)胞，因而測量牙體中TRAP 可以了解破骨細(xì)胞的功能狀態(tài)及數(shù)量。Motic3000顯微攝影系統(tǒng)于400倍下攝片，采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對左側(cè)下頜第一磨牙根尖區(qū)TRAP陽性表達(dá)進(jìn)行定量分析，以積分光密度(IOD) 代表抗酒石酸酸性磷酸酶蛋白相對表達(dá)量，進(jìn)而表達(dá)破骨細(xì)胞的數(shù)量，積分光密度（IOD）=陽性面積×平均光密度，每例隨機分析3個高倍鏡視野，每個視野選取3個不同區(qū)域相同面積，取其均值代表該視野蛋白的相對表達(dá)量。用 Motic Images Advanced 3.2圖像分析軟件分析，TRAP 染色計算破牙骨質(zhì)細(xì)胞的含量，重復(fù)3次后取平均值。

1.4 統(tǒng)計分析

本實驗數(shù)據(jù)用 SPSS 18．0分析軟件對齦溝液中 DPP 濃度進(jìn)行單因素方差分析（one－way ANOVA），將齦溝液中 DPP 濃度分別與牙根吸收相對面積、TRAP 染色陽性細(xì)胞含量進(jìn)行雙變量相關(guān)分析（Bivariate Correlations）和線性回歸分析（Linear Regression）。

2 結(jié) 果

2.1 大體標(biāo)本觀察

不加力組：牙齒臨床冠高度不變；加力50g組：實驗牙被平均壓低約1±0.11mm。

2.2 ELASA 檢測加力50g組左側(cè)下頜第一磨牙齦溝液中 DPP 濃度變化

加力30d，第0d到6d,DPP濃度逐漸升高，從（23.65±0.75）μg/mg 升高至 （30.93±2.01）μg/mg； 第6d到15d濃 度 相 對 穩(wěn) 定， 從（30.93±2.01）μg/mg 至 （31.07±1.16）μg/mg之間波動，第15d到第21d濃度又再度 升 高， 從（31.07±1.16）μg/mg 升 高 至（36.17±1.03）μg/mg；第21d到第30d濃度降低,從（36.17±1.03）μg/mg 降低至 （24.05±1.04）μg/mg；而不加力組，DPP濃度一直處于穩(wěn)定水平（24．41±2.79）μg/mg，不同組間顯示有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。（表1）

繪制不加力組與加力組DPP濃度變化曲線圖（圖 2）。

圖 2 兔下頜第一磨牙齦溝液 DPP 濃度變化曲線圖Figure 2 Curve of DPP concentration in gingival crevicular fluid of rabbit mandibular first molar

兔下頜左側(cè)第一磨牙根尖區(qū)表面持續(xù)加力第0d～6d，HE染色吸收陷窩的相對面積逐漸從 430.71±6.88增 加 到 623.37±9.74； 第 6d～ 15d從 623.37±9.74到 621.41±6.70面 積 相對穩(wěn)定，第15d～21d從621.41±6.70減少到432.97±9.94，第 21d～ 30d從 432.97±9.94減少到428.93±7.20面積相對穩(wěn)定。牙根吸收陷窩的相對面積在兩組之間存在變化，并且明顯（P＜0.01）。修復(fù)性牙本質(zhì)在圖3中可觀察到。

持續(xù)加力第 0d ～15d，第一磨牙根尖區(qū)表面TRAP染色陽性IOD值檢測破骨細(xì)胞數(shù)688.69±10.28逐漸增多至 1418.06±7.53，第15d～30d減少至697.71±7.04（表 2）。不加力組和加力50g組切片相比，TRAP 染色陽性破牙骨質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯變化，圖4可見TRAP染色陽性細(xì)胞。

圖 3修復(fù)性牙本質(zhì)（HE 染色×100）Figure 3 also shows repairing dentin

圖4 見 TRAP 染色陽性細(xì)胞（TRAP 染色×400）Figure 4 No TRAP staining positive cells

表1 大白兔下頜第一磨牙齦溝液 DPP 濃度 （μg／mg，x±s）Figure 1 The concentration of DPP in gingival crevicular fluid of the first mandibular molar of rabbits (ug/mg, x+s).

表 2 兔下頜第一磨牙根尖區(qū)表面 HE 和 TRAP 染色結(jié)果 （x±s）Table 2 The results of TRAP and HE staining on the apical surface of the first mandibular molar in rabbits (x±s).

表3 齦溝液中 DPP 濃度與牙根吸收相對面積雙變量相關(guān)分析Table 3 Bivariate correlation analysis between DPP concentration in gingival crevicular fluid and relative root resorption area

2.4 雙變量相關(guān)分析和線性回歸分析

我們把兩個變量牙本質(zhì)磷蛋白DPP和牙根的吸收陷窩相對面積，做散點圖，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在相關(guān)性，呈直線趨勢，經(jīng)過雙變量分析,得出了相關(guān)系數(shù)Pearson為0.533，P＜0．05，可以認(rèn)為這兩個變量之間是有關(guān)聯(lián)的（表3）。我們進(jìn)一步將兩者進(jìn)行線性回歸得出回歸方程，方程式如下：DPP濃度(y)=16.9400.026×相對面積(x)（表4），在此過程中我們并未發(fā)現(xiàn)TRAP染色陽性破牙骨質(zhì)細(xì)胞表達(dá)量與DPP濃度之間存在特別明顯的相關(guān)趨勢。

3 討 論

牙齒壓低是正畸治療中一種常見的牙齒移動方式[6]，但牙齒壓低過程很容易出現(xiàn)牙根吸收，牙根吸收具有不可逆性，同時臨床沒有有效的治療方法，因此尋找一種簡單、無破壞性的指標(biāo)來檢測牙根吸收及修復(fù)的過程，對臨床上牙齒的矯正具有重要的意義。免疫定位研究顯示 DPP 局限于礦化牙本質(zhì)層，通過礦化前沿的成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌[7]，具有特異性，它是牙本質(zhì)中含量最豐富的非膠原蛋白，占50%[9]，DPP 調(diào)控著羥基磷灰石晶體生成[10]，并直接參與控制牙本質(zhì)礦化。在牙根吸收過程中牙本質(zhì)細(xì)胞分泌DPP，并通過齦溝液滲透出來。

本研究通過 ELASA 定量分析一個加力周期齦溝液中DPP含量變化的規(guī)律，在相同的時間點通過HE染色檢測了牙根吸收的相對面積，通過相關(guān)與回歸分析根吸收相對面積和齦溝液中的DPP濃度，發(fā)現(xiàn)這兩變量之間是有聯(lián)系的。在根吸收發(fā)展早期，DPP濃度隨著根吸收面積的增加而呈現(xiàn)增多趨勢，DPP濃度在牙根繼續(xù)吸收但根吸收橫截面積不變時呈現(xiàn)出穩(wěn)定的狀態(tài)；DPP濃度在根吸收修復(fù)時又會增多；DPP濃度在根修復(fù)逐漸完成時降低至原有水平。這一結(jié)論與李文星等研究一致[11]。

而通過 TRAP 染色陽性檢測的破牙骨質(zhì)細(xì)胞數(shù)量機械力作用下，第 15d達(dá)到峰值之后便逐漸減少；加力 21d 后幾乎未見 TRAP 染色陽性細(xì)胞，此時根吸收面積明顯減少，牙根可能有修復(fù)現(xiàn)象。從這一現(xiàn)象中我們可以得出在機械力作用下，根吸收不會一直持續(xù)下去，而是逐漸達(dá)到一個穩(wěn)定狀態(tài)后會出現(xiàn)修復(fù)的情況，骨吸收陷窩中會出現(xiàn)新生骨，有時牙本質(zhì)深處的吸收陷窩也會被新生骨修復(fù)，其他學(xué)者研究結(jié)論中也有相似報道[12]。本研究也在15d后觀察到出現(xiàn)了修復(fù)性的牙本質(zhì)。

牙根吸收及修復(fù)是一個間斷的過程，我們以DPP作為根吸收的指標(biāo)，在時間的縱軸上尋找這種蛋白在齦溝液中含量的變化，并與組織學(xué)上牙根吸收的相對面積、牙根吸收的破骨細(xì)胞數(shù)相關(guān)聯(lián)。齦溝液中的DPP濃度與正畸根吸收的發(fā)生、發(fā)展、修復(fù)密切相關(guān)，DPP可以作為一種安全的生物分子，來動態(tài)的反應(yīng)正畸根吸收及修復(fù)。

表 4齦溝液中 DPP 濃度與牙根吸收相對面積線性回歸分析結(jié)果Table 4 Linear regression analysis of DPP concentration in gingival crevicular fluid and relative area of root resorption