蔡燕飛，萬愛妮，陳 蘊(yùn)，金 堅(jiān)

(江南大學(xué)藥學(xué)院藥物設(shè)計(jì)與分子藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122)

我國(guó)是肝病大國(guó)，肝硬化是主要死亡原因之一，肝纖維化是肝硬化的早期階段，兩者的病理發(fā)展過程類似，當(dāng)肝纖維化患者得不到良好治療時(shí)，纖維化程度以“滾雪球”的方式不斷惡化，最終發(fā)展為肝硬化，慢性肝損傷大多都發(fā)展到了肝硬化[1]。隨著對(duì)肝硬化病理及生理學(xué)廣泛而深入的研究，很多研究表明肝纖維化階段肝臟處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，肝纖維化在一定程度上是可逆的。因此，在早期肝病階段進(jìn)行及時(shí)、有效的治療，緩解肝臟壓力從而改善肝臟狀態(tài)，對(duì)各種肝臟疾病有重要意義。

近年來，肝纖維化的細(xì)胞因子治療成為研究熱點(diǎn)[2-4]，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是已知的最強(qiáng)促肝纖維化因子，是一個(gè)重要的纖維化治療靶標(biāo)[5-6]，應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βⅡ型受體胞外域(extracellular domain of transforming growth factor beta type II receptor,eTGFBR2)，能拮抗TGF-β1活性，發(fā)揮治療肝纖維化作用[6-7]。然而單體蛋白藥物在體內(nèi)代謝過程中易被腎小球過濾或被蛋白酶降解，具有較短的循環(huán)半衰期，臨床使用時(shí)必須高頻或大劑量給藥才能獲得一定療效，給肝纖維化病人帶來了很大的痛苦[8]。因此，開發(fā)半衰期長(zhǎng)、穩(wěn)定性好的抗肝纖維化藥物意義重大。

人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)為人體血液中含量最高的蛋白，在維持血液穩(wěn)定性方面有重要作用，體內(nèi)半衰期很長(zhǎng)并且生物相容性好，是理想型融合蛋白[9]。運(yùn)用融合蛋白技術(shù)開發(fā)高利用率、高穩(wěn)定性的抗肝纖維化藥物可行性較大。本課題組前期已利用融合蛋白技術(shù)開發(fā)設(shè)計(jì)了穩(wěn)定長(zhǎng)效重組蛋白HSA-eTGFBR2，通過CHO表達(dá)系統(tǒng)可獲得純度超過90%的融合蛋白，為進(jìn)一步研究體內(nèi)生物學(xué)活性做好了準(zhǔn)備[10-11]。

CCl4被廣泛應(yīng)用于肝纖維化、肝硬化動(dòng)物模型的構(gòu)建中[12]。水飛薊素是天然保肝藥，常作為抗肝纖維化研究的陽(yáng)性對(duì)照[13]。本研究構(gòu)建了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型，以水飛薊素為抗肝纖維化陽(yáng)性對(duì)照，通過病理組織學(xué)染色、肝功能檢測(cè)及肝纖維化標(biāo)志性蛋白的表達(dá)，探究了人血清白蛋白融合蛋白HSA-eTGFBR2的小鼠體內(nèi)抗肝纖維化效果，并與eTGFBR2單體進(jìn)行了藥效對(duì)比，以期找到半衰期長(zhǎng)、穩(wěn)定性更好的抗肝纖維化藥物。

1 材 料

1.1 試 劑

CCl4色譜純、藥用級(jí)玉米油(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；總膽紅素(TBIL)、透明質(zhì)酸(HA)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測(cè)試劑盒、蘇木精-伊紅(H-E)染液(南京建成生物工程研究所)；兔抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體(美國(guó)Proteintech group公司)；兔抗Ⅰ型膠原蛋白(COL I)抗體(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)；人eTGFBR2標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)R&D公司)。

1.2 儀 器

正置顯微鏡(德國(guó)徠卡公司)；蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)伯樂公司)；凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)；烤片機(jī)(常州國(guó)華電器有限公司)。

1.3 動(dòng) 物

BALB/c小鼠，雄性，體重(25±2)g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心(SPF級(jí)，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2012-0004)。將小鼠分籠(每籠5只)，按常規(guī)條件(室溫25 ℃，濕度55%，光照12 h/d)飼養(yǎng)，喂食普通飼料，自由攝取食物、飲水。飼養(yǎng)觀察1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方 法

2.1 動(dòng)物模型建立及給藥

研究表明，低濃度的TGFBR2(0.1 mg/kg)在每天給藥的情況下，具有良好的抗小鼠肝纖維化效果，據(jù)此選擇合適的給藥方式設(shè)定實(shí)驗(yàn)分組[14-15]。

BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組，每組6只，具體分組及給藥方式如表1所示，其中除了正常組和模型組，其他組均是在造模6周結(jié)束后再給藥。

Table1 Group list of the animal experiment

GroupDrugRoute of administration DosageTimeNormalCorn oilIntraperitoneal injection2 mL/kgTwo times a week,every Monday and Thursday,for eight weeksModel25% CCl4 in corn oilIntraperitoneal injection2 mL/kgTwo times a week,every Monday and Thursday,for six weeksPositive con-trolSilymarinIntragastric administra-tion100 mg/kgEvery day,for six weekseTGFBR2eTGFBR2Tail vein injection1.2 nmol/kgEvery day,for two weeksHSA-eTGF-BR2HSA-eTGFBR2Tail vein injection1.2 nmol/kgEvery three days,for two weeksHSAHSATail vein injection1.2 nmol/kgEvery three days,for two weeks

HSA:Human serum albumin

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各組小鼠于當(dāng)晚禁食不禁水12 h，次日稱重，腹腔注射8 mL/kg的4%水合氯醛麻醉，眼球取血，室溫靜置2 h，1 000 r/min離心15 min，收集血清于無菌EP管，保存在-80 ℃冰箱，用于后續(xù)肝功能檢測(cè)。

之后將小鼠處死，解剖取肝臟，觀察肝臟外形變化，稱重，拍照，用生理鹽水漂洗后，切取部分肝左葉，置于4%PFA中固定，用于后續(xù)石蠟包埋、切片、染色；切取另一份置于-80 ℃中保存，用于后續(xù)分子生物學(xué)檢測(cè)。

2.3 制備肝組織切片

取經(jīng)多聚甲醛溶液(4% PFA)固定的肝組織，依次經(jīng)75%，85%，95%，100%，100%梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋；將石蠟標(biāo)本用切片機(jī)做4 μmol/L切片，溫水展平，貼到載玻片上，用于后續(xù)染色。

2.4 肝組織切片的蘇木精-伊紅染色

將“2.3”項(xiàng)下制備的肝組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，具體操作步驟參見說明書。

2.5 血清肝功能指標(biāo)測(cè)定

應(yīng)用試劑盒檢測(cè)各組血清中的肝功能指標(biāo)AST、ALT、TBIL及ECM主要成分(HA)。

2.6 Western blot檢測(cè)肝組織中α-SMA和COL I的表達(dá)

從-80 ℃冰箱取出肝組織，液氮速凍，充分研磨，加入含PMSF的RIPA裂解液，每20 mg組織中加入裂解液200 μL，冰上裂解20 min，隨后12 000 r/min、4 ℃離心10 min，吸取上清液，分裝于0.5 mL EP管中，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定各組總蛋白濃度。

用PBS稀釋各組樣品至相同濃度，每組上樣量70 μg，通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組α-SMA和COL I的表達(dá)。

Western blot操作步驟：蛋白質(zhì)經(jīng)12% SDS-PAGE膠分離后，電轉(zhuǎn)移至NC膜上，電轉(zhuǎn)條件為：100 V，60 min。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗稀釋液(1∶1 000稀釋)，室溫孵育3 h，TBST洗滌3次，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗稀釋液(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色拍照。

3 結(jié)果與討論

3.1 一般情況觀察

正常組小鼠正常生長(zhǎng)，體重逐漸增加，毛色光澤，無死亡現(xiàn)象；模型組小鼠前期因CCl4毒性作用，體重下降、毛色暗淡、活動(dòng)減少、精神萎靡、攝食減少，病死率約15%，造模后期，體重有所回升，不再死亡。HSA組和CCl4停藥組小鼠生長(zhǎng)狀況與模型組相比改善不明顯。其余各加藥組小鼠在給藥后狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，攝食、活動(dòng)均增加，精神好轉(zhuǎn)，毛色恢復(fù)光澤，隨時(shí)間延長(zhǎng)，體重逐漸回升。

3.2 肝臟外觀及肝指數(shù)變化

正常組小鼠肝臟外觀呈鮮紅色，表明光滑，質(zhì)地柔軟，形態(tài)正常，模型組小鼠肝臟腫脹，顏色變淺，失去光澤，質(zhì)地粗糙，表面可見細(xì)顆粒；HSA組小鼠也出現(xiàn)肝臟腫大、質(zhì)地變硬、有顆粒狀表面現(xiàn)象，比模型組程度稍輕；其他藥物治療組小鼠肝臟腫脹減輕，顏色恢復(fù)紅色，表面光滑，細(xì)顆粒逐漸消失，質(zhì)地變軟(圖1)。

Figure1 Effects of HSA-eTGFBR2 on liver appearance of liver fibrosis mice

與正常組相比，模型組、HSA組小鼠肝重及肝臟指數(shù)均顯著升高(P<0.001)；陽(yáng)性組、融合蛋白HSA-eTGFBR2及其單體治療組的小鼠肝重及肝臟指數(shù)均下降，不同程度恢復(fù)至正常組水平，與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(見表2)。

GroupLiver weight/gLiver weight/weightNormal(n=6)1.301±0.073***0.056±0.006###Model(n=5)2.332±0.1050.096±0.004Positive control(n=5)1.355±0.043***0.052±0.004###eTGFBR2(n=6)1.651±0.117***0.062±0.009###HSA-eTGFBR2(n=5)1.689±0.094***0.062±0.007###HSA(n=5)2.311±0.0990.092±0.007

***P<0.001vsmodel group；###P<0.001vsmodel group

3.3 蘇木精-伊紅染色觀察肝組織結(jié)構(gòu)變化

各組肝組織切片的蘇木精-伊紅染色結(jié)果如圖2所示，正常組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞完整、排列整齊、條索明顯，胞漿豐富均勻，未見纖維組織增生；模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞普遍變性、壞死，呈空泡樣變，膠原纖維沉積，纖維組織增生擴(kuò)大；陽(yáng)性組組織結(jié)構(gòu)與正常組相似；HSA組與模型組相比，肝細(xì)胞壞死程度有所減輕，但仍可見肝細(xì)胞水腫、呈空泡樣，說明HSA蛋白也沒有明顯的抗肝纖維化效果。

HSA-eTGFBR2及其單體有穩(wěn)定肝組織結(jié)構(gòu)的效果，肝索界限較為清晰，肝細(xì)胞胞質(zhì)相對(duì)均勻，基本無空泡樣變，未見纖維組織沉積。結(jié)果表明，HSA-eTGFBR2融合蛋白可中和TGF-β1，拮抗其促肝細(xì)胞凋亡及肝纖維化作用，減輕肝纖維化癥狀，其治療效果與單體相當(dāng)。

Figure2 Effects of HSA-eTGFBR2 on the liver structure of liver fibrosis mice

3.4 各項(xiàng)肝功能指標(biāo)變化

肝臟是人體的解毒器官，血清中肝功酶活性的升高或蛋白質(zhì)水平的下降與肝損傷程度密切相關(guān)。血清中ALT活性與肝細(xì)胞損傷程度成正比，血清中AST活性隨肝細(xì)胞病變程度增加而增高。運(yùn)用試劑盒檢測(cè)血清樣本中ALT和AST的活性，結(jié)果如圖3所示，與正常組相比，模型組的AST和ALT活性明顯提高，提示CCl4促使細(xì)胞及其膜脂質(zhì)過氧化，而線粒體是膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)部位，線粒體損傷，產(chǎn)生一系列有毒的活性氧簇，導(dǎo)致肝細(xì)胞氧化損傷、壞死，釋放肝功酶至血液中。HSA組的兩種酶活性與模型組相比略有下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明HSA并不能改善肝功能，并無抗肝纖維化效果。eTGFBR2治療組和HSA-eTGFBR2治療組皆能下調(diào)AST和ALT水平，提示提示TGF-β1參與肝細(xì)胞損害，eTGFBR2或HSA-eTGFBR2拮抗其活性后，能明顯改善肝功能。

TBIL水平與肝實(shí)質(zhì)受損程度相關(guān)，TBIL會(huì)隨肝纖維化加重而顯著提高。各組TBIL測(cè)定結(jié)果(圖4)顯示，模型組TBIL濃度比正常組明顯升高，除HSA組與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其他加藥組皆明顯降低，幾乎接近正常組水平，結(jié)果表明CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞病變，使膽紅素不能正常轉(zhuǎn)化為膽汁，排泄受阻，血液中TBIL水平升高，eTGFBR2及其融合蛋白能遏制這一病變，改善膽紅素的代謝，降低TBIL水平。

肝纖維化時(shí)，血漿中透明質(zhì)酸(HA)含量升高。檢測(cè)結(jié)果顯示(圖5)，模型組的HA含量與正常組相比明顯增加，且具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明CCl4誘導(dǎo)肝纖維化形成。HSA組和對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化并無改善，而eTGFBR2及其融合蛋白皆使HA水平降低。

以上各項(xiàng)肝功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明，CCl4誘導(dǎo)肝纖維化形成，HSA組對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化并無改善，融合蛋白HSA-eTGFBR2及其單體均能下調(diào)各項(xiàng)肝功能指標(biāo)，使各項(xiàng)指標(biāo)趨于正常水平，低頻給藥的融合蛋白體現(xiàn)了與其單體相當(dāng)?shù)闹委熜Ч?/p>

3.5 Western blot檢測(cè)各組小鼠肝組織中α-SMA和COL I的表達(dá)水平變化

靜止的肝星狀細(xì)胞主要分布在肝竇周Disse間隙中，α-SMA也分布于Disse間隙及中央靜脈管壁。隨著肝纖維化發(fā)展，肝星狀細(xì)胞活化并向損傷部位遷移、增殖，α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞增多，表達(dá)上調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖6-A和6-B)，CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型組的α-SMA的蛋白表達(dá)水平皆高于正常組，兩融合蛋白HSA-eTGFBR2及其單體皆能降低α-SMA的水平，與陽(yáng)性組效果相當(dāng)，顯示出較好的抗肝纖維化效果。

自由基導(dǎo)致的細(xì)胞損傷是肝細(xì)胞毒性的主要機(jī)制，脂質(zhì)過氧化是CCl4致肝硬化的原因，隨后，氧化應(yīng)激引起脂質(zhì)過氧化、線粒體功能障礙，及ATP減少。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物能刺激膠原蛋白基因COL I表達(dá)及羥酰胺羥化酶活性，從而促進(jìn)纖維化形成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖6-C和6-D)，融合蛋白HSA-eTGFBR2及其單體皆能抑制COL I蛋白的表達(dá)，減少膠原沉積，從而抑制肝纖維化。該組實(shí)驗(yàn)同樣證明了，在降低給藥頻率的情況下，融合蛋白HSA-eTGFBR2依然能下調(diào)肝纖維化標(biāo)志物α-SMA和COL I蛋白的表達(dá)水平，其療效與單體藥物相當(dāng)，顯示出更加穩(wěn)定的抗肝纖維化效果。

4 小結(jié)與討論

本研究成功構(gòu)建了CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，融合蛋白HSA-eTGFBR2能明顯減輕肝細(xì)胞損傷及膠原沉積，促進(jìn)肝臟組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)，改善肝功能，降低肝纖維化標(biāo)志物α-SMA和COL I的表達(dá)水平，改善肝纖維化癥狀，其治療效果與單體藥物相當(dāng)。然而，在給藥過程中，在等摩爾濃度前提下，單體藥物需要每天給藥，而融合蛋白藥物只需3 d給藥1次即可達(dá)到同樣的藥效，表明融合蛋白在降低了注射頻率的情況下，體現(xiàn)了與單體藥物相當(dāng)?shù)闹委熜Ч?，提示融合蛋白質(zhì)藥物半衰期更長(zhǎng)、更穩(wěn)定，具有更優(yōu)的應(yīng)用前景。

***P<0.001vsmodel group

然而，HSA-eTGFBR2想要真正成為抗肝纖維化藥物依然任重道遠(yuǎn)，如：(1)該產(chǎn)品的肝特異性的、無肝細(xì)胞毒性、安全性等等均需要有進(jìn)一步的評(píng)估;(2)本研究使用的融合蛋白的表達(dá)系統(tǒng)為CHO表達(dá)系統(tǒng)，前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該表達(dá)系統(tǒng)制備的融合蛋白雖然活性高，但是其產(chǎn)量并不理想[7]，需要進(jìn)一步研究提高其轉(zhuǎn)錄水平及表達(dá)量，才能為后期的成藥打下基礎(chǔ);(3)雖然本研究建立的模型優(yōu)勢(shì)眾多，也能很好地反映藥物效果，然而跟人體肝纖維化依舊有所差別，可以考慮應(yīng)用大型動(dòng)物(如靈長(zhǎng)類)構(gòu)建肝纖維化模型，為融合蛋白的成藥性提供更有力的依據(jù);(4)本研究運(yùn)用細(xì)胞因子進(jìn)行抗肝纖維化評(píng)價(jià)，呈現(xiàn)出較好的體內(nèi)活性，在此基礎(chǔ)上，也可以參考該方法去評(píng)價(jià)具有抗纖維化潛力的其他因子，最終實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞因子聯(lián)合治療肝纖維化的目標(biāo)，為肝纖維化的治療及細(xì)胞因子的應(yīng)用提供借鑒。