王信 樊思桐 肖雪 陽琰 李琪 王哲 羅麗婭 朱玉玉

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000

糖尿病(diabetes mellitus，DM)常伴有多種并發(fā)癥，其中糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是糖尿病在骨骼系統(tǒng)中最嚴(yán)重的并發(fā)癥[1]。外周血單核細(xì)胞過氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARγ)是OP的遺傳易感基因之一[2]。PPARγ是細(xì)胞核受體超家族的一員，被激活后可增加胰島素敏感性、促進脂肪細(xì)胞分化，在胰島素抵抗、糖尿病、動脈粥樣硬化等代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療中扮演重要角色[3]。PPAR-γ mRNA的表達可抑制前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化及成熟[4]。骨保護素(osteoprotegerin，OPG)的主要作用是影響骨代謝，抑制破骨細(xì)胞分化、活化成熟及促進其凋亡[5]。維生素D (vitamin D，Vit D)與糖、骨代謝均有密切聯(lián)系，其主要功能是維持正常的血鈣磷水平，促進正常骨骼礦化[6]。25(OH)D是維生素D的活性代謝產(chǎn)物之一，為評估維生素D常用觀察指標(biāo)[7]。不同骨量狀態(tài)下2型糖尿病患者外周血中PPAR-γ mRNA表達與血清中25(OH)D、OPG的關(guān)系如何，目前國內(nèi)外未見相關(guān)研究報道。因此，本研究擬通過比較健康對照者與T2DM合并不同骨量患者外周血中PPAR-γ mRNA表達水平，旨在探討25(OH)D、 PPAR-γ mRNA調(diào)控糖、脂代謝及骨量的可能機制，可能為臨床早期聯(lián)合防治糖尿病、骨質(zhì)疏松提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2017年2月至2018年1月于我院骨科和內(nèi)分泌科住院的新確診2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者135例(絕經(jīng)1年以上的女性及年齡≥60歲的男性)，根據(jù)骨密度分為三組：T2DM骨量正常組(A組，45例)、T2DM骨量減少組(B組，45例)、T2DM骨質(zhì)疏松組(C組，45例)，收集同期我院體檢中心年齡、性別相匹配的健康體檢者作為正常對照組(NC組，45例)。健康體檢者均骨密度正常且經(jīng)口服葡萄糖耐量試驗證實糖耐量正常。T2DM患者均符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。取得所有受試者的知情同意并通過倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①絕經(jīng)1年以上女性及年齡≥60歲的男性，符合初診T2DM患者的標(biāo)準(zhǔn)；②無嚴(yán)重器質(zhì)性疾病及糖尿病急、慢性并發(fā)癥，肝腎功正常；③正常對照組無糖尿病及骨質(zhì)疏松等家族遺傳病史；④無煙酒史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往患有嚴(yán)重的心、肝、腎等臟器疾病及其他內(nèi)分泌疾病者；②近一個月內(nèi)使用過影響糖、脂、骨代謝的藥物；③受檢前2周有明確感染史；④患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺、性腺、骨腫瘤、垂體等影響骨代謝疾病及骨折者；⑤近半年內(nèi)曾使用影響骨代謝的藥物(性激素、雙膦酸鹽、糖皮質(zhì)激素、大劑量鈣劑等)，曾服用或注射過維生素D制劑的患者；⑥有吸煙史或長期大量飲酒史。

骨質(zhì)疏松癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，參照2017中華醫(yī)學(xué)會骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病分會的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診療指南診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。根據(jù) DXA 測量結(jié)果，骨密度值低于同性別、同種族健康成人的骨峰值 1 個標(biāo)準(zhǔn)差及以內(nèi)屬正常；降低1～2.5個標(biāo)準(zhǔn)差為骨量低下 (或低骨量)；降低等于和超過2.5個標(biāo)準(zhǔn)差為骨質(zhì)疏松；骨密度降低程度符合骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時伴有一處或多處脆性骨折為嚴(yán)重骨質(zhì)疏松。骨密度通常用T值(T-Score)表示，T值=(實測值-同種族同性別正值常青年人峰值骨密度)/同種族同性別正常青年人峰值骨密度的標(biāo)準(zhǔn)差?；贒XA 測量的中軸骨(腰椎1～4、股骨頸或全髖) 骨密度或橈骨遠(yuǎn)端 1/3骨密度對骨質(zhì)疏松癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)是T值≤-2.5。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料的收集：記錄各組受試人員年齡、性別，所有研究對象由專人測量身高、體重、臀圍、腰圍，計算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)=體重(kg)/身高2(m2)，均錄入數(shù)據(jù)庫。

1.2.2 一般血生化及糖代謝指標(biāo)的檢測：研究對象試驗前禁食12 h，禁飲8 h，抽取空腹靜脈血，靜置1 h后，3 000 r/min離心10 min分離血清，標(biāo)記后-80 ℃低溫冰箱保存。real time PCR檢測PPAR-γ mRNA的表達。采用電化學(xué)發(fā)光法(德國羅氏診斷配套試劑)測定空腹胰島素(fasting plasma insulin，F(xiàn)INS)、β-膠原降解產(chǎn)物(beta collagenous degradation products，β-CTX)、I-型膠原氨基端延長肽(type I-collagen amino end lengthening peptide，PINP)、25(OH)D；Olympus(AU2700)全自動分析儀檢測血脂；己糖激酶法(貝克曼庫特實驗系統(tǒng)有限公司)測定FPG；高壓液相色譜法測定HbA1c(美國伯樂D-10配套試劑)，計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5。

1.2.3 骨密度測定：采用法國MEDILINK公司生產(chǎn)的 Medix 90 DMS測定腰椎(L1～4) 正位、左右股骨近端包括股骨頸(neck)、大轉(zhuǎn)子(trochiter) 及 Ward三角區(qū)的骨密度(bone mineral density，BMD)，單位以g/cm2表示。

表1 各基因引物序列(熒光定量PCR測定)Table 1 Specific primers used for Real-time PCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料及臨床生化指標(biāo)的比較

各組間的年齡、病程、性別、BMI、Ward 三角區(qū)及全髖骨密度水平相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；A組與B組比較，25(OH)D、PINP、HDL-C水平明顯升高，而OPG、β-CTX、HbA1c、HOMA-IR明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)PG、LDL-C、TC、TG、FINS組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；A組與C組比較，25(OH)D、PINP、HDL-C水平明顯升高，而OPG、β-CTX、HbA1c、HOMA-IR明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而FPG、LDL-C、TC、TG、FINS組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；A組與NC組比較，OPG、FPG、HbA1c、HOMA-IR、LDL-C、TG、TC、β-CTX、FINS水平明顯升高，而25(OH)D、HDL-C、PINP明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；B組與C組比較，25(OH)D、PINP、HDL-C水平明顯升高，而OPG、β-CTX、HbA1c、HOMA-IR明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而FPG、LDL-C、TC、TG、FINS組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B組與NC組比較，OPG、FPG、HbA1c、HOMA-IR、LDL-C、TG、TC、β-CTX、FINS水平明顯升高，而25(OH)D、HDL-C、PINP明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；C組與NC組比較，OPG、FPG、HbA1c、HOMA-IR、LDL-C、TG、TC、β-CTX、FINS水平明顯升高，而25(OH)D、HDL-C、PINP明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1、圖2。

表2 各組一般資料及臨床生化指標(biāo)的比較Table 2 Comparison of general characteristics and biochemical indicators among the four groups

組別FIns(μIU/mL)NC9.16±1.73A11.41±2.25*B11.36±2.22*C11.35±2.19*

注： 與NC組相比,*P<0.05；與A組相比，#P<0.05；與B組相比，ΔP<0.05。

圖1 四組受試者血清25(OH)D水平的比較Fig.1 Comparison of serum levels of 25 (OH) D among the four groups

圖2 四組受試者血清OPG水平的比較Fig.2 Comparison of serum OPG levels in the four groups of subjects

2.2 Real time PCR 檢測PPAR-γ mRNA 的表達

A組與B組比較，外周血中PPAR-γ mRNA表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；A組與C組比較，外周血中PPAR-γ mRNA表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；A組與NC組比較，外周血中PPAR-γ mRNA表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；B組與C組比較，外周血中PPAR-γ mRNA表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；B組與NC組比較，外周血中PPAR-γ mRNA表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；C組與NC組比較，外周血中PPAR-γ mRNA表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 各組中PPAR-γmRNA 的表達Table 3 The expression of PPAR-γ mRNA

注： 與NC組相比,*P<0.05;與A組相比,#P<0.05;與B組相比,ΔP<0.05。

圖3 四組受試者外周血中PPAR-γmRNA表達水平的比較Fig.3 Comparison of expression levels of PPAR-γ mRNA in peripheral blood of the four groups of subjects

2.3 各組間骨密度比較

A組與B組比較，L1-4腰椎骨密度、左側(cè)股骨頸骨密度明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Ward 三角區(qū)及全髖骨密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；A組與C組比較，L1～4腰椎骨密度、左側(cè)股骨頸骨密度明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Ward三角區(qū)及全髖骨密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；A組與NC組比較，L1-4腰椎骨密度、左側(cè)股骨頸骨密度明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Ward 三角區(qū)及全髖骨密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B組與C組比較，L1-4腰椎骨密度、左側(cè)股骨頸骨密度明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Ward三角區(qū)及全髖骨密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B組與NC組比較，L1-4腰椎骨密度、左側(cè)股骨頸骨密度明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Ward三角區(qū)及全髖骨密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；C組與NC組比較，L1-4腰椎骨密度、左側(cè)股骨頸骨密度明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Ward三角區(qū)及全髖骨密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組間骨密度比較(g/cm2)

Table 4 Comparison of bone mineral density between groups(g/cm2)

組別L1～4腰椎左側(cè)股骨頸Ward三角區(qū)全髖NC1.30±0.181.01±0.110.70±0.140.74±0.12A1.14±0.14*0.93±0.10*0.63±0.12*0.79±0.21*B0.87±0.09*#0.77±0.09*#0.69±0.08*0.77±0.17*C0.66±0.05*#△0.52±0.07*#△0.65±0.09*0.78±0.20*

注： 與NC組相比,*P<0.05;與A組相比,#P<0.05;與B組相比,ΔP<0.05。

2.4 Pearson相關(guān)分析結(jié)果

外周血中PPAR-γ mRNA水平與年齡、FPG、TC、TG、LDL-C、FIns的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與25(OH)D、PINP、HDL-C呈負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r分別為-0.536、-0.366、-0.492，P<0.05)，見表2；與β-CTX、HbAlc、HOMA-IR、OPG表達呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r分別為0.392、0.482、0.501、0.428，P<0.05)，見表5。

表5 外周血PPAR-γ mRNA水平與臨床生化指標(biāo)的相關(guān)性分析(r)

Table 5 Correlative analysis of peripheral blood PPAR-γ mRNA level and clinical biochemical indexes (r)

項目PPAR-γ mRNArP值25(OH)D-0.5360.041PINP-0.3660.025HDL-C-0.4920.049OPG0.4280.026β-CTX0.3920.015HbAlc0.4820.038HOMA-IR0.5010.012

2.5 T2DM合并骨質(zhì)疏松危險因素的Logistic回歸分析

以T2DM患者是否合并骨質(zhì)疏松為因變量，以年齡、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、25(OH)D、PPAR-γ mRNA、PINP、β-CTX、HbAlc、HOMA-IR、OPG指標(biāo)作為自變量，納入四組行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，25(OH)D、PINP、HDL-C是T2DM患者合并骨質(zhì)疏松的獨立保護因素，PPAR-γ mRNA、β-CTX、HbAlc、OPG是T2DM患者合并骨質(zhì)疏松的獨立危險因素(見表6)。

表6 T2DM患者合并OP危險因素的Logistic回歸分析

Table 6 Logistic regression analysis of risk factors associated with OP in T2DM patients

變量回歸系數(shù)Wald χ2值P值OR(95% CI)HbA1c/%-7.05122.1470.0294.304(3.582,10.372)PPAR-γ mRNA6.3672.3520.0175.238(2.174,9.234)β-CTX/(μg/L)2.6256.3460.0453.134(2.018,5.134)OPG/(ng/L)3.4631.3420.0372.436(1.353,4.358)25(OH)D/(ng/mL)-1.1684.4670.0240.377(0.121,0.798)PINP/(μg/L)-0.2362.2230.0180.134(0.044,0.891)HDL-C/(mmol/L)-0.3533.4560.0460.662(0.002,0.934)

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下，骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病[9]。研究[10]發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松與糖尿病的關(guān)系密切。近年有研究[11-12]報道，PPAR-γ mRNA表達與糖尿病、OP密切相關(guān)，然而在不同骨量狀態(tài)下2型糖尿病患者外周血中表達如何，目前國內(nèi)外未見相關(guān)研究報道。因此，本研究擬通過比較健康對照者與T2DM合并不同骨量患者外周血中PPAR-γ mRNA表達水平，探討OPG、25(OH)D、PPAR-γ mRNA調(diào)控糖、脂代謝及骨量的可能機制。

PPARγ是細(xì)胞核受體超家族的一員，PPARγ可促進骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化[13]。本研究結(jié)果顯示，T2DM患者外周血PPAR-γ mRNA的表達比正常對照組顯著升高，并且隨著骨密度的變化，骨量正?！橇繙p少→骨質(zhì)疏松患者外周血PPAR-γ mRNA的表達逐漸增加。研究[14]表明，PPAR-γ mRNA的表達可促進骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞數(shù)目不斷增多、體積增大，使骨髓腔內(nèi)微環(huán)境發(fā)生改變，從而引起骨髓脂質(zhì)代謝紊亂，骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化減少，破骨細(xì)胞的形成及活化增多，成骨、破骨細(xì)胞偶聯(lián)失調(diào)，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。因此，高水平的PPAR-γ mRNA表達參與了骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，加快了骨質(zhì)疏松的進程。OPG的主要作用是影響骨代謝，抑制破骨細(xì)胞的發(fā)生分化、活化成熟及促進其凋亡[15]。研究發(fā)現(xiàn)，48～65歲女性的血清水平明顯升高，顯示絕經(jīng)女性體內(nèi)水平高于未絕經(jīng)女性，推測雌激素缺乏時破骨細(xì)胞功能活躍，骨吸收增加，骨量丟失加快，刺激機體代償性骨形成增加，血清OPG相應(yīng)增加[16]。且近年糖尿病研究[17]顯示，糖尿病患者血清中OPG水平顯著增高，然而具體機制尚未有統(tǒng)一定論。β-CTX、PINP是反應(yīng)骨轉(zhuǎn)化的常用生化指標(biāo)，分別代表骨吸收和骨形成[18]。此外，高血糖、低HDL-C、高血壓及內(nèi)皮損傷等因素均可影響 PPAR-γ mRNA表達[19]。本研究還發(fā)現(xiàn)，血漿中25(OH)D、PINP、HDL-C水平與外周血PPAR-γ mRNA的表達呈負(fù)相關(guān)，β-CTX、HbAlc、HOMA-IR、OPG與PPAR-γ mRNA表達呈正相關(guān)。隨著骨量的下降，血清中25(OH)D、PINP、HDL-C水平逐漸下降(NC組>A組>B組>C組)，而PPAR-γ mRNA、β-CTX、HbA1c、OPG水平逐漸升高(NC組

綜上所述，T2DM合并骨質(zhì)疏松患者往往合并脂代謝紊亂，并且隨著骨密度的減少，血清中25(OH)D水平逐漸降低，外周血中PPAR-γ mRNA的表達逐漸增加。提示血清中25(OH)D的降低，可能通過上調(diào)外周血中PPAR-γ mRNA表達，從而導(dǎo)致糖、脂、骨的代謝紊亂，參與糖尿病、骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展。因此，T2DM患者加強血糖控制的同時，關(guān)注血清25(OH)D及外周血PPAR-γ mRNA表達水平，可能對防治糖尿病、OP有一定的作用，但其具體機制有待進一步研究探索。