糖皮質激素影響間充質干細胞成骨分化的實驗研究

徐瑩 田野

1. 中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽 110004 2. 中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院脊柱關節(jié)骨科，遼寧 沈陽 110004

糖皮質激素(glucocorticoids,GCs)是目前許多慢性疾病和自身免疫性疾病治療的首選藥物，如類風濕性關節(jié)炎、結締組織病、炎性腸道疾病、慢性阻塞性肺炎和哮喘等。調查表明，全世界約有1%～2%的不同年齡段患者接受長期的GCs治療[1]。其副作用中，糖皮質激素誘發(fā)的骨質疏松(glucocorticoid induced osteoporosis,GIO)是繼發(fā)性骨質疏松的主要原因[2]。由此帶來的低應激性骨折，更是給患者帶來了巨大的痛苦和負擔。雖然GIO目前在臨床上已被廣泛認知，但目前干預措施主要為發(fā)病后鈣劑、磷酸鹽的補充和骨折后的手術治療，其發(fā)生發(fā)展具體機制仍不明確。

正常生理狀態(tài)下，成骨與骨吸收處于平衡中。骨質疏松是多種原因所導致的成骨受到抑制，骨吸收大于骨形成，進而產生骨代謝失衡所致[3-4]。在成骨過程中，骨祖細胞作為骨組織的干細胞，分化為成骨細胞，參與骨代謝穩(wěn)態(tài)的維持[5]。有研究[6]證實，在間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)分化成骨細胞的過程中，不僅對成骨細胞的數(shù)量進行補充，而且能通過細胞旁分泌的形式分泌內源性生長因子，進一步促進成骨。其分化過程是一個受到多種信號通路與細胞因子調控的復雜過程[7]。

在對MSCs成骨分化的調控中，Notch信號通路已被證實具有明顯的促進成骨分化作用[8]，但在GIO中，Notch信號通路的作用仍不明確。本研究通過GCs對MSCs成骨分化的影響入手，明確在GIO發(fā)生發(fā)展中MSCs的功能變化，并進一步驗證Notch信號通路在這種變化中的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人MSCs細胞系(Lonza Group 公司，美國)；MSCGM 培養(yǎng)基(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium，Lonza公司，瑞士)；JAG1重組蛋白 (EnzoLife Sciences公司，美國)， Alizarin Red 染色劑(北京索萊寶科技有限公司，中國)；anti-Hes1，anti-ALP，anti-Collagen1，(Santa Cruz公司，美國)；RNeasy 試劑盒(Qiagen公司，美國)；逆轉錄試劑盒(Invitrogen公司，美國)；Apo-ONE homogeneous Caspase-3/7分析試劑盒(Promeg Biosciences公司，美國)；SYBR Green(Applied Biosystems公司，美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組

將細胞以5 000 cell/mm2的密度接種于6孔培養(yǎng)皿的MSCGM培養(yǎng)液中，其內加入10%胎牛血清、1% 青霉素溶液、5 mmol/L的L-Glutamine，置于37 ℃、5% CO2，6% O2的飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)，至細胞70%～80%融合時，分別以生理鹽水(對照組)、地塞米松106mol/L(GCs處理組)、地塞米松106mol/L+JAG1(Notch信號通路配體激活，GCs+JAG1組)處理細胞。于孵育箱內共同培養(yǎng)48 h。

1.3 檢測指標

1.3.1 細胞凋亡分析：收取細胞，通過Apo-ONE homogeneous Caspase-3/7分析試劑盒，應用multi-mode microplate reader軟件，以530 nm來測量吸收率，分析細胞凋亡情況。

1.3.2 RNA提取和real-time PCR檢測：應用RNeasy試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，稀釋3倍后，取1 μL稀釋后的cDNA進行Real-timePCR反應。在95 ℃預變性15 min，同溫度下變性20 s，在58 ℃退火30 s，在72 ℃條件下延伸30 s，共計45個循環(huán)。于延伸階段檢測熒光產物，生成擴增曲線。在每個同次反應中，各組均設3個平行重復實驗。以β-actin 為內參基因，通過PCR儀RotorGene 分析軟件進行定量分析。特異性引物序列見表1。

表1 特異性引物序列Table 1 Specific primer sequence

1.3.3 Western blot 蛋白表達檢測：應用Goldenlysis buffer液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每泳道上樣40 μg。應用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。轉膜后應用5%的脫脂牛奶封閉，并與一抗4 ℃孵化過夜。一抗分別為anti-Hes1，anti-ALP，anti-Collagen1(1∶1 000，Santa Cruz.Cambridge, MA, USA)。次日PVDF膜在室溫下與二抗(中杉金橋，中國)孵化2 h。應用顯影液(賽默飛世爾科技，美國)使蛋白條帶顯影。使用Image Quant 5.0 軟件對蛋白條帶進行密度分析。通過應用β-actin作為內參來控制實驗誤差。

1.3.4 茜素紅染色：培養(yǎng)48 h后除去細胞培養(yǎng)液，蒸餾水清洗3次；10%中性甲醛4 ℃條件下固定細胞20 min；吸除甲醛，蒸餾水清洗3次；加入Alizarin Red染色劑，于室溫下染色30 min；吸除染色劑，蒸餾水清洗3次；加入乙醇脫水，室溫下自然干燥過夜。顯微鏡下觀察，照相。

1.4 統(tǒng)計學分析

全部計量數(shù)據以均數(shù)±標準差表示，并按照SNK法進行單因素方差分析(ANOVA)，各組間比較采用t檢驗；當P<0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。所有數(shù)據應用SPSS 17.0軟件進行分析。

2 結果

2.1 GCs處理對MSCs凋亡的影響。

在GCs處理后48 h，通過應用multi-mode microplate reader軟件，以530 nm波長吸收率計數(shù)Caspase-3/7陽性的細胞，計算凋亡細胞百分率。筆者發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，GCs處理組凋亡細胞百分率明顯增加[(80±5.789)vs 對照組(60±7.132)，P<0.05]；而GCs+JAG1組則部分減少了凋亡細胞百分率(72±2.169)，與GCs組相比，P<0.05；與對照組相比，P<0.05，見圖1。

圖1 GCs處理對MSCs凋亡的影響(與對照組比較,*P<0.05;與GCs組比較,&P<0.05)Fig.1 Effects of GCs on MSCs apoptosis(vs control group,*P<0.05; vs GCs group,&P<0.05)

2.2 GCs處理對MSCs中Notch信號通路表達的影響

通過對各組MSCs的Hes1mRNA的RT-PCR檢測，與對照組相比，GCs處理組Hes1mRNA明顯降低(P<0.05)，JAG1的給予逆轉了Hes1mRNA的下降(與GCs組相比，P<0.05；與對照組相比，P>0.05)；通過Western blot檢測Hes1蛋白表達，與RT-PCR結果一致(見圖2a，圖2b)。

圖2 GCs處理對MSCs中Notch信號通路的影響(與對照組相比,*P<0.05;與GCs組相比,&P<0.05;與對照組相比,#P>0.05)Fig.2 Effects of GCs on Notch signaling in MSCs (vs control group,*P<0.05; vs GCs group,&P<0.05; vs control group,#P>0.05)

2.3 GCs處理對MSCs成骨分化的影響

在對各組MSCs成骨相關的指標ALP、Collagen1的RT-PCR和Western blot檢測中，發(fā)現(xiàn)GCs處理組ALP、Collagen1的mRNA明顯降低，蛋白表達也同步下降，與對照組相比，P<0.05；在GCs+JAG1組，逆轉了上述下降(與GCs組相比，P<0.05；與對照組相比，P>0.05)，見圖3a～圖3c。在茜素紅染色的實驗中，與對照組相比，GCs處理組染色明顯減弱(P<0.05)，GCs+JAG1組染色強度得到明顯改善(與GCs組相比，P<0.05；與對照組相比，P>0.05)，見圖4。

圖3 GCs處理對MSCs成骨分化的影響(與對照組相比,*P<0.05;與GCs組相比,&P<0.05;與對照組相比,#P>0.05)Fig.3 Effects of GCs on MSCs osteogenic differentiation (vs control group,*P<0.05; vs GCs group,&P<0.05; vs control group,#P>0.05)

圖4 GCs處理對MSCs茜素紅染色的影響(與對照組相比,*P<0.05;與GCs組相比,&P<0.05;與對照組相比,#P>0.05)Fig.4 Effects of GCs on Alizarin staining in MSCs (vs control group,*P<0.05; vs GCs group,&P<0.05; vs control group,#P>0.05)

3 討論

糖皮質激素誘導的骨質疏松(GIO)是長期或大劑量應用GCs而產生的骨骼系統(tǒng)并發(fā)癥，是繼發(fā)性骨質疏松的主要原因[2,9]。已有研究[10]證實，骨質疏松發(fā)生的主要機制為骨代謝障礙，而GIO的具體發(fā)生發(fā)展機制目前仍不明確。本研究從GCs對成骨方面的影響入手，探討由此而產生的骨代謝失衡，及GIO的發(fā)病機制。

已有研究[6]證實，在骨代謝和骨重建的過程中，MSCs作為成骨細胞的重要來源，同時在骨組織局部通過細胞旁分泌方式釋放生長因子，促進成骨。在本實驗中， GCs對MSCs的成骨分化標志基因ALP和Collagen1的mRNA與蛋白水平表達，都具有明顯的抑制作用，而且增加了MSCs的凋亡，表明GCs對細胞成骨分化具有明顯的抑制作用。對于GCs體外應用濃度的選擇上，筆者選擇了106mmol/L的地塞米松，這是基于對前期研究和文獻的查閱[11]，相當于攝入5 mg/kg GCs(臨床常用的治療量)后的體內血藥濃度。

體內MSCs的成骨分化是一個由多種機制共同調節(jié)的復雜過程。Notch信號通路近年來被證實廣泛參與體內骨骼系統(tǒng)的成骨和血管生發(fā)過程，是MSCs成骨分化調控的重要機制。有研究[12]發(fā)現(xiàn)在Notch受體和配體突變的小鼠模型中，骨內發(fā)生異常的血管構建，骨生發(fā)減少，軟骨細胞異常，骨小梁減少和骨量缺失，已經發(fā)現(xiàn)，在JAG1涂層的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的MSCs中，細胞內ALP等成骨標志性基因表達顯著增強；當沉默Notch信號通路時，細胞內成骨相關基因表達減弱[13]。在本次實驗中，就GCs對MSCs中Notch信號通路的表達的影響進行了驗證，發(fā)現(xiàn)GCs對其具有明顯的抑制作用，這種抑制作用通過補充Notch信號通路配體JAG1而得到逆轉。并且，MSCs的成骨分化也因Notch信號系統(tǒng)的激活，得到一定程度的增強，提示Notch信號通路是GIO發(fā)生發(fā)展的潛在機制之一。

綜上所述，本研究證實GCs能夠增加MSCs的凋亡，并抑制其成骨分化，其機制與GCs抑制MSCs中的Notch信號通路表達有關。對MSCs中Notch信號通路的進一步研究將為GIO的干預治療提供新的靶點和思路。