阿司匹林對Ⅰ型成骨不全小鼠脂肪來源間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化的影響

劉碩 劉義 王建海 趙玉霞 李光

天津醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院遺傳學系，天津 300070

成骨不全癥(osteogenesis imperfecta，OI)又稱脆骨病，是一種少見的遺傳性骨骼發(fā)育障礙疾病。根據(jù)Sillence分型，OI可分為Ⅰ～Ⅳ四種類型，其中Ⅰ型成骨不全癥狀較輕，最為常見[1]。OI的臨床癥狀主要表現(xiàn)為骨質(zhì)脆弱、反復多發(fā)性骨折、骨畸形、藍鞏膜等。絕大多數(shù)OI患者(85%～90%)編碼Ⅰ型膠原蛋白α鏈的COL1A1或COL1A2基因發(fā)生突變，引起膠原合成不足或結(jié)構(gòu)異常，進而導致骨骼、皮膚、牙本質(zhì)、鞏膜等膠原豐富的結(jié)締組織發(fā)生病變[2]。另外，受膠原分泌減少所造成的微環(huán)境影響，OI患者的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)向成骨分化的能力降低，傾向于分化為脂肪細胞[3]。

阿司匹林(aspirin，Asp)，又名乙酰水楊酸，是一種廣泛使用的非甾體類抗炎藥，最初因解熱、鎮(zhèn)痛的功效被應(yīng)用于臨床。流行病學調(diào)查[4]發(fā)現(xiàn)，定期服用阿司匹林可提高絕經(jīng)后婦女的骨密度。近年的研究[5-6]表明，阿司匹林對MSCs的成骨分化有促進作用。但是，研究者[7-9]大多采用來源于野生基因型動物的MSCs，而阿司匹林對成骨不全來源的MSCs的成骨分化是否有同樣的促進作用，至今未見報道。

本研究利用實驗室建立的COL1A1缺失突變的Ⅰ型成骨不全小鼠(oim)，從其脂肪組織中分離得到脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCscol1a1+/-)，探討阿司匹林對ADSCscol1a1+/-增殖和成骨分化的影響及可能的作用機制，為阿司匹林用于成骨不全的治療奠定一定的理論及實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：選取6～8周齡、基因型為col1a1+/-的C57/BL6小鼠(oim)。

1.1.2 主要試劑：組織基因組DNA提取試劑盒(美國Biomiga公司)；α-MEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)；1×PBS 緩沖液(北京索萊寶公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；阿司匹林(上海阿拉丁公司)；地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉(美國Sigma公司)；青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL(美國Hyclone公司)；MTS試劑(美國Promega公司)；CD 29/44/45(美國eBioscience公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(德國Miltenyi公司)；堿性磷酸酶檢測試劑盒、堿性磷酸酶染色試劑盒(上海碧云天公司)；Trizol試劑(美國Life Technologies公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)；熒光定量PCR試劑盒(德國Qiagen公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠基因型鑒定：新生雄性小鼠2周齡時剪尾尖提取DNA，以鼠尾DNA為模板進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如表1所示。反應(yīng)條件為：預變性95 ℃，5 min；變性95 ℃，30 s；退火60 ℃，30 s；延伸72 ℃，45 s(35循環(huán))；延伸72 ℃，5 min。

表1 oim小鼠基因型鑒定的反應(yīng)體系

Table 1 Reaction system for genotypic identification of oim mice

反應(yīng)體系(25 μL)2×Rapid Taq Master Mix12.5 μL雙蒸水(ddH2O)9.5 μL上游引物1 μL下游引物1 μLDNA模板1 μL

1.2.2 ADSCscol1a1+/-的分離、培養(yǎng)：選取6～8周齡的oim雄性小鼠，采用頸椎脫臼法處死，并用75%乙醇浸泡消毒。無菌剪取小鼠腋下、腹股溝、背部等處的脂肪組織浸泡于α-MEM培養(yǎng)基中，將脂肪組織剪成細小碎塊后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，加入0.2%Ⅰ型膠原酶，37 ℃搖床上消化50 min后加1 mL胎牛血清。將細胞懸液用40 μm篩網(wǎng)過濾，離心后棄去上清，將細胞沉淀用含15%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基重懸，以1×106/cm2接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后換半液，5～7 d后細胞生長至80%時傳代。所有實驗均使用傳代培養(yǎng)至第3代的ADSCscol1a1+/-。

1.2.3 ADSCscol1a1+/-的鑒定：流式細胞熒光分選技術(shù)(FACS)檢測其表面間充質(zhì)干細胞相關(guān)Marker，包括CD 29、CD 44和CD 45；將ADSCscol1a1+/-以1× 105/孔接種到24孔板，分別用成骨和成脂誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)，14 d后成骨誘導組進行ALP染色，成脂誘導組進行油紅O染色。

1.2.4 MTS增殖實驗：將ADSCscol1a1+/-以1× 104/孔接種到96孔板，隔天換液，對照組加入150 μL含DMSO的α-MEM培養(yǎng)基，實驗組分別加入150 μL含0.5、1、1.5、2、5、10 mmol/L阿司匹林的α-MEM，每3天換液，培養(yǎng)5 d后每孔加入20 μL MTS，37 ℃孵育4 h，用酶標儀在490 nm波長下測定吸光度。

1.2.5 細胞凋亡檢測：將ADSCscol1a1+/-以3× 105/孔接種到6孔板，隔天換液，對照組加入含DMSO的α-MEM，實驗組加入含1.5 mmol /L阿司匹林的α-MEM。3 d后收集細胞，根據(jù)試劑盒說明書操作，標記Annexin V-FITC及PI抗體，F(xiàn)ACS檢測熒光強度。

1.2.6 ADSCscol1a1+/-的誘導分化：將ADSCscol1a1+/-分為3組，對照組加入含DMSO的培養(yǎng)基，單純成骨誘導組加入含DMSO的成骨誘導培養(yǎng)基，成骨誘導+阿司匹林組加入含1.5 mmol /L阿司匹林的成骨誘導培養(yǎng)基，每3天更換一次培養(yǎng)液。成骨誘導培養(yǎng)基的制備見表2。

表2 成骨誘導培養(yǎng)基的配制Table 2 Preparation of induction medium

1.2.7 堿性磷酸酶(ALP)染色及活性檢測：將ADSCscol1a1+/-以1× 105/孔接種到24孔板，分組培養(yǎng)，7 d后根據(jù)試劑盒說明書進行ALP染色；將ADSCscol1a1+/-以3×104/孔接種到12孔板，分組培養(yǎng)，7 d后收集上清，將上清進行5倍稀釋后按說明書步驟檢測ALP活性。

1.2.8 成骨相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測：將ADSCscol1a1+/-以3× 105/孔接種到6孔板，分組培養(yǎng), 14 d后收集細胞，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實時熒光定量PCR反應(yīng)(qPCR)測定成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，引物序列見表3。實驗以gapdh作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

表3 qPCR檢測目的基因引物序列Table 3 Primers of target genes detected by qPCR

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 Ⅰ型成骨不全小鼠的基因型鑒定

以鼠尾DNA為模板的PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后的結(jié)果(圖1)顯示，col1a1部分敲除小鼠(oim)的PCR擴增產(chǎn)物為533 bp；野生型小鼠(WT)的PCR擴增產(chǎn)物為1 623 bp。

圖1 PCR鑒定oim小鼠基因型2 000 M：2 000 bp DNA Ladder Marker；B：空白對照；WT：WT對照；oim：oim對照。Fig.1 Identification of genotypes of oim by PCR2 000 M：2 000 bp DNA Ladder Marker；B：Blank；WT：WT control；oim：oim control.

2.2 ADSCscol1a1+/-的培養(yǎng)及鑒定

ADSCscol1a1+/-的細胞形態(tài)如圖2 A所示，原代培養(yǎng)(P0)中，第3天換液時有大量圓形懸浮細胞，4～5 d貼壁細胞增多，可見散在集落式分布，5～7 d細胞呈梭形或不規(guī)則形，細胞體積增大，相鄰集落融合，鋪滿培養(yǎng)皿底80%以上即可進行傳代。傳代后細胞(圖2 A，P1)呈長梭形，后期呈漩渦式生長，增殖較快，3 d左右可傳代1次。流式鑒定結(jié)果(圖2B)顯示，培養(yǎng)至第3代的ADSCscol1a1+/-(圖2 A，P3)高表達間充質(zhì)干細胞相關(guān)Marker CD 29和CD 44，不表達白細胞Marker CD 45。經(jīng)成骨、成脂誘導培養(yǎng)基分別誘導后，ALP染色和油紅O染色結(jié)果(圖2C)顯示成骨、成脂誘導成功，證明分離得到的ADSCscol1a1+/-具有多向分化潛能，為典型的間充質(zhì)干細胞。

圖2 ADSCscol1a1+/-的培養(yǎng)及鑒定A：原代、第1代和第3代ADSCscol1a1+/-的培養(yǎng)觀察(10×)；B：ADSCscol1a1+/-的流式鑒定；C：ADSCscol1a1+/-的成骨、成脂分化潛能鑒定。Fig.2 Culture and identification of ADSCscol1a1+/-A:ADSCscol1a1+/-culture of P0, P1 and P3; B: FACS identification of ADSCscol1a1+/-; C: Osteogenesis and adipogenic differentiation identification of ADSCscol1a1+/-.

2.3 阿司匹林對ADSCscol1a1+/-增殖及凋亡的影響

將ADSCscol1a1+/-用含有不同濃度阿司匹林的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，MTS增殖實驗結(jié)果(圖3 A)表明，阿司匹林在低、中濃度(0～2 mmol/L)時可促進ADSCscol1a1+/-增殖，高濃度(5～10 mmol/L)時則抑制增殖，且在1.5 mmol/L時促進增殖的效果最佳(***P<0.001；*P<0.05)，因此，后續(xù)實驗均選擇1.5 mmol/L的濃度對細胞進行處理。流式分析阿司匹林處理5 d的ADSCscol1a1+/-的凋亡情況，與未處理的對照組相比，阿司匹林組的凋亡細胞所占比例明顯減少(圖3B，P<0.05)，顯示阿司匹林具有抑制ADSCscol1a1+/-凋亡的作用。

圖3 阿司匹林對ADSCscol1a1+/-增殖及凋亡的影響A：不同濃度阿司匹林處理后MTS增殖吸光度檢測柱狀圖(***P<0.001;*P<0.05)；B：1.5 mmol/L阿司匹林處理5 d后流式細胞儀檢測凋亡細胞所占比例(*P<0.05)。Fig.3 Effects of aspirin on the proliferation and apoptosis of ADSCscol1a1+/-A:MTS assay post different concentrations of aspirin treatment (***P<0.001;*P<0.05); B:Percentage of apoptotic cells detected by FACS after 5 days of 1.5 mmol/L aspirin treatment(*P<0.05).

2.4 阿司匹林對ADSCscol1a1+/-成骨分化的影響

將ADSCscol1a1+/-分組進行成骨誘導，7 d后ALP染色及活性測定結(jié)果(圖4 A)顯示，與對照組或單純成骨誘導組相比，成骨誘導+阿司匹林組的ALP染色深、活性顯著升高(P<0.001)。同時，利用qPCR對成骨相關(guān)因子的表達量進行分析，結(jié)果表明與單純成骨誘導組相比，阿司匹林處理組的Ⅰ型膠原蛋白和骨鈣蛋白的編碼基因col1a1和bglap以及成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子runx2和osterix的mRNA表達量均有明顯上調(diào)(圖4B，*P<0.05；**P<0.01)。以上結(jié)果表明，阿司匹林有促進ADSCscol1a1+/-向成骨方向分化的作用。

圖4 阿司匹林對ADSCscol1a1+/-成骨分化的影響A：ADSCscol1a1+/-分組成骨誘導后的ALP染色鑒定(10×)和ALP活性檢測(***P<0.001)；B：qPCR檢測ADSCscol1a1+/-分組成骨誘導后成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平(*P<0.05；**P<0.01)。Fig.4 Effect of aspirin on osteogenic differentiation of ADSCscol1a1+/-A:ALP staining and ALP activity detection of ADSCscol1a1+/-after osteogenic induction (***P<0.001); B:Transcription level of osteoblast-associated genes were detected by qPCR after osteogenic induction(*P<0.05；**P<0.01).

2.5 阿司匹林促進ADSCscol1a1+/-成骨分化的機制

Wnt信號通路和TGF-β信號通路是兩個經(jīng)典的成骨相關(guān)信號通路。qPCR檢測ADSCscol1a1+/-成骨誘導7 d后Wnt通路中關(guān)鍵因子β-catenin以及TGF-β通路中bmp2的mRNA表達量，結(jié)果顯示這兩個因子在成骨誘導+阿司匹林組中的表達顯著高于單純成骨誘導組(圖5 A、5B，*P<0.05；**P<0.01)。說明阿司匹林可能通過激活Wnt/β-catenin通路和BMP2介導的TGF-β通路來促進ADSCscol1a1+/-向成骨方向分化，但具體機制仍有待于深入研究。

圖5 阿司匹林對ADSCscol1a1+/-中β-catenin和bmp2轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.5 Effect of aspirin on transcriptional expression of β-catenin and bmp2 in ADSCscol1a1+/-

3 討論

目前，臨床上對OI的治療以外科手術(shù)為主，雙膦酸鹽、生長激素等藥物為輔，但這些治療無法從根本上改變患者的膠原合成缺陷。為此，研究者們致力于探討基因治療、干細胞治療等前景廣闊的療法[10-11]。OI患者的干細胞在治療過程中應(yīng)用的多為骨髓MSCs，但骨髓MSCs只占骨髓單核細胞的0.01%～0.1%，自骨髓中分離獲得的細胞數(shù)量有限，提取過程還會對人體骨骼造成傷害。相比之下，ADSCs具有與骨髓MSCs相似的分化潛能與低免疫原性，而且來源廣泛，只需少量脂肪組織即可獲得大量的干細胞，對人體損傷也較小，適宜自體或異體移植[12]。研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，OI患者及小鼠來源的MSCs成骨分化能力減弱，成脂分化能力增強，采用藥物促進其成骨分化，可對OI的治療產(chǎn)生積極影響。因此，尋找能夠促進MSCs成骨分化又安全有效的藥物意義重大，本實驗首次證實了阿司匹林對oim小鼠來源ADSCs的成骨分化具有促進作用。

近年來，阿司匹林在骨代謝和MSCs成骨分化方面的作用不斷被發(fā)現(xiàn)。Carbone等[15]的流行病學統(tǒng)計表明，服用阿司匹林的患者骨密度有顯著提高。Cao等[8]證明阿司匹林在體外能促進骨髓MSCs的增殖及成骨分化，并且可促進MSCs在迷你豬骨缺損處的骨生成作用；Liu等[9]的研究揭示阿司匹林作用于人脫落乳牙干細胞后可促進其成骨分化；Abd等[7]發(fā)現(xiàn)阿司匹林處理牙周膜干細胞后，其增殖能力有所提高且成骨分化增強。這些研究證實，阿司匹林具有促進MSCs成骨分化和加速骨組織修復的作用。

本實驗以oim小鼠來源的ADSCscol1a1+/-為研究對象，發(fā)現(xiàn)低、中濃度(0～2 mmol/L)的阿司匹林可促進細胞增殖。另外，阿司匹林處理5 d后凋亡細胞所占比例明顯下降，這可能是因為阿司匹林對腫瘤壞死因子(TNFα)有抑制作用[16]，從而抑制了ADSCscol1a1+/-的凋亡。ALP是成骨早期表達的標志性分子之一，ALP染色和活性檢測均表明，阿司匹林可增加ADSCscol1a1+/-的ALP表達量。qPCR結(jié)果顯示，成骨誘導+阿司匹林組的col1a1、bglap等成骨相關(guān)基因的表達水平有明顯上調(diào)。筆者的結(jié)果首次證明，阿司匹林對oim小鼠來源的ADSCs具有促進成骨分化的作用。

作為一種非選擇性的環(huán)氧合酶(cyclo- oxygenase，COX)抑制劑，阿司匹林與多種生物信號途徑相關(guān)[18-20]。Liu等[9]的研究顯示，阿司匹林是通過TERT/ Wnt/β-catenin通路促進脫落乳牙干細胞的成骨分化。 MSCs的成骨分化受到多種信號途徑的調(diào)控，除Wnt/β-catenin通路外，影響較大的還有TGF-β/BMPs信號通路[21-24]。筆者的qPCR結(jié)果表明，Wnt通路中的β-catenin和TGF-β通路中bmp2基因轉(zhuǎn)錄水平均有明顯上調(diào)。因此阿司匹林可能通過Wnt/β-catenin以及TGF-β這兩個經(jīng)典的成骨相關(guān)信號通路影響ADSCscol1a1+/-的成骨分化，但具體的機制還需要進一步研究[25-28]。

綜上，本研究首次發(fā)現(xiàn)阿司匹林可促進Ⅰ型成骨不全小鼠ADSCs的成骨分化，作用的途徑可能是Wnt/β-catenin和TGF-β信號通路，這為阿司匹林以及ADSCs應(yīng)用于成骨不全的治療奠定了一定的理論和實驗基礎(chǔ)。