周玲 許雄程 王松 何夢(mèng)嬌 羅嵐 陳玉玲 李艷芬* 駱凱*

1. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，福建 福州 350002 2. 福建省高校口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002 3. 福建醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究院，福建 福州 350002

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的一種全身性骨骼疾病[1]。更年期婦女由于體內(nèi)雌激素水平降低，易出現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMO)。PMO患者隨著體內(nèi)雌激素水平的降低，骨代謝平衡被打破，骨吸收大于骨形成，出現(xiàn)骨量減少和骨微觀結(jié)構(gòu)退化。患者常由于骨脆性增加，引起骨骼變形，導(dǎo)致骨折甚至死亡，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[2]。因此，PMO的預(yù)防及治療對(duì)提高更年期婦女的生活質(zhì)量具有重要的臨床意義。骨改建是由破骨細(xì)胞(osteoclasts，OC)、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞等多種細(xì)胞及細(xì)胞因子共同參與的過程[3]。巨噬細(xì)胞作為OC的前體細(xì)胞，在OC參與的骨吸收活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用[4]。巨噬細(xì)胞可通過分泌腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)α、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)6、IL-10等炎癥因子參與骨改建。當(dāng)前對(duì)PMO狀態(tài)下骨髓巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages, BMMs)生物學(xué)活性的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究擬通過體外分離培養(yǎng)PMO大鼠BMMs，探討去卵巢對(duì)大鼠BMMs生物學(xué)行為的影響，為深入研究PMO的發(fā)病機(jī)制與防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3月齡同批次SPF級(jí)健康雌性未孕Sprague-Dawley(SD)大鼠20只，體重250～300 g(由中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院提供)，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)準(zhǔn)則。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美國)；巨噬細(xì)胞集落刺激因子[macrophage colony stimulating factor,M-CSF(Pepro Tech，美國)]；鏈霉素、青霉素、紅細(xì)胞裂解液、DAPI(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；快速瑞氏-姬姆薩染液(南京建成科技有限公司)；CCK-8(Cell Counting Kit-8)(同仁化學(xué)研究所)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM(Takara，日本)；引物合成(上海生工工程股份有限公司);兔抗大鼠趨化因子受體7(CC-chemokine receptor 7, CCR7)單克隆抗體、兔抗大鼠甘露糖受體1(mannose receptor C-type 1, MRC1)單克隆抗體(Abcam，美國)。

HEAL FORCE 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；冷凍高速離心機(jī)(Heraeus，德國)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus，德國)；倒置熒光相差顯微鏡(Olympus，日本)；iMARK酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche LightCycler 480，德國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 去卵巢PMO大鼠模型的建立：20只SD大鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)麻醉，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各10只。參考課題組方法[5]，實(shí)驗(yàn)組即去卵巢(ovariectomy，OVX)組，在無菌操作下完整摘除大鼠雙側(cè)卵巢;對(duì)照組即假手術(shù)(sham-operated，Sham)組，在無菌操作下摘除卵巢附近大小相近的脂肪組織。術(shù)后根據(jù)組別分籠常規(guī)喂養(yǎng)。術(shù)后6周、12周記錄兩組大鼠的體重，術(shù)后12周取兩組大鼠子宮及股骨做病理切片HE染色，以明確大鼠PMO模型的建立。

1.3.2 大鼠BMMs的分離培養(yǎng)：術(shù)后12周經(jīng)腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)麻醉處死各組大鼠，參考文獻(xiàn)方法[6]于無菌操作下快速取出完整股骨及脛骨，去除附著的骨膜及筋肉，剪除兩端干骺端，用DMEM培養(yǎng)液從兩端交替沖洗骨髓腔并收集沖洗液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸。懸液經(jīng)細(xì)胞篩過濾后離心，加入適量紅細(xì)胞裂解液，重懸，靜置5 min。再次離心，重懸，PBS洗3遍。以含10%FBS、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg /mL及30 ng/mL M-CSF的DMEM完全培養(yǎng)液重懸，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每3天更換培養(yǎng)液，在倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。細(xì)胞生長達(dá)80%～90%融合時(shí)，以0.25%胰酶+0.1%EDTA消化細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 瑞氏-姬姆薩染色：分別將OVX組與Sham組大鼠BMMs以1×105個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用4%多聚甲醛于室溫下固定20 min，按照瑞氏-姬姆薩染液操作說明進(jìn)行染色，在倒置相差顯微鏡下觀察拍照。

1.3.4 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)：將OVX組與Sham組大鼠BMMs以3×103個(gè)/孔的密度種于96孔板，分別于接種后第3天和第5天采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。即取兩組細(xì)胞各6孔，根據(jù)CCK-8試劑盒操作說明，每孔加入200 μL新鮮配置CCK-8溶液，37 ℃孵育4 h后用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測(cè)定光密度值(optical density，OD)。

1.3.5 免疫熒光染色：將兩組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔分別接種于24孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，用4%多聚甲醛于室溫下固定20 min，加入0.1%Triton X-100通透細(xì)胞膜，PBS輕輕沖洗2次，每孔加入含BSA的PBS封閉30 min后分別加入兔抗大鼠CCR7及MRC1單克隆抗體，于室溫孵育2 h。經(jīng)PBS沖洗3遍，DAPI染色， 在倒置熒光相差顯微鏡下觀察并拍照，通過Image-Pro Plus 6.0軟件分析熒光表達(dá)強(qiáng)度。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：分別將生長狀態(tài)良好的OVX組及Sham組大鼠BMMs以2×105個(gè)/孔接種于12孔板，24 h后吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次，采用Trizol提取細(xì)胞的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照試劑盒說明書操作，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10及TGF-β的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Sequences of primers used for real-time PCR

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 24.0軟件兩樣本t檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠PMO模型的建立

實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠術(shù)后均存活，未見異常。術(shù)前兩組大鼠體重?zé)o明顯差異，術(shù)后兩組大鼠體重均有增加，OVX組大鼠術(shù)后6周、12周體重均明顯大于Sham組(P<0.001)，見圖1a。組織學(xué)染色結(jié)果顯示術(shù)后12周，Sham組大鼠的子宮腺腔擴(kuò)張、腺體豐富(圖1b)，股骨遠(yuǎn)端骨小梁排列較為整齊，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖1 d)；而OVX組大鼠的子宮體積縮小，腺腔閉合，腺體萎縮(圖1c)，股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨吸收明顯，骨小梁不連續(xù)且數(shù)目明顯減少，由于骨小梁變細(xì)使得骨髓腔面積變大(圖1e)。

圖1 大鼠PMO模型的建立 a：兩組大鼠手術(shù)前后體重比較；b：Sham組大鼠子宮HE染色；c：OVX組大鼠子宮HE染色；d：Sham組大鼠股骨HE染色; e：OVX組大鼠股骨HE染色；***P<0.001，標(biāo)尺400 μm。Fig.1 Establishment of rat osteoporosis model a: comparison of body weight before and after ovariectomy in two groups; b: the uterus hematoxylin-cosin(H&E) stain of Sham rats; c:the uterus H&E stain of OVX rats; d:the femur H&E stain of Sham rats; e:the femur H&E stain of OVX rats.***P<0.001, Bars 400 μm.

2.2 BMMs原代培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

去卵巢及假手術(shù)組大鼠BMMs原代培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下可見有巨噬細(xì)胞貼壁，細(xì)胞透亮，折光性佳。細(xì)胞膜完整，邊界清晰，可見少量偽足伸出，細(xì)胞核較大，呈圓形。培養(yǎng)6 d左右，細(xì)胞形態(tài)更為多樣，在倒置顯微鏡下可見呈長梭形、多角形、鵝卵石狀的巨噬細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。Sham組細(xì)胞的形態(tài)主要呈長梭形(圖2a、圖2b)；OVX組細(xì)胞的形態(tài)主要呈多角形(圖2c、圖2 d)。

圖2 大鼠BMMs原代培養(yǎng) a&b:Sham組；c&d:OVX組；標(biāo)尺50 μm。Fig.2 The morphological appearance of rat BMMs a&b: Sham group；c&d: OVX group. Bars 50 μm.

2.3 大鼠BMMs瑞氏-姬姆薩染色觀察

瑞氏-姬姆薩染色結(jié)果顯示大鼠BMMs呈長梭形、多角形及煎蛋樣。其中Sham組BMMs的形態(tài)主要為長梭形(圖3a、圖3b)；OVX組BMMs主要呈煎蛋樣及多角形(圖3c、圖3 d)。

圖3 大鼠BMMs瑞氏-姬姆薩染色 a&b:Sham組；c&d:OVX組; 標(biāo)尺50 μm。Fig.3 Wright-Giemsa staining of rat BMMs. a&b:Sham group；c&d: OVX group. Bars 50 um.

2.4 去卵巢對(duì)大鼠BMMs增殖能力的影響

CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞接種后3 d和5 d，OVX組大鼠BMMs的OD值均顯著高于Sham組(P<0.001)，提示大鼠去卵巢后隨著雌激素水平的降低BMMs的增殖能力相應(yīng)的增強(qiáng)(圖4)。

圖4 去卵巢對(duì)大鼠BMMs增殖的影響(***P<0.001)Fig.4 The effect of ovariectomy on proliferation of rat BMMs(***P<0.001)

2.5 去卵巢對(duì)大鼠BMMs極化的影響

免疫熒光染色結(jié)果可見，相較于Sham組，OVX組大鼠BMMs高表達(dá)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CCR7(圖5a、圖5b)，而M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物MRC1的熒光強(qiáng)度較低(圖6a、圖6b)。該結(jié)果提示PMO狀態(tài)下，BMMs更傾向于向M1型極化。

圖5 大鼠BMMs CCR7免疫熒光染色 a:CCR7免疫熒光染色；b:CCR7熒光強(qiáng)度定量分析.標(biāo)尺50 μm。Fig.5 Immunofluorescence staining of CCR7 in rat BMMs a:Immunofluorescence images of CCR7；b:Quantitative analysis of CCR7 fluorescence intensity. Bars 50 μm.

圖6 大鼠BMMs MRC1免疫熒光染色 a:MRC1免疫熒光染色；b:MRC1熒光強(qiáng)度定量分析.標(biāo)尺50 μm。Fig.6 Immunofluorescence staining of MRC1 in rat BMMs a:Immunofluorescence images of MRC1；b:Quantitative analysis of MRC1 fluorescence intensity. Bars 50 μm.

2.6 去卵巢對(duì)大鼠BMMs炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示體外培養(yǎng)24 h，OVX組大鼠BMMs的TNF-α及IL-6的表達(dá)水平顯著高于Sham組(圖7a、圖7b)；而IL-10及TGF-β的表達(dá)水平顯著低于Sham 組(圖7c、圖7 d)，該結(jié)果提示PMO大鼠BMMs高表達(dá)促炎因子，而抗炎因子的表達(dá)較低。

圖7 大鼠BMMs炎癥相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)(** P<0.01;***P<0.001)Fig.7 Inflammation-related gene expression of rat BMMs (** P<0.01;***P<0.001)

3 討論

當(dāng)前學(xué)者們常采用建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型來開展骨質(zhì)疏松的相關(guān)研究。成年雌性大鼠由于去卵巢后骨松質(zhì)的骨量減少，骨轉(zhuǎn)換率增高，與絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松代謝特點(diǎn)相似，因而常被用于構(gòu)建PMO模型進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[7]。本研究采用切除SD大鼠雙側(cè)卵巢建立PMO模型，術(shù)后12周可見OVX組大鼠體重較Sham組明顯增加；HE染色可見OVX組大鼠子宮體積縮小，腺體萎縮；股骨遠(yuǎn)端骨小梁變薄，數(shù)目減少。上述結(jié)果證實(shí)本研究成功建立PMO大鼠模型。

細(xì)胞增殖是評(píng)價(jià)細(xì)胞活性、代謝、生理和病理狀況的重要指標(biāo)。相較于MTT法而言，CCK8法操作簡(jiǎn)便，可最大限度的減少實(shí)驗(yàn)誤差[8]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇CCK8法檢測(cè)PMO大鼠BMMs的增殖能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)OVX組BMMs的增殖水平始終高于Sham組。課題組前期研究[9]也發(fā)現(xiàn)PMO大鼠頜骨成骨細(xì)胞的增殖能力較強(qiáng)。Gao等[10]研究報(bào)道去卵巢大鼠的骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖能力高于正常大鼠。結(jié)合上述研究結(jié)果，筆者推測(cè)PMO大鼠BMMs增殖能力的提高可能是由于PMO狀態(tài)下機(jī)體處于高代謝水平。

OP是由于骨吸收大于骨形成而導(dǎo)致骨重建失衡的慢性骨破壞性疾病，OP形成過程涉及OC、成骨細(xì)胞等以及細(xì)胞因子的共同參與[1]。OC由單核巨噬細(xì)胞分化而來，是高度分化的多核巨細(xì)胞，可直接參與骨吸收。巨噬細(xì)胞作為OC的前體細(xì)胞，表面含有核因子κB 受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)，可經(jīng)由M-CSF和核因子κB 受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)誘導(dǎo)形成OC參與骨吸收[4]。目前學(xué)者們普遍認(rèn)為巨噬細(xì)胞在局部微環(huán)境中主要分為經(jīng)典型(M1)巨噬細(xì)胞和非經(jīng)典型(M2)巨噬細(xì)胞[11]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)或干擾素(interferon，INF)γ可通過信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducers and activators of transcription 1, STAT1)途徑激活單核細(xì)胞，使其形成經(jīng)典的M1型巨噬細(xì)胞；IL-13或IL-4則通過STAT6途徑，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞成為非經(jīng)典的M2型[12]。M1型巨噬細(xì)胞主要發(fā)揮促炎、抗菌及呈遞抗原的功能，M2型巨噬細(xì)胞主要起抑制炎癥和組織修復(fù)的作用[13]。M1和M2型巨噬細(xì)胞形態(tài)差異較大，M1型巨噬細(xì)胞可伸出偽足，呈多角形及煎蛋樣；M2型巨噬細(xì)胞主要呈長梭形[14]。本實(shí)驗(yàn)通過倒置相差顯微鏡對(duì)體外培養(yǎng)大鼠原代BMMs的形態(tài)進(jìn)行觀察并進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OVX組大鼠BMMs主要呈煎蛋樣及多角形，Sham組大鼠BMMs主要呈長梭形。BMMs形態(tài)的變化提示PMO狀態(tài)下大鼠BMMs更趨向于向M1型極化。

M1和M2型巨噬細(xì)胞存在不同的表面標(biāo)志物。M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物主要為CCR7、CD86及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)，可分泌TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子防御病原體，提供抗原和啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的功能；M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物主要為MRC1和CD163，可分泌IL-10、TGF-β、Arg1等抗炎因子，下調(diào)免疫應(yīng)答，抑制和調(diào)節(jié)免疫炎癥[15-16]。Wang 等[17]發(fā)現(xiàn)胰高血糖素樣肽-4可通過降低巨噬細(xì)胞M1/M2的比例，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為M2型，進(jìn)而分泌TGF-β1以促進(jìn)骨生成。本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光染色對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠BMMs表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示與Sham組相比，OVX組大鼠BMMs的CCR7表達(dá)量較高而MRC1的表達(dá)量較低，該結(jié)果提示大鼠去卵巢后隨著體內(nèi)雌激素水平的下降，BMMs多表現(xiàn)為M1型。

TNF-α是一種重要的促炎因子，在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答、凋亡等過程中發(fā)揮作用。IL-6 是一種多功能的細(xì)胞因子，可在機(jī)體應(yīng)答感染時(shí)產(chǎn)生，參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)過程。報(bào)道證實(shí)單核細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-6可促進(jìn)RANKL的產(chǎn)生并提高RANKL的活性，進(jìn)而促進(jìn)骨吸收[18]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)患有PMO的婦女使用選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑雷洛昔芬(Raloxifene，RAL)治療后，血清中TNF-α、IL-6 的水平降低，骨密度增加。表明TNF-α、IL-6在參與RAL對(duì)OC的生成及骨吸收過程中起重要作用[19]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[20]也證實(shí)，隨著大鼠體內(nèi)雌激素水平的降低，TNF-α、IL-6 等炎癥因子的水平可顯著上升，刺激并提高OC活性，最終導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)骨質(zhì)疏松。

IL-10是一種有效的抗炎因子，可下調(diào)IL-1、TNF-α和IL-6等促炎因子水平，抑制免疫炎癥反應(yīng)[21]。TGF-β1是免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖、分化，在骨骼組織的發(fā)展和維持中起著關(guān)鍵作用[22]。IL-10可通過降低巨噬細(xì)胞中活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor-activated T cell 1, NFATc1)的表達(dá)進(jìn)而抑制RANKL誘導(dǎo)的OC生成[23]。調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs) 分泌的IL-10及TGF-β可參與雌二醇對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)，抑制OC的分化及骨吸收[24]。Shin等[25]發(fā)現(xiàn)4-1BB和4-1BB配體的相互作用可通過調(diào)節(jié)IL-10的分泌而影響破骨細(xì)胞的形成。降低IL-10的水平可增強(qiáng)BMMs向OC的分化能力。本研究采用熒光定量PCR在mRNA水平比較OVX組與SHAM組大鼠BMMs 炎癥相關(guān)因子TNF-a、IL-6及IL-10、TGF-β的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠BMMs 在基因水平高表達(dá)TNF-α及IL-6，而IL-10和TFG-β的表達(dá)則顯著低于Sham組。結(jié)合巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果，筆者推測(cè)PMO狀態(tài)下BMMs處于炎癥狀態(tài)，更傾向于向M1型方向極化，更容易分化形成OC。

綜上所述，本研究通過體外培養(yǎng)PMO大鼠BMMs，發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠隨著雌激素水平的下降BMMs處于炎癥狀態(tài)，高表達(dá)M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CCR7和促炎因子TNF-α及IL-6；而巨噬細(xì)胞M2型表面標(biāo)志物MRC1及抗炎因子IL-10和TGF-β的表達(dá)降低，提示OP狀態(tài)下BMMs更傾向于向M1型極化。上述研究結(jié)果將為探討B(tài)MMs在PMO發(fā)病過程中的作用以及通過調(diào)控BMMs防治PMO提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究?jī)H通過動(dòng)物模型初步探討了PMO狀態(tài)下大鼠BMMs的增殖能力、細(xì)胞極化表面標(biāo)志物以及炎癥相關(guān)因子的表達(dá)水平，對(duì)于PMO狀態(tài)下BMMs的破骨分化能力還有待進(jìn)一步深入研究。