三種不同他汀類藥物對去卵巢誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響

龔海虹 林志航 林志強

福建省泉州市第一醫(yī)院藥劑科，福建 泉州 362000

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的健康問題，其特征在于低骨量和骨結(jié)構(gòu)退變，導(dǎo)致骨脆性增加和易于發(fā)生骨折[1]。女性比男性更容易發(fā)生骨質(zhì)疏松癥。與絕經(jīng)前女性相比，絕經(jīng)后的女性更易患上這種系統(tǒng)性骨骼疾病，并伴有更高的并發(fā)骨折的風(fēng)險[2]。具有降脂作用的他汀類藥物經(jīng)常用于心血管疾病，有研究[3-4]表明它們可以增強骨祖細胞向成骨細胞分化，下調(diào)成骨細胞的凋亡，并上調(diào)骨形成蛋白-2(BMP-2)的表達，有助于骨再生。進一步研究[5]發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可以通過促進骨形成和抑制骨重吸收雙重作用模式來促進成骨。阿托伐他汀、辛伐他汀和洛伐他汀是最常見的他汀類藥物，多數(shù)研究[6-7]評估了他汀類藥物對骨密度的有益作用，但是三種藥物誰的效果更佳，目前尚未有研究報道。本研究將全面比較阿托伐他汀、辛伐他汀和洛伐他汀對去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和實驗設(shè)計

30只12周齡成年雌性Sprague-Dawley大鼠(220～250 g/只)用于本研究。在整個實驗期間，動物可隨意獲得標準飼料顆粒和水。通過肌內(nèi)注射(50 mg / kg)鹽酸氯胺酮(10%氯胺酮，Alfasan Co.，Woerden，荷蘭)進行去卵巢手術(shù)(OVX，n=25)和假手術(shù)(Sham，n=5)。剃去雙側(cè)背部區(qū)域的毛發(fā)后，借助直手術(shù)鑷子通過2 mm切口暴露卵巢。行血管結(jié)扎后，用手術(shù)剪將卵巢切除，并將其他暴露的組織重新放回原來位置。使用3.0絲線以常規(guī)方式縫合肌肉和皮膚的切口。通過皮下注射美洛昔康和頭孢唑林鈉(劑量1 mg/kg，每天1次)進行術(shù)后鎮(zhèn)痛和抗感染治療。在手術(shù)后12周，來自正常大鼠和去卵巢組的各5只動物被安樂死，并對它們的骨組織進行雙能X線檢測以確定骨質(zhì)疏松癥的形成。隨后將剩下的大鼠分為四組即對照組(CON)、阿托伐他汀組(ATR)、辛伐他汀組(SIM)和洛伐他汀組(LOV)；分別給予生理鹽水、阿托伐他汀 [25 mg(kg·d)]、辛伐他汀[25 mg(kg·d)]和洛伐他汀[25 mg(kg·d)]治療2個月，每組5只動物。治療2個月后，在過量的異氟烷下處死大鼠，通過腹主動脈取血，離心獲取血清及股骨進行檢測。

1.2 Micro-CT檢測

使用Scanco μCT 35掃描儀(Scanco，Wangen-Brütti-sellen，瑞士)，在掃描參數(shù)設(shè)定為電壓70 kv，電流114μA下獲取左側(cè)股骨的微型計算機斷層掃描圖(Micro-CT)，持續(xù)800 ms。通過顯微Micro-CT(每個切片的厚度=6 μm，體素大小=10 μm)評估遠側(cè)生長板下方1 mm處選擇的3 mm厚的感興趣的體積(VOI)。根據(jù)顯微CT掃描結(jié)果評估骨體積分數(shù)(bone volume ratio, BV/TV)、骨密度(bone mineral density, BMD)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)。

1.3 血液生化分析

通過腹主動脈取血，離心獲取血清進行生化指標分析，包括堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素、C端端肽 I型膠原(CTX)、OPG和RANKL。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(北京北方生物技術(shù)公司，北京，中國)測定血清ALP、骨鈣素、CTX、OPG和RANKL濃度。

1.4 生物力學(xué)評估

Micro-CT 掃描后將樣本取右側(cè)股骨，將其置于MTS-858型生物力學(xué)實驗機上，支點跨距17 mm，中點為加壓點，加載速度為 2 mm/min，計算機記錄載荷-位移曲線，從載荷-變形曲線計算極限載荷(N)，能量(J)和剛度(N / mm)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 去卵巢手術(shù)對大鼠骨密度影響

來自Sham和OVX組的大鼠股骨干骺端的BMD為(231.12±30.32)mg/cm2和(182.23±27.98)mg/cm2。在定量分析中，來自Sham組的大鼠股骨干骺端的BMD比OVX大鼠的高28.7%。這些數(shù)據(jù)證實實驗中OVX大鼠骨質(zhì)疏松癥模型的建立是成功的。

2.2 Micro-CT檢測結(jié)果

治療2個月后大鼠的股骨Mciro-CT掃描結(jié)果如圖1 A所示，微觀參數(shù)如圖1B～圖1F所示。與CON組相比，LOV、ATR和SIM組的股骨遠端骨量和小梁厚度明顯增加(P<0.05)；而CON組的小梁間距增加(P<0.05)，但在LOV、ATR和SIM組中均降低(P<0.05)。骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)顯示，SIM對去卵巢大鼠股骨骨量和骨密度保護作用效果最佳。

2.3 各種治療方案對去卵巢大鼠血清骨鈣素、CTX、OPG和RANKL的影響

各種治療方案對去卵巢大鼠血清骨鈣素、CTX、OPG和RANKL的影響如表1所示，與CON組比較，LOV、ATR、SIM組的骨鈣蛋白、CTX和RANKL被觀察到顯著增加(P<0.05);觀察到LOV、ATR、SIM組OPG和OPG/RANKL比值與CON組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);SIM組的OPG和OPG/RANKL比值明顯高于LOV、ATR、CON組(P<0.05)。

圖1 治療2個月后大鼠股骨干骺端Micro-CT掃描結(jié)果和微觀參數(shù)Fig.1 Micro-CT scans and microscopic parameters of femoral metaphysis of rats after 2 months of treatment

組別骨鈣素/(ng/mL)CTX/(ng/mL)OPG/(ng/mL)RANKL/(ng/mL)OPG/RANKLCON1765±3.4528.47±4.352.95±0.171.96±0.181.03±0.54LOV15.43±2.3*24.45±3.46*3.38±0.57*1.45±0.11*2.72±0.23*ATR13.22±2.64*#23.21±2.45*#4.45±0.17*#1.35±0.08*#3.48±0.33*#SIM11.43±1.94*#&20.34±2.94*#&5.16±0.34*#&1.18±0.04*#&4.87±0.34*#&

注：與CON組比較，*P<0.05；與LOV組比較，#P<0.05；與ATR組比較，&P<0.05。

2.4 生物力學(xué)性能

通過生物力學(xué)測試獲得的數(shù)據(jù)見圖2。SIM組具有最高的極限載荷、能量和剛度，與CON、LOV和ATR組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 不同治療方案對四組大鼠股骨生物力學(xué)的影響 A：極限載荷; B:能量; C:剛度Fig.2 Effects of different treatment regimens on femur biomechanics of rats in the four groups

3 討論

骨質(zhì)疏松癥被認為是老年人群最常見的疾病之一，必須考慮對這種疾病進行有效的治療。心血管疾病也被認為是與年齡密切相關(guān)的疾病，可能與骨質(zhì)疏松癥有共同的生物學(xué)途徑[8]。他汀類藥物被廣泛用于預(yù)防心血管疾病并具有其他治療作用，包括對骨骼有積極的生物學(xué)作用[9]。去卵巢大鼠已被證實[10]是模擬絕經(jīng)后人骨組織臨床情況的最佳模型之一。在筆者的研究中，OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥模型通過卵巢切除后3個月的骨密度檢測得到證實。

關(guān)于他汀類藥物在骨愈合應(yīng)用中的許多問題，如最有效的他汀類藥物、有益濃度和潛在的副作用仍未得到解答[11]。在此次研究中，筆者比較分析了阿托伐他汀、辛伐他汀和洛伐他汀這三種最常用的他汀類藥物治療骨質(zhì)疏松癥的效果。研究結(jié)果表明，和其他兩種他汀類藥物相比，辛伐他汀可以更好的提高大鼠股骨骨密度，增加股骨的生物力學(xué)性能。此外，辛伐他汀比阿托伐他汀和洛伐他汀明顯提高了成骨標志的表達。辛伐他汀和洛伐他汀的應(yīng)用導(dǎo)致血清CTX水平降低，表明這些治療方案在改善骨質(zhì)疏松癥方面的效率。

2001年的一項調(diào)查[12]表明，他汀類藥物可以以劑量依賴性方式影響骨轉(zhuǎn)換。該調(diào)查介紹了一種關(guān)于他汀類藥物對骨轉(zhuǎn)換有效性的新觀點，表明了低劑量他汀類藥物可以通過增加破骨細胞的活性而導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換為吸收。另一方面，這些藥物的高劑量同樣可以增加骨形成和再吸收，而BMD的凈變化很小[12]。因此，在這項研究中，筆者使用高劑量的親脂性他汀類藥物來預(yù)防OVX動物的骨質(zhì)疏松癥。關(guān)于藥代動力學(xué)，考慮到嚙齒類動物的代謝進程比人類快8～10倍[13]，以前的文獻認為10 mg / (kg·d)劑量的他汀類藥物作用于大鼠,相當于人類使用劑量為70 mg /d。根據(jù)先前體內(nèi)研究中報道的高于臨床應(yīng)用中的常規(guī)劑量的有益作用，選擇20～25 mg/(kg·d)的他汀類藥物(相當于人140 mg/d)作為大鼠的治療劑量，應(yīng)在未來的臨床試驗中針對人類患者的劑量進行調(diào)整。

與其它組相比，組織形態(tài)計量學(xué)和顯微CT掃描分析顯示辛伐他汀組的骨顯微結(jié)構(gòu)和骨量顯著改善；而阿托伐他汀組改善不明顯。以前的文獻[14]表明，阿托伐他汀導(dǎo)致骨重塑減少，可導(dǎo)致各種標志物如骨保護素(OPN)、BMP-2和膠原蛋白1型的明顯減少。與正常骨組織相比，阿托伐他汀治療骨中膠原1型表達水平較低[14]。相反，阿托伐他汀會導(dǎo)致健康或血脂異常[15]大鼠脛骨近端BMP-2的高表達。雖然此項研究中Micro-CT檢測結(jié)果顯示應(yīng)用辛伐他汀和洛伐他汀后與對照組比較骨質(zhì)疏松癥改善更為明顯，但與經(jīng)過洛伐他汀治療的動物相比，這種改善在辛伐他汀治療的動物身上表現(xiàn)的更多。以往的研究[16]表明，洛伐他汀與其他生物活性分子的組合可以通過協(xié)同有益作用顯著改善BMD。在關(guān)于OVX大鼠骨折部位骨愈合的研究中發(fā)現(xiàn)，單次劑量的洛伐他汀可以提高骨痂強度；而向洛伐他汀添加生育三烯酚不僅可以提高生物力學(xué)性能，還可以增強愈合組織的礦化作用[17]。

總的來說，筆者的研究結(jié)果表明，辛伐他汀和洛伐他汀與阿托伐他汀治療相比，改善OVX大鼠骨密度更為明顯。 此外，基于對成骨標志物的評估，辛伐他汀可以積極促進骨形成。 總體而言，與其他治療方案相比，辛伐他汀顯示出對改善OVX大鼠骨質(zhì)疏松癥的最佳治療效果。