計紅芳，李莎莎，張令文，王雪菲，陳復(fù)生，馬漢軍*

1(河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng),453003) 2(河南工業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程博士后流動站，河南 鄭州,450001)

牛肉營養(yǎng)豐富、味道鮮美，具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇的特點，富含多種礦質(zhì)元素，氨基酸組成比例更接近人體需要，能提高機體抗病能力，深受消費者喜愛[1-2]。目前，對牛肉凝膠制品的研究多集中在超高壓、超聲波、微波、加熱方式等工藝改進[3-5]，以及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase,TG酶)、多糖、淀粉、磷酸鹽等改良劑的添加[6-7]，不僅可以促進凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，使凝膠結(jié)構(gòu)致密有序，提高其質(zhì)構(gòu)特性、保水保油性與出品率，而且還可以增加凝膠制品的營養(yǎng)與保健功能等。靳紅果等[8]優(yōu)化了牛肉鹽溶蛋白提取工藝，在此條件下，凝膠保水性最高，破斷應(yīng)力最大，表觀彈性率較高，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密均勻。周佺等[9]研究發(fā)現(xiàn)，仙草提取物主要通過疏水相互作用來改善牛肉鹽溶蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。DONG等[10]研究表明，與超高壓和TG酶單獨處理效果相比，二者結(jié)合處理能顯著提高牛肉凝膠硬度、咀嚼性和凝膠強度。

豌豆蛋白占豌豆組成的20%～25%，氨基酸比例均衡，富含賴氨酸，除甲硫氨酸含量較低外，其他均達到FAO/WHO的推薦標準[11]，與大豆蛋白相比，豌豆蛋白沒有經(jīng)過轉(zhuǎn)基因[12]，同時不含雌性激素，過敏源少，且易于消化，可降低肥胖、動脈粥樣硬化、腫瘤等發(fā)病風(fēng)險[13-14]；豌豆蛋白具有較好的功能性質(zhì)，如溶解性、乳化性和膠凝性等，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源。相關(guān)研究主要涉及豌豆蛋白提取制備[15-16]、功能特性及改性[17-19]和酶解制備活性產(chǎn)物[20]，以及在肉乳制品、水產(chǎn)品、面制品、焙烤制品等領(lǐng)域的應(yīng)用[21-22]。白一凡與楊震等研究發(fā)現(xiàn)，豌豆蛋白添加量在4%及以下時，可改善香腸的品質(zhì)，如顏色、質(zhì)構(gòu)和感官品質(zhì)等[23-24]。SU等[25]研究表明，添加豌豆蛋白的法蘭克福香腸具有更好的熱穩(wěn)定性和更大的剪切硬度。因此，將來源廣泛、價格低廉的豌豆蛋白添加到牛肉鹽溶蛋白，研究其對牛肉鹽溶蛋白凝膠品質(zhì)的影響，不僅可以提高牛肉制品的營養(yǎng)保健功能，而且還可以豐富我國肉制品種類，滿足廣大消費者的實際需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛背最長肌，河南省新鄉(xiāng)市易購世紀華聯(lián)超市；豌豆蛋白，煙臺東方蛋白科技有限公司。

NaCl、NaOH、戊二醛、NaH2PO4、Na2HPO4、乙醇、氯仿等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UMC-5C斬拌機,德國Stephan公司；臺式高速冷凍離心機,Thermo Fisher Scientific；絞肉機,山東嘉信食品機械有限公司；AUY120電子天平,日本島津公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋,北京中興偉業(yè)儀器有限公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀,英國Stable Micro Systems公司；CR-400色差儀,日本Konica Minolta公司；Quanta 200掃描電子顯微鏡,美國FEI公司；Haake Mars 60旋轉(zhuǎn)流變儀,德國Thermo Fisher Scientific公司；真空干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PQ001臺式NMR分析儀,上海紐邁電子有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 牛肉鹽溶蛋白熱凝膠的制備

參考SUN[26]方法并稍作修改。取200 g新鮮牛肉剔除脂肪和結(jié)締組織，切塊，用絞肉機絞成肉糜，加入600 mL 0.6 mol/L NaCl溶液，勻漿，調(diào)pH值7.0，4 ℃放置24 h，10 000 r/min離心10 min，上清液即鹽溶蛋白。

蛋白凝膠制備：取數(shù)支50 mL離心管，加入30 mL 30 mg/mL鹽溶蛋白，分別加入豌豆蛋白0、1.2、2.4、3.6和4.8 g，使添加質(zhì)量濃度分別為0、0.04、0.08、0.12和0.16 g/mL，高速均質(zhì)，4 ℃冰箱靜置12 h，25～85 ℃水浴，并于85 ℃保持5 min，取出冷卻至室溫，備用[27]。

1.3.2 色澤的測定

參照李娜等[28]的方法并稍做修改。采用CR-400色差儀，以標準白板作為對照，記錄樣品L*、a*和b*值，分別為亮度指數(shù)、紅度指數(shù)和黃度指數(shù)，重復(fù)6次試驗取平均值。

1.3.3 保水性的測定

參照QIN等[29]的方法。將樣品切成直徑15 mm，高20 mm的圓柱體，稱重記為m1。置于離心管中，6 000×g離心10 min，用濾紙吸干表面水分，再次稱重，記為m2。以離心后凝膠質(zhì)量占原質(zhì)量的百分比，即為保水性(water holding capacity, WHC)。

(1)

式中：m1，離心前樣品質(zhì)量；m2，離心后樣品質(zhì)量。

1.3.4 蒸煮得率的測定

參照王春彥等[30]的方法并稍作修改。將樣品在室溫環(huán)境回溫2 h，吸干表面水分，稱量并記錄質(zhì)量。

(2)

1.3.5 質(zhì)構(gòu)的測定

參照ZHOU等[31]的方法并稍作修改。采用TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀對樣品(Φ2 cm×20 mm)進行質(zhì)構(gòu)測試，使用直徑為50 mm的圓柱形探頭(P/36R)，參數(shù)如下:測試前速2 mm/s，測試速度2 mm/s，測試后速度3 mm/s，壓縮樣品高度為40%，時間5 s，觸發(fā)類型為自動，觸發(fā)力5 g。相關(guān)質(zhì)構(gòu)參數(shù)為硬度、咀嚼性、彈性和恢復(fù)性。每組樣品測定6次取平均值。

1.3.6 流變性的測定

參考WESTPHALEN等[32]的方法并稍作修改。校準機器并調(diào)好參數(shù)后，用50 mm不銹鋼圓形平板探頭，間隙距離為0.6 mm，將樣品均勻涂抹在2個平板之間，再涂一層薄的硅油，以防止水分蒸發(fā)。在25 ℃保溫10 min，然后從25～85 ℃升溫，加熱速率為2 ℃/min。在加熱過程中，在固定的頻率(0.1 Hz)和振蕩模式下對樣品進行連續(xù)剪切，測量儲能模量(G′)和損耗模量(G″)的變化。

1.3.7 微觀結(jié)構(gòu)的測定

將凝膠樣品切成2 mm的小條，用質(zhì)量濃度25 g/L的戊二醛(pH 6.8)浸泡過夜。先用0.1 mol/L pH值6.8的磷酸緩沖液洗3次，每次為15 min，再用50%～90%的乙醇脫水，每次為15 min，無水乙醇脫水3次，每次10 min。采用氯仿進行脫脂1 h，V(無水乙醇)∶V(叔丁醇)=1∶1，以及叔丁醇各進行1次置換，每次為15 min。真空干燥后進行掃描觀察[33]。

1.3.8 NMR自旋-自旋馳豫時間(T2)的測定

參考HAN等[34]的方法并稍做修改。稱取約2 g的凝膠樣品放入直徑15 mm的核磁管中。測量溫度為32 ℃，質(zhì)子共振頻率為22.6 MHz，采樣頻率為100 kHz，半回波時間τ-值(90°脈沖和180°脈沖之間的時間)為200 μs，重復(fù)掃描 32次，重復(fù)間隔時間110 ms，掃描12 000個回波，自旋-自旋弛豫時間T2用CPMG序列測量，得到的圖為指數(shù)衰減圖形，每個樣品測定6個重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆蛋白添加量對牛鹽溶蛋白凝膠色澤的影響

評價肉的感官品質(zhì)的重要指標之一是顏色，它同時也是影響消費者購買力的重要因素。由圖1可知，凝膠L*值先升高后下降，豌豆蛋白添加質(zhì)量濃度在0.12 g/mL時達到最大值，為65.92；凝膠a*值呈下降趨勢，但添加量在0.04～0.16 g/mL之間差異不顯著(P> 0.05)；隨豌豆蛋白添加量的增加，凝膠b*值顯著增加，添加量在0.16 g/mL時達到最大，是對照組的2.41倍。因為牛鹽溶蛋白凝膠呈淺紅色，豌豆蛋白本身呈淡黃色，隨著豌豆蛋白添加量逐漸增加，混合凝膠顏色也逐漸加深，因此a*值逐漸越低，L*值、b*值升高，當豌豆蛋白添加過多則導(dǎo)致L*值下降。

圖1 豌豆蛋白的添加量對凝膠色澤的影響Fig.1 Effect of pea protein addition on the color of gel注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 豌豆蛋白添加量對牛鹽溶蛋白凝膠保水性與蒸煮得率的影響

保水性是肉類蛋白凝膠重要的品質(zhì)特性，它直接影響到肉制品組織結(jié)構(gòu)、風(fēng)味、以及感官品質(zhì)等。肉制品中自由水相對百分含量越高，則對應(yīng)外界處理時損失的水分越多，其保水性也就越差[35]。

圖2 豌豆蛋白的添加量對凝膠保水性和蒸煮得率的影響Fig.2 Effect of pea protein addition on the water holding capacity and cooking yield of gel

由圖2可知，隨豌豆蛋白添加量的增加，凝膠的保水性和蒸煮得率均呈上升趨勢，添加量在0.12 g/mL時，分別為88.85%、89.49%，添加量在0.16 g/mL時，分別為89.62%、90.63%，彼此差異不顯著(P>0.05)，但與對照相比均差異顯著(P<0.05)。表明豌豆蛋白與鹽溶蛋白結(jié)合，水分子的運動受到束縛，蛋白之間相互作用增強，變性聚集，形成了較為致密的三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)，從而增強了凝膠的保水性，提高了凝膠的蒸煮得率。馮云等[36]研究表明，牛血漿蛋白具有改善豬肉鹽溶蛋白凝膠特性的作用，當添加質(zhì)量濃度為0.9 g/100mL時，能夠降低共混凝膠煮制損失，提高保水性。

2.3 豌豆蛋白添加量對牛鹽溶蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性除了受外界條件的影響外，功能蛋白的數(shù)量起了決定性的作用。由表1可知，隨著豌豆蛋白添加量的增加，凝膠的硬度、咀嚼性均呈上升趨勢，在添加量為0.16 g/mL時最大，分別為1 410 g、949 g，是對照的4.90與4.83倍，差異顯著(P<0.05)。凝膠的彈性與恢復(fù)性，均隨豌豆蛋白添加量的增加，呈先升高后下降趨勢，在添加量為0.12 g/mL時最大，分別為0.969、0.432，比對照增加了2.54%和9.09%；在添加量為0.16 g/mL時，彈性與恢復(fù)性最低，分別為0.927、0.367。

表1 豌豆蛋白添加量對牛鹽溶蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Table 1 Effect of pea protein addition on texture ofbovine gel

注：同一列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下表同。

由于豌豆蛋白具有較強的乳化性與膠凝性，隨豌豆蛋白添加量的增加，使單位體積內(nèi)凝膠分子數(shù)及其分子間碰撞機率增加，促進了豌豆蛋白與牛肉鹽溶蛋白的分子間交聯(lián)，形成了穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在豌豆蛋白添加質(zhì)量濃度為0.12 g/mL時，形成的肉糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性最好。但加入過量豌豆蛋白，會導(dǎo)致固形物大量增加，對水分的束縛作用增強，且與牛肉蛋白競爭可利用的水分，蛋白相產(chǎn)生濃縮效應(yīng)，降低了凝膠的彈性與恢復(fù)性?？妆ＨA等[37]研究了大豆蛋白對牛肉凝膠特性的影響，結(jié)果表明，隨大豆蛋白添加量的增加，凝膠彈性大體呈先增加后下降趨勢，到3%后，彈性顯著降低，與本文研究結(jié)果相似。

2.4 豌豆蛋白添加量對牛鹽溶蛋白凝膠流變特性的影響

凝膠形成的過程，伴隨著肌肉蛋白不斷的解鏈、變性、凝集，是一個不穩(wěn)定的動態(tài)變化過程。儲能模量G′的變化能反映出凝膠強度與硬度的變化，G′值越大，對應(yīng)的凝膠強度與硬度越大。如圖3所示，在整個升溫過程中，鹽溶蛋白凝膠動態(tài)流變曲線中彈性模量呈現(xiàn)出 3個階段的變化。在 25～47 ℃內(nèi)，彈性模量G′基本保持不變，隨著溫度的升高，G′在48 ℃左右緩慢增加，并且在 53 ℃達到第1個峰值，這是由于鹽溶蛋白中的肌球蛋白分子頭部發(fā)生變性、聚集，分子的構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變，形成“預(yù)凝膠”；繼續(xù)加熱，彈性模量G′急劇下降，并在57 ℃左右達到最小值，這是由于肌球蛋白分子尾部發(fā)生變性，使肌球蛋白頭部結(jié)合崩潰瓦解，形成“凝膠削弱”，破壞了已形成的凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；G′在57～85 ℃內(nèi)又快速上升，之后趨于穩(wěn)定，表明大量變性肌球蛋白之間通過頭部二硫鍵、疏水作用聯(lián)結(jié)，尾部的橫向連接等方式發(fā)生聚集，形成黏彈性好的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[38]。

圖3 豌豆蛋白添加量對凝膠儲能模量的影響Fig.3 Effect of pea protein addition on storage modulus of gel

圖4 豌豆蛋白添加量對凝膠損耗模量的影響Fig.4 Effect of pea protein addition on loss modulus of gel

由圖3可知，隨豌豆蛋白添加量的增加，凝膠G′逐漸增加，添加量越大，初始值與終值越高，且高于對照。在動態(tài)流變曲線中，幾種添加量的變化趨勢類似，G′均呈現(xiàn)出4個階段的變化。豌豆蛋白添加量影響凝膠鹽溶蛋白的變性，第1個峰出現(xiàn)在58 ℃，與鹽溶蛋白凝膠峰值溫度53 ℃相比，系統(tǒng)峰值溫度升高，表明豌豆蛋白推遲了肌球蛋白頭部的變性溫度；58～60 ℃，G′迅速下降，表明豌豆蛋白推遲了肌球蛋白尾部的變性溫度；60～66 ℃，出現(xiàn)了第二峰。SHAND等[39]研究表明，豌豆蛋白有2個熱變性溫度，分別為67.1和85.1 ℃。MESSION等[40]研究發(fā)現(xiàn)，豌豆蛋白7S球蛋白在68.5 ℃、11S球蛋白亞基在75～85 ℃發(fā)生變性和聚集。由圖3可知，豌豆蛋白從20～76 ℃，G′值基本與橫坐標平行，至76 ℃后，G′值快速上升，到85 ℃趨于穩(wěn)定，與MESSION報道一致，而與SUN等報道豌豆蛋白在82～86 ℃形成凝膠略有差別，可能與豌豆來源、蛋白提取方法、蛋白分散介質(zhì)有關(guān)[41]。據(jù)文獻報道，牛鹽溶蛋白DSC圖譜主要有3個熱變性峰，分別為峰Ⅰ 50.14 ℃，即肌球蛋白頭部的變性峰、峰Ⅱ 60.07 ℃，即肌球蛋白尾部與肌漿蛋白變性峰，峰Ⅲ 74.28 ℃肌動蛋白的變性峰[42]。第2個峰在63 ℃時G′達到最大，且隨豌豆蛋白添加量的增加，G′逐漸增加且峰形越來越明顯，結(jié)合鹽溶蛋白與豌豆蛋白凝膠流變曲線特征與文獻報道，推測第二峰形變化是由豌豆蛋白7S球蛋白受熱解折疊，使其活性巰基、疏水基團等暴露，影響已形成的凝膠結(jié)構(gòu)，造成G′緩慢下降；66～85 ℃，大部分的豌豆蛋白與肌動蛋白分子展開，發(fā)生變性交聯(lián)，G′迅速上升，形成具有一定硬度、彈性、不可逆的熱致凝膠。

損耗模量G″反映了凝膠形成過程中鹽溶蛋白黏性的變化過程。由圖4可知，不同添加量豌豆蛋白的共混凝膠G″值變化趨勢相近。36 ℃時G″值開始逐漸增加，58 ℃左右達到最大，之后急劇下降，到68 ℃，繼續(xù)加熱過程中G″值又逐漸上升，最終形成穩(wěn)定凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。鹽溶蛋白凝膠G″值在53 ℃左右達到最大，之后下降，到66 ℃又緩慢上升，與G′中蛋白變性溫度一致。有研究表明，46～57 ℃的黏彈性變化可能與肌球蛋白變性有關(guān)，46～53 ℃鹽溶蛋白處于上升階段，為肌球蛋白頭部結(jié)合所致，而豌豆的添加推遲了肌球蛋白頭部變性的溫度，達到峰值之后的急劇下降可能與肌球蛋白尾部展開有關(guān)[43]。圖3、圖4表明，混合凝膠的G′值和G″值均高于鹽溶蛋白，表明添加豌豆蛋白可以提高鹽溶蛋白凝膠的形成能力。CHANG等[44]研究表明，大豆豆渣的添加能夠影響豬肉凝膠的變性溫度，G′值和G″值均隨大豆豆渣添加量的增加而升高，與本文結(jié)論一致。

2.5 豌豆蛋白對牛鹽溶性蛋白凝膠水分遷移的影響

低場核磁共振測量的自旋-自旋弛豫時間(T2)，能夠反映出凝膠體系水分分布和遷移情況[45]，T2越短表明水與底物結(jié)合越緊密，反之表明水分越自由[46]。由表2可知，對T2反演擬合后出現(xiàn)3個峰，可能分別對應(yīng)結(jié)合水(T2b)，1.87～3.56 ms；不易流動水(T21)，20.92～36.63 ms和自由水(T22)，177.75～228.88 ms[47]。隨豌豆蛋白添加質(zhì)量濃度的不斷增加，T2b、T21、T22均呈現(xiàn)出峰值持續(xù)向較短時間方向移動趨勢，添加質(zhì)量濃度為0.16 g/mL時，T2b、T21、T22均降至最低，與添加質(zhì)量濃度0.12 g/mL時的T2相比，差異不顯著(P>0.05)，但顯著低于對照(P<0.05)，表明水分流動性變差，與蛋白凝膠體系結(jié)合緊密。峰面積代表此部分水所占的百分比。隨豌豆蛋白添加質(zhì)量濃度的增加，P21持續(xù)增加，P22持續(xù)下降。添加豌豆蛋白可以降低自由水的峰比例，增加不易流動水的峰比例，表明有更多的自由水附著在蛋白周圍或被束縛在凝膠結(jié)構(gòu)中，轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合水或不易流動水。添加質(zhì)量濃度為0.12 g/mL與0.16 g/mL的P21、P22差異不顯著(P>0.05)，表明添加質(zhì)量濃度為0.12 g/mL的豌豆蛋白就能夠充分降低共混凝膠中水分損失，提高保水性?？祲邀惖萚48]研究表明，添加大豆分離蛋白乳化豬背膘的凝膠，可降低其自由水峰比例，增加不易流動水峰比例，提高了豬肉凝膠的保水性。本實驗中弛豫時間T2的測定結(jié)果與保水性結(jié)果相一致。

表2 豌豆蛋白對牛鹽溶蛋白共混凝膠水分遷移的影響Table 2 Effect of pea protein on water distribution of beef salt-soluble protein gel

2.6 豌豆蛋白添加量對牛鹽溶蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

蛋白凝膠為立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，不僅能留存水分及脂肪，而且也是風(fēng)味物質(zhì)載體，因此，蛋白的這種特性具有重大的加工意義。隨豌豆蛋白添加量的增加，共混凝膠微觀結(jié)構(gòu)得到逐步改善。

圖5 豌豆蛋白添加量對凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of pea protein addition on the microstructure of gel

由圖5可知，不添加豌豆蛋白的牛鹽溶蛋白凝膠多呈束狀，組織狀態(tài)粗糙松散，感官上顏色發(fā)暗，氣泡較大、較多；添加質(zhì)量濃度增加到0.12 g/mL時，凝膠中蛋白交聯(lián)程度加大，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密均勻，光滑細膩有層次，感官上顏色發(fā)亮，氣泡基本消失；到添加質(zhì)量濃度為0.16 g/mL時，過量的豌豆蛋白與鹽溶蛋白激烈的競爭水分，且不能被鹽溶蛋白充分“包埋”，已大量裸露。結(jié)合流變特性試驗結(jié)果，推測豌豆蛋白能夠促進牛鹽溶蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的形成，主要是通過物理填充、包埋與機械支撐，以及二者之間可能通過疏水作用、氫鍵、二硫鍵等化學(xué)相互結(jié)合而起作用的。

靳紅果等[49]研究了MgCl2、NaCl和pH值等外界因素對牛肉鹽溶蛋白熱誘導(dǎo)凝膠特性的影響，結(jié)果表明，不同的提取條件蛋白含量差異較大。蛋白含量高、保水性好的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也比較致密，微細孔洞大量均勻分布。

3 結(jié)論

豌豆蛋白的添加，有利于促進牛肉鹽溶蛋白共混熱誘導(dǎo)凝膠立體均一、緊密有序、富有彈性的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成；能使共混凝膠獲得適宜的色度，能降低凝膠自由水相對百分含量、增加不易流動水的比例，束縛住水分，進而提高了凝膠的保水性與蒸煮得率。隨豌豆蛋白添加量的增加，質(zhì)構(gòu)特性明顯改善，硬度與咀嚼性持續(xù)增加，彈性與恢復(fù)性呈先增加后下降趨勢，添加質(zhì)量濃度在0.12 g/mL時，凝膠的彈性和恢復(fù)性達到最大；豌豆蛋白推遲了肌球蛋白頭部的變性溫度，隨添加量的增加，共混凝膠的G'也明顯增大，終值與初始值始終高于對照，且與硬度結(jié)果高度一致，G"變化趨勢與G′相似；豌豆蛋白可通過物理填充與化學(xué)相互作用的形式，改善凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，添加量在0.12 g/mL時，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)均勻一致，高度有序。