潘巖

(信陽農(nóng)林學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，河南 信陽 464000)

吉非替尼(Gefitinib)（圖1），化學(xué)名4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-[3-(4-嗎啉基)丙基]喹唑啉，商品名易瑞沙，由阿斯利康原研，2003年于我國上市，臨床上用于治療非小細(xì)胞肺癌[1]。EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)，上皮生長因子受體，是吉非替尼的藥物作用靶點。EGFR是一種致癌基因，可能會引起肺部，腦部以及頸部的癌變[2]。吉非替尼是ATP(三磷酸腺苷)類似物，是一個高選擇性的EGFR抑制劑，可與EGFR結(jié)合，抑制癌細(xì)胞生長[3]。吉非替尼作用靶點明確，不良反應(yīng)較少，具有很大的醫(yī)療、市場價值。

目前文獻所報道的合成路線大多存在合成路線較長、原料試劑昂貴等問題[4-6]，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，急需開發(fā)出一條合成步驟少，原料易得，簡單易行的合成路線。

星點設(shè)計—響應(yīng)面法是近年來國際上使用的一種數(shù)學(xué)建模和實驗設(shè)計方法，可應(yīng)用藥物合成工藝研究[7]。與傳統(tǒng)的正交設(shè)計、均勻設(shè)計相比，響應(yīng)面法更能體現(xiàn)出因素之間的交互作用，結(jié)果可信度高，預(yù)測出的反應(yīng)條件更加接近最優(yōu)反應(yīng)條件[8]。

圖1 吉非替尼化學(xué)結(jié)構(gòu)式

專利WO9633980[10]報道的合成路線，通過甲基化反應(yīng)、乙?；磻?yīng)、氯代反應(yīng)、縮合反應(yīng)、水解反應(yīng)、烴基化反應(yīng)六步制得目標(biāo)產(chǎn)物吉非替尼，合成步驟較長。甲基化反應(yīng)中使用蛋氨酸，試劑昂貴，增加了成本；乙酰化反應(yīng)使用的乙酸酐為易制毒的、管控的試劑，不易得；氯代反應(yīng)中使用了二氯亞砜作為氯代試劑，產(chǎn)生二氧化硫、氯化氫等廢氣，污染環(huán)境，而且氯化亞砜的毒性較大，不易操作。該路線較長，所用試劑不易得，對環(huán)境污染嚴(yán)重。

根據(jù)專利報道的路線（見圖2），首先對合成路線進行優(yōu)化，優(yōu)化后的路線如下。用易制得的乙酰氯代替易制毒的乙酸酐，用環(huán)境友好的濃鹽酸代替污染嚴(yán)重的氯化亞砜，將氨基縮合和水解兩步反應(yīng)合為一步，最后經(jīng)過四步反應(yīng)便可制得目標(biāo)產(chǎn)物吉非替尼。接著用星點設(shè)計—響應(yīng)面法對路線中的關(guān)鍵步驟—目標(biāo)產(chǎn)物吉非替尼的合成一步進行優(yōu)化，最終路線總產(chǎn)率高于文獻報道產(chǎn)率，所用試劑廉價清潔，合成工藝綠色、環(huán)境友好，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑和儀器

所用儀器為SGW-4B顯微型熔點儀(杭州科曉化工)；質(zhì)譜為Thermo TSQ Quantum LC/MS(美國Waters公司)；高效液相色譜儀Agilent1200；薄層硅膠板GF254(青島海洋化工)。所用化學(xué)試劑和溶劑均為市售分析純或化學(xué)純。

1.2 6-乙酰氧基-7-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮(4)的合成

將96.0g (0.5mol) 6-羥基-7-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮、75.6g(0.75mol)三乙胺、1000mL二氯甲烷加至2000mL四頸瓶中，室溫攪拌至 6-羥基-7-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮完全溶解，降溫至0 ～ -5℃，在該溫蒂下緩慢滴加64.3g(0.6mol)新制備的乙酰氯，40min滴加完畢，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h，加入800mL水?dāng)嚢?0min淬滅反應(yīng)，加入1mol/L稀鹽酸調(diào)至溶液pH=7，抽濾，得濾餅，濾餅用500mL水洗滌，60℃真空干燥4h，得 6-乙酰氧基-7-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮為白色固體，得量114.7g，收率98%，m.p.300.5-301.9℃，文獻值m.p.303-305℃[10]，MS m/z(%)：233[M+H]-;1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.33(s,1H,=NH),8.09-8.08(d,J=3.52Hz,1H,=CH),7.76(s,1H,ARH), 7.18(s,1H,ArH), 3.82(s,3H,-OCH3), 2.20(s,3H,-COCH3)。

1.3 6-乙酰氧基-4-氯-7-甲氧基喹唑啉(3)的合成

將117g(0.5mol) 6-乙酰氧基-7-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮、500mL 50%乙醇溶液加至2000mL四頸瓶中，緩慢加入100mL 36%濃鹽酸，繼續(xù)加入68g(0.5mol)氯化鋅，室溫攪拌24h，反應(yīng)完全后，用40% KOH溶液調(diào)至溶液pH=7，加入二氯甲烷(300×3)萃取，得二氯甲烷相，減壓濃縮，得棕色固體殘余物，棕色固體用400mL 50%甲醇溶液重結(jié)晶，得6-乙酰氧基-4-氯-7-甲氧基喹唑啉為白色固體，得量119.7g，收率95%，m.p.155.1-154℃，文獻值m.p.157-159℃[11]，MS m/z(%)：253[M+H]+;1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.84(s,1H,=CH), 7.77(s,1H,ArH), 7.40(s,1H,ArH),3.85(s,3H,-OCH3), 2.20(s,3H,-COCH3)。

1.4 4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉(2)的合成

圖2 合成路線

將127g(0.5mol) 6-乙酰氧基-4-氯-7-甲氧基喹唑啉、87g(0.6mol)3-氯-4-氟苯胺、800mL無水乙醇加入到2000mL四頸瓶中，加熱回流反應(yīng)8h，冷卻降溫，降至室溫后，用40%KOH溶液調(diào)節(jié)pH=12，繼續(xù)室溫攪拌反應(yīng)16h，降溫至-10℃，析出白色固體，抽濾，得濾餅，濾餅用無水乙醇洗滌，得4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉為類白色固體，得量160.6g，收率89%，m.p.283.4-286℃，文獻值m.p.285-288℃[12]，MS m/z(%)：320[M+H]+;1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.38(s,1H,-NH-),8.38(s,1H,=CH),8.13-8.11(dd,1H),7.76-7.72(m,1H),7.68(s,1H),7.33-7.28(t,1H),7.12(s,1H),3.88(s,3H,-OCH3).

1.5 吉非替尼(1)的合成

將159.5g(0.5mol) 4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉、無水118.8g(0.6mol)碳酸鉀、800mL無水乙醇加入到2000mL四頸瓶中，室溫下滴加97.8g(0.6mol)3-氯丙基嗎啉，1h內(nèi)滴加完畢，加熱回流攪拌反應(yīng)6h，降至室溫，抽濾，棄濾餅，減壓濃縮濾液，得棕色固體，用500mL水洗滌，抽濾，得濾餅，50℃減壓干燥，得粗品為類白色固體，得量180.3g，收率78.3%。繼續(xù)用50%異丙醇溶液重結(jié)晶，0.5g活性炭脫色，得精品吉非替尼為白色固體，得量170.7g，收率94.6%。HPLC檢測其純度為99.9%，m.p.190.1-190.9℃，文獻值m.p.190.2-191.5℃[13]，MS m/z(%)：447[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.49(s,1H,-NH-),δ8.49(s,1H,=CH),8.13-8.10(dd,1H),7.82-7.78(m,1H),7.75(s,1H),7.43-7.41(t,1H),7.16(s,1H),4.16-4.13(t,2H,CH2-O-),3.93(s,3H,-OCH3),3.59-3.57(t,4H),2.48-2.45(t,2H),2.38(m,4H),2.00-1.96(t,2H).

2 工藝優(yōu)化

2.1 星點設(shè)計

使用星點設(shè)計—響應(yīng)面法對目標(biāo)化合物1吉非替尼的反應(yīng)條件進行優(yōu)化。首先根據(jù)單因素實驗結(jié)果，影響目標(biāo)化合物1產(chǎn)率的因素為：4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉和3-氯丙基嗎啉的投料比(下文簡稱為摩爾比)、無水碳酸鉀的用量、反應(yīng)溫度。再使用Design-Expert.V8.0.6進行星點設(shè)計，響應(yīng)值是目標(biāo)化合物1吉非替尼的收率，最后利用該軟件的Ponit Prediction功能預(yù)測最佳反應(yīng)條件。

表1 星點設(shè)計因素水平表

實驗表中用編碼值(±ɑ、±1、0)代表水平值。

根據(jù)表2中的實驗結(jié)果進行多元線性回歸和二項式擬合，得到目標(biāo)化合物1吉非替尼的最終統(tǒng)計學(xué)模擬等式為：

yield = -0.95762＋0.45253×A＋0.79863×B＋0.017927×C-5.0×10-4AB＋8.02083×10-4AC-2.26042×10-3BC-0.13727A2-0.21576B2-1.00090×10-4

對該等式進行統(tǒng)計學(xué)方差分析，結(jié)果如下：

總模型的F值為30.25表明該模型可信。A、B、C、AB、AC、BC的P值都＜0.05表明模型可信度高。

2.2 響應(yīng)面分析

對所得數(shù)據(jù)進行響應(yīng)面分析，結(jié)果如下：

圖1a～3a，當(dāng)A、B、C取值較小時，響應(yīng)面較陡，說明A、B、C取值較小時對產(chǎn)率的影響較大。圖1b，等高線呈橢圓形，說明當(dāng)溫度一定時，摩爾比和堿用量交互作用顯著，且當(dāng)反應(yīng)溫度一定時，在合適的摩爾比和堿用量條件下，產(chǎn)率會出現(xiàn)極大值。圖2b，等高線呈橢圓形，說明當(dāng)摩爾比一定時，反應(yīng)溫度和堿用量交互作用顯著，增大堿用量和反應(yīng)溫度，產(chǎn)率會出現(xiàn)極大值。圖3b，等高線呈橢圓形，說明當(dāng)堿用量一定時，反應(yīng)溫度和摩爾比交互作用顯著，在合適的反應(yīng)溫度和摩爾比條件下，產(chǎn)率會出現(xiàn)極大值[14-15]。

表2 星點設(shè)計實驗方案表

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

綜合以上分析結(jié)果，使用軟件Design-Expert.V8.0.6的Ponit Prediction功能，預(yù)測出響應(yīng)值最大的反應(yīng)條件為：摩爾比1.44:1，堿用量1.87:1，反應(yīng)溫度78℃，預(yù)測收率為76.2%。

2.3 結(jié)果驗證

按照預(yù)測的最優(yōu)反應(yīng)條件，摩爾比1.44:1，堿用量1.87:1，反應(yīng)溫度78℃，設(shè)計三組平行實驗，對預(yù)測收率進行驗證，得平均收率為78.4%，與預(yù)測結(jié)果相近，說明星點設(shè)計—響應(yīng)面法可用于吉非替尼合成工藝的優(yōu)化。

3 結(jié)果和討論

(1)該路線總收率61.4%。

圖1 摩爾比和堿用量對產(chǎn)率的響應(yīng)值(a)和等高線(b)的影響

圖2 堿用量和反應(yīng)溫度對產(chǎn)率的響應(yīng)值(a)和等高線(b)的影響

圖3 摩爾比和反應(yīng)溫度對產(chǎn)率的響應(yīng)值(a)和等高線(b)的影響

(2)制備中間體4時，用易得的乙酰氯代替易制毒的乙酸酐，且乙酰氯作為乙酰化試劑時，該步產(chǎn)率更高。

(3)制備中間體3時，用清潔的濃鹽酸代替氯化亞砜作為氯代試劑，減少了氯化亞砜產(chǎn)生的氯化氫、二氧化硫等廢氣排放，環(huán)境友好。

(4)由中間體3可直接制得中間體2，縮短了反應(yīng)步驟，提高了路線的總產(chǎn)率。

(5)目標(biāo)化合物1—吉非替尼的合成中，用星點設(shè)計—響應(yīng)面法進行實驗設(shè)計和結(jié)果分析，有效減少了工藝研究中的實驗次數(shù)，優(yōu)化后的反應(yīng)條件為：摩爾比1.44:1，堿用量1.87:1，反應(yīng)溫度78℃，響應(yīng)面法分析結(jié)果可信度高，預(yù)測值接近真實值，表明星點設(shè)計—響應(yīng)面法可用于藥物合成工藝研究。