王昀 ，李月，唐春蘭，孟帥磊，陳貴元 ，左紹遠 *

1. 大理大學基礎(chǔ)醫(yī)學院（大理 671000）；2. 武漢金域醫(yī)學檢驗所有限公司（武漢 430000）；3. 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室（大理 671000）

多糖是除了蛋白質(zhì)、核酸以外的又一類重要的天然高分子化合物。與蛋白質(zhì)和核酸相比，多糖的含量是最為豐富的，在動物、植物、微生物中均有分布。大量研究顯示，多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗炎等生物學活性[1-4]。而近年來除了抗腫瘤活性外，多糖的抗氧化活性也成為活性藥物資源研究的熱點[5]。研究發(fā)現(xiàn)多糖的生物活性與其形態(tài)結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量及化學成分組成密切相關(guān)[6]。糖醛酸的含量、單糖組成、糖苷鍵類型直接決定真菌多糖的活性。支鏈的類型、聚合度、在多糖鏈上的分布及其取代度決定其活性的強弱[7]。目前對油菜蜂花粉多糖、山茶蜂花粉多糖、玉米蜂花粉多糖等其它植物來源的蜂花粉多糖結(jié)構(gòu)研究都較多，而有關(guān)紅花蜂花粉多糖的結(jié)構(gòu)未見有報道。課題組在前期試驗中已分離制備出紅花蜂花粉總多糖（PBPC），并發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗菌及抗凝血等生物學活性[8-10]。試驗旨在探究從前期試驗制備出紅花蜂花粉多糖總多糖中分離純化出的組分Ⅱ（PBPC-Ⅱ）的相對分子質(zhì)量、糖苷鍵的類型、單糖組成及抗氧化活性。初步分析PBPC-Ⅱ抗氧化的構(gòu)效關(guān)系，以期為進一步研究PBPC-Ⅱ的抗腫瘤活性及其他藥理作用提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 試驗材料

碘、碘化鉀、氯仿、三氟乙酸、鹽酸羥胺、硼氫化鈉、硫酸鈉，維生素C，國藥集團化學試劑有限公司；木糖、巖藻糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖、溴化鉀，美國Sigma公司；DPPH，日本東京化成工業(yè)株式會社。

1.2 試驗儀器

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；DBS-160電腦全自動部分收集器，上海瀘西分析儀器廠有限公司；RI-502示差檢測器，昭和電工科學儀器有限公司；APPS MV 10 D收集器，蘇州利穗科技有限公司；Spectrum 100傅里葉變換紅外光譜儀，美國Perkin Elmer公司；7890 A/5975 C氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，美國Agilent公司；抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測定試劑盒、羥自由基測試試劑盒，南京建成生物工程研究所。

2 試驗方法

2.1 β消去反應(yīng)

參考文獻[11]。稱取5 mg干燥的 PBPC-Ⅱ，溶于5 mL 0.2 mol/L的NaOH溶液中，于45 ℃水浴3 h，在190～400 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描。以蒸餾水作為空白對照，同法操作。

2.2 碘反應(yīng)

參考文獻[12]。稱取干燥的PBPC-Ⅱ配制1 mg/mL的多糖溶液。取0.2 g I2和2.0 g KI，用水定容至100 mL，備用。吸取100 μL PBPC-Ⅱ溶液于白瓷板上，依次加入20 μL的碘液混勻，觀察白瓷板上反應(yīng)液顏色變化。另取反應(yīng)液，在200～700 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描。以蒸餾水作為空白對照，同法操作。

2.3 紅外光譜分析

取適量干燥至恒重的PBPC-Ⅱ，以1∶100比例添加干燥的KBr粉末，研磨制片，在4 000～400 cm-1波長內(nèi)進行紅外光譜掃描分析。

2.4 單糖組成

參考文獻[13]。精確稱取10 mg干燥PBPC-Ⅱ，并加2 mL 4 mol/L的TFA于安瓿瓶中，N2封管，于110 ℃烘箱中水解反應(yīng)6 h后，加4 mL甲醇旋干（40 ℃），重復(fù)3次至無酸味。加1 mL吡啶及10 mg鹽酸羥胺，N2封管，于100 ℃水浴30 min，冷卻至常溫，加1 mL乙酸酐，N2封管，于100 ℃水浴30 min，冷卻至常溫，反應(yīng)液旋干（65 ℃），溶于2 mL氯仿，加少許Na2SO4去水分，離心取有機相，0.45 μm濾過后進行GC-MS分析。同法操作各標準單糖及GC-MS分析。

GC條件：Agilent HP-5MS UI毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），以氮氣為載氣，流速 1.0 mL/min，進樣1 μL；程序升溫，初溫100 ℃，以5 ℃/min升至200 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min 升至250℃，保持5 min，再于300 ℃運行3 min；進樣口溫度為250 ℃，接口溫度為250 ℃；檢測器，MS總離子流檢測器。

MS條件：EI電離方式，電子轟擊70 eV，離子源230 ℃，分流比10∶1，溶劑延遲3 min，質(zhì)荷比m/z 15～550，掃描頻率5 Hz，接口溫度250 ℃，四級桿溫度150 ℃。

2.5 試劑配制

樣品液：稱取適量PBPC-Ⅱ，配制成0.10，0.20，0.30，0.40和0.50 mg/mL的多糖溶液。

0.1 mmol/L DPPH：稱取4 mg的DPPH，用無水乙醇定容至100 mL，于4 ℃避光，備用。

2.6 羥自由基清除作用

吸取1 mL各濃度的PBPC-Ⅱ樣品液，按照羥自由基測試試劑盒的說明書方法進行操作，依次加樣，測量550 nm處反應(yīng)液的吸光度。以VC為陽性對照，同法操作。按式（1）計算PBPC-Ⅱ?qū)H的清除能力。

OH清除率能力單位（U/mL）=（Aa-Ab）/（Ac-AO）×標準品濃度×1×樣品稀釋倍數(shù)/測試量 （1）式中：Aa為對照管吸光度；Ab為測試管吸光度；Ac為標準管吸光度；AO為空白管吸光度；標準品濃度為8.824 mmol/L；測試量的單位為mL。

說明書上定義：在37 ℃下，反應(yīng)60 s，1 mL的樣液可讓反應(yīng)體系里的H2O2濃度下降1 mmol/L，此為一個OH清除能力單位。

2.7 超氧陰離子清除作用

吸取1 mL各濃度的PBPC-Ⅱ樣品液，按照超氧陰離子自由基測定試劑盒的說明書方法進行操作，依次加樣，測量550 nm處反應(yīng)液的吸光度。以VC為陽性對照，同法操作。按式（2）計算PBPC-Ⅱ?qū)2-的清除能力。O2-清除率能力單位（U/L）=（A2-A1）/（A2-A0）×標準品濃度×1 000×樣品稀釋倍數(shù)/測試量 （2）式中：A1為測試管吸光度；A2為對照管吸光度；A0為標準管吸光度；標準品濃度為0.15 mg/mL；測試量單位為mL。

說明書上定義：在37 ℃下，反應(yīng)40 min，反應(yīng)液中1 mL的樣液清除O2-，相當于1 mg VC所清除O2-的改變值為一個活力單位。

2.8 DPPH清除作用

參考文獻[14]的方法。吸取2 mL各濃度的PBPC-Ⅱ樣品液，依次加入2 mL的0.1 mmol/L的DPPH混勻，室溫避光反應(yīng)0.5 h，測517 nm處的反應(yīng)液吸光度。以2 mL的純水代替樣品液為空白，VC為陽性對照，同法操作。按式（3）計算PBPC-Ⅱ?qū)PPH自由基的清除率。

式中：An為反應(yīng)液吸光度，Am為反應(yīng)液本底吸光度，Ag為空白吸光度。

3 試驗結(jié)果

3.1 β消去反應(yīng)

β消去反應(yīng)是測定糖蛋白中糖肽鍵的傳統(tǒng)方法。蘇氨酸或絲氨酸與糖結(jié)合成的—O—型糖苷鍵可在堿性環(huán)境下被水解，發(fā)生消除反應(yīng)從而產(chǎn)生不飽和氨基酸，引起240 nm處吸光度升高[15]。如圖1所示，240 nm處的吸光度顯著升高，提示PBPC-Ⅱ中具有部分—O—型糖苷鍵相連。

圖1 PBPC-Ⅱ經(jīng)NaOH作用前后的紫外掃描圖

3.2 碘反應(yīng)

水、PBPC-Ⅱ溶液與碘反應(yīng)均呈黃色，無明顯顏色變化。提示PBPC-Ⅱ中不含有α-1, 4-糖苷鍵。如圖2所示，PBPC-Ⅱ與碘液的混合物最大吸收波長分別為365和368 nm，而565 nm處均無明顯吸收峰，表明PBPC-Ⅱ可能具有較長側(cè)鏈和多個分支。

圖2 PBPC-Ⅱ與碘液反應(yīng)的紫外掃描圖

3.3 紅外光譜分析

PBPC-Ⅱ紅外光譜圖見圖3，紅外信號數(shù)據(jù)見表1。據(jù)研究表明3 670～3 220，3 000～2 800，1 700～1 400及1 200～1 000 cm-1波數(shù)在多糖類的紅外光譜分析中均為多糖特征吸收峰，而800～1 300 cm-1能反映出碳水化合物分子的骨架特征，可用于多糖類物質(zhì)表面及空間結(jié)構(gòu)鑒定[16-17]。

如圖3所示，PBPC-Ⅱ在3 440 cm-1處的吸收峰是分子的氫鍵 O—H對稱伸縮產(chǎn)生的振動；2 924 cm-1及2 854 cm-1是甲基上的C—H伸縮的振動峰；1 748 cm-1是羧基上C==O對稱伸縮的振動峰，1 651 cm-1是羧基上C==O不對稱伸縮的振動峰，提示糖鏈中可能含有糖醛酸；1 542 cm-1處吸收峰是胺類N—H彎曲振動，表明可能具有綴合蛋白或氨基；1 411 cm-1是C—H變角的振動峰；1 245，1 145和1 076 cm-1附近吸收峰分別是由C—O或C—C伸縮振動的產(chǎn)生，同時1 076 cm-1為β-半乳糖的特征吸收峰，提示糖鏈中可能存在半乳糖[18]；1 017 cm-1處為吡喃C—O—C或C—O—H伸縮的振動產(chǎn)生；另外768 cm-1是吡喃環(huán)的吸收峰；897 cm-1處存在吸收峰提示多糖中β-糖苷鍵，且結(jié)構(gòu)中含有α-D-pyranosidic（C1—H）和β-D-pyranosidic（C1—H）[19]；875和813 cm-1處無明顯吸收蜂，提示PBPC-Ⅱ不含甘露糖，與單糖組成結(jié)果相符。研究的樣品為多糖類大分子化合物，根據(jù)IR分析得知，PBPC-Ⅱ為β構(gòu)型及吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)且含糖醛酸的多糖。

圖3 PBPC-Ⅱ紅外光譜圖

表1 PBPC-Ⅱ紅外信號數(shù)據(jù)

3.4 單糖組成

各單糖標準品混合后分別進行糖睛乙?；苌驡C-MS分析操作，結(jié)果見圖4。其特征離子及停留時間，見表2。依各標準單糖出峰保留時間，確定混合單糖中7類單糖的先后出峰順序，分別為鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、巖藻糖（Fuc）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glu）和半乳糖（Lac）。將多糖組分PBPC-Ⅱ水解衍生化后，同法操作上機GC-MS分析，結(jié)果見圖5。

依據(jù)表2中標準單糖停留時間得知，PBPC-Ⅱ由鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、木糖、葡萄糖及半乳糖構(gòu)成，摩爾比分別為1.40∶1.53∶1∶1.11∶2.79∶9.73。表明PBPC-Ⅱ組分為雜多糖。GC-MS分析提示半乳糖可能是PBPC-Ⅱ的主鏈構(gòu)成組分，而鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、木糖及葡萄糖相對含量較少，可能是PBPC-Ⅱ的支鏈構(gòu)成組分。

圖4 混合單糖總離子流圖

表2 7類單糖的停留時間及特征離子

圖5 PBPC-Ⅱ總離子流圖

3.5 PBPC-Ⅱ抗氧化活性研究

3.5.1 羥自由基清除作用

OH是一種活性氧存在形式，因其活性最強，所以可以直接穿過生命有機體細胞膜，與生物物質(zhì)反應(yīng)（如蛋白質(zhì)、DNA、RNA等），導致組織被破壞及細胞的持續(xù)死亡，造成生命有機體的生物損傷，從而引發(fā)各種疾病[20-21]。PBPC-Ⅱ?qū)αu自由基清除作用見圖6。在0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，PBPC-Ⅱ?qū)H的清除作用與濃度呈正比，且其清除能力大于VC，具有較強的清除作用。

圖6 PBPC-Ⅱ及VC對OH清除能力

3.5.2 超氧陰離子（O2-）清除作用

O2

-在人體內(nèi)存在一定數(shù)量，在其不發(fā)生化學變化時對人體無害，但是一旦與OH結(jié)合，就會形成聚合物，破壞組織及損傷細胞DNA，而導致人類機體機能失調(diào)引起疾病[22]。PBPC-Ⅱ?qū)2-的清除作用，結(jié)果見圖7。隨著多糖質(zhì)量濃度的升高，PBPC-Ⅱ和VC均對O2-具有顯著的清除能力，并且隨著質(zhì)量濃度的增加而增強，但PBPC-Ⅱ的清除能力明顯低于VC。

圖7 PBPC-Ⅱ及VC對O2-清除能力

3.5.3 DPPH清除作用

DPPH一般以穩(wěn)定自由基存在，其醇溶液在517 nm處有強吸收峰。當有抗氧化劑存在時，與其單電子配對使其自由基逐漸消失，并使517 nm處吸收減弱，可用分光光度計進行快速定量分析[23]。PBPC-Ⅱ?qū)PPH自由基清除試驗結(jié)果見圖8。PBPC-Ⅱ?qū)PPH自由基的清除作用隨著濃度的增大而提高，與VC相比，其對DPPH的清除能力雖然有一定差距，但也有顯著的清除作用。

圖8 PBPC-Ⅱ及VC對DPPH清除能力

4 結(jié)論

該試驗運用β消去反應(yīng)、碘顯色反應(yīng)、IR、GC-MS對PBPC-Ⅱ的結(jié)構(gòu)進行了初步分析。β消去反應(yīng)結(jié)果提示PBPC-Ⅱ中具有部分—O—型糖苷鍵相連；碘反應(yīng)結(jié)果表明PBPC-Ⅱ中不含有α-1, 4-糖苷鍵，其糖鏈上可能具有多個側(cè)支及較長支鏈；IR分析結(jié)果顯示PBPC-Ⅱ出現(xiàn)典型的多糖特征吸收峰，表明其為β構(gòu)型及吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)且含糖醛酸的多糖。GC-MS分析結(jié)果確定了PBPC-Ⅱ由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、葡萄糖及半乳糖構(gòu)成，其摩爾數(shù)之比為1.40∶1.53∶1∶1.11∶2.79∶9.73，半乳糖含量較多，可能是PBPC-Ⅱ的主鏈構(gòu)成組分，而鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、木糖及葡萄糖相對含量較少，可能是PBPC-Ⅱ的支鏈構(gòu)成組分。

通過對PBPC-Ⅱ抗氧化能力和自由基清除能力的研究，結(jié)果表明PBPC-Ⅱ具有不同程度的抗氧化及清除自由基能力，說明PBPC-Ⅱ具有良好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑。從以上試驗中也可以看出，PBPC-Ⅱ?qū)αu自由基、超氧陰離子以及DPPH的清除作用不盡相同，這可能與多糖組分PBPC-Ⅱ的化學結(jié)構(gòu)有關(guān)，需進一步在多糖構(gòu)效關(guān)系及抗氧化機制方面做深入研究[24]。綜上，針對PBPC-Ⅱ具有的較好的抗氧化及自由基清除能力，可進一步從細胞或動物模型上探究其抗腫瘤及其他生物活性，為全面系統(tǒng)研究紅花蜂花粉多糖并進一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。