宋少鵬 李文文 李進(jìn)興 馬秀嵐

中耳膽脂瘤是角化的鱗狀上皮和上皮下結(jié)締組織以及角蛋白碎片在中耳進(jìn)行性累積而成，伴或不伴有周圍組織的炎性反應(yīng)[1]。中耳膽脂瘤的發(fā)生是一個(gè)持續(xù)破壞性過(guò)程，侵蝕周圍骨結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致聽(tīng)力下降、前庭功能障礙、面神經(jīng)麻痹等相關(guān)并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，其形成的確切機(jī)制尚不清楚；雖然不同的研究已經(jīng)揭示了中耳膽脂瘤組織的骨質(zhì)破壞性和過(guò)度增殖行為，但關(guān)于細(xì)胞凋亡如何影響膽脂瘤生長(zhǎng)尚未達(dá)成一致意見(jiàn)，有學(xué)者認(rèn)為膽脂瘤上皮存在凋亡增強(qiáng)現(xiàn)象[2,3]，也有學(xué)者認(rèn)為膽脂瘤上皮的凋亡受到抑制[4,5]，因此，有必要對(duì)膽脂瘤上皮凋亡現(xiàn)象進(jìn)行深入研究。細(xì)胞凋亡是生理?xiàng)l件下細(xì)胞程序性死亡的一種形式，對(duì)于保持組織穩(wěn)態(tài)和胚胎發(fā)育必不可少。凋亡下調(diào)是腫瘤發(fā)生的主要原因，而上調(diào)也會(huì)誘導(dǎo)感染性疾病、自身免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病[6]，控制細(xì)胞凋亡是治療相關(guān)疾病的重要治療靶點(diǎn)[7]。促凋亡蛋白Bak、Bim和抗凋亡蛋白Mcl-1是Bcl-2家族的重要成員，本研究采用免疫組織化學(xué)和Tunel法檢測(cè)Bak、Bim和Mcl-1在中耳膽脂瘤中的表達(dá)水平，以探討其在膽脂瘤發(fā)生過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1中耳膽脂瘤及外耳道正常皮膚標(biāo)本的獲取 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳科2017年3月～2017年12月通過(guò)手術(shù)獲得的中耳膽脂瘤標(biāo)本40例(膽脂瘤組)，其中男17例，女23例,年齡8～83歲，平均42±20歲，病程6個(gè)月～60年；術(shù)后均經(jīng)病理診斷為中耳膽脂瘤。同時(shí)，手術(shù)中取19例患者外耳道深部正常皮膚作為對(duì)照組(術(shù)前已告知患者同意并簽署知情同意書(shū))，其中男11例，女8例；年齡13～83歲，平均45±17歲，病程6個(gè)月～50年。依據(jù)Hamed最新評(píng)分方法[8](表1)將膽脂瘤組分為骨質(zhì)破壞組21例(得分≥4分)和未破壞組19例(得分0～3分)。

表1 中耳膽脂瘤骨質(zhì)破壞評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2標(biāo)本染色方法

1.2.1免疫組化染色方法 標(biāo)本切片脫蠟水化后用3%H2O2在37 ℃溫箱條件下孵育30 min；PBS清洗5 min，3次；胰酶修復(fù)30 min，PBS浸泡5 min，3次；加山羊血清50 μl在37 ℃溫箱條件下孵育20 min；滴加適當(dāng)濃度的一抗50 μl/片，4 ℃過(guò)夜(至少18 h)。PBS沖洗5 min，3次，滴加二抗50 μl/片，37 ℃溫箱條件下孵育20 min；PBS洗5 min，3次；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶，37 ℃20 min；PBS浸泡5 min，3次；DAB著色，鏡下控制，蒸餾水中斷反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。PBS取代一抗作陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照用已知的陽(yáng)性片。

1.2.2Tunel染色方法 石蠟切片脫蠟，水化；胰酶修復(fù)20 min，PBS浸泡5 min，3次；3%過(guò)氧化氫室溫避光靜置10 min，PBS洗片5 min，3次，滴加Tunel反應(yīng)緩沖液，37 ℃，避光孵育80 min，PBS洗片5 min，3次。滴加過(guò)氧化物酶轉(zhuǎn)換緩沖液，37 ℃孵育30 min，PBS洗片5 min，3次；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。陽(yáng)性對(duì)照組織滴加50 μl陽(yáng)性對(duì)照緩沖液，陰性對(duì)照的組織滴加不含10×酶試劑 的Tunel反應(yīng)緩沖液(45 μl 1×底物標(biāo)記試劑與5 μl去離子水混合)。

1.3結(jié)果判定 鏡下觀察Bak、Bim和Mcl-1蛋白著色情況，以細(xì)胞質(zhì)著棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片在400倍物鏡下選取互不重疊的5個(gè)視野，使用Image Pro Plus6.0軟件，測(cè)量每張切片的積分光密度和測(cè)量區(qū)域面積，平均光密度=積分光密度/測(cè)量區(qū)域面積(反映免疫反應(yīng)物的表達(dá)強(qiáng)度)。Tunel染色陽(yáng)性結(jié)果表現(xiàn)為核呈棕黃色、核固縮，形狀不規(guī)則，細(xì)胞凋亡程度以凋亡指數(shù)(100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞比例)表示。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩兩比較采用Pearson相關(guān)分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Bak在膽脂瘤和外耳道皮膚中均有表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在膽脂瘤全層表達(dá)(圖1)，而在外耳道皮膚中主要表達(dá)于顆粒層和角質(zhì)層(圖2)，在膽脂瘤中的表達(dá)強(qiáng)度高于外耳道皮膚。Bim在膽脂瘤和外耳道皮膚中均有表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在膽脂瘤全層彌漫性表達(dá)(圖3)，而在外耳道皮膚中散在表達(dá)于顆粒層和角質(zhì)層(圖4)。Mcl-1在膽脂瘤和外耳道皮膚中均有表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在膽脂瘤中從基底層到角質(zhì)層表達(dá)逐漸增強(qiáng)(圖5)，而在外耳道皮膚中散在表達(dá)(圖6)，在膽脂瘤中的表達(dá)強(qiáng)度高于外耳道皮膚。

圖1 Bak在膽脂瘤組織中的表達(dá) (SP法×400)圖2 Bak在外耳道皮膚組織中的表達(dá) (SP法×400)圖3 Bim在膽脂瘤組織中的表達(dá) (SP法×400)圖4 Bim在外耳道皮膚組織中的表達(dá) (SP法×400)圖5 Mcl-1在膽脂瘤組織中的表達(dá) (SP法×400)圖6 Mcl-1在外耳道皮膚組織中的表達(dá) (SP法×400)圖7 凋亡細(xì)胞在膽脂瘤組織中的表達(dá) (Tunel法×400)圖8 凋亡細(xì)胞在外耳道皮膚組織中的表達(dá) (Tunel法×400)

膽脂瘤組和對(duì)照組Bak、Bim和Mcl-1表達(dá)的平均光密度值見(jiàn)表2，可見(jiàn)， 膽脂瘤組的Bak、Bim和Mcl-1的平均光密度值明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

表2 膽脂瘤組和對(duì)照組Bak、Bim和Mcl-1的表達(dá)

骨質(zhì)破壞組和未破壞組Bak、Bim和Mcl-1表達(dá)的平均光密度值見(jiàn)表3，可見(jiàn)，Mcl-1在骨質(zhì)破壞組的蛋白表達(dá)量低于未破壞組(P<0.05)，而B(niǎo)ak和Bim在兩組間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 骨質(zhì)破壞組和未破壞組的Bak、Bim和Mcl-1表達(dá)

經(jīng)Pearson相關(guān)分析，中耳膽脂瘤組織中Bak和Mcl-1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.484,P<0.01)，在中耳膽脂瘤組織中Bim和Mcl-1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.466,P<0.01)，中耳膽脂瘤組織中Bim和Bak的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.995,P<0.01)。

Tunel染色顯示在膽脂瘤組和對(duì)照組均有細(xì)胞凋亡，在正常外耳道皮膚中，凋亡細(xì)胞較稀疏，主要位于顆粒層；在膽脂瘤上皮中，在上皮全層均有大量凋亡細(xì)胞，凋亡指數(shù)明顯升高，兩組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表4)，骨質(zhì)破壞組和未破壞組的凋亡指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表5)。

表4 膽脂瘤組和對(duì)照組Tunel凋亡指數(shù)比較

表5 骨質(zhì)破壞組和未破壞組Tunel凋亡指數(shù)比較

3 討論

Bcl-2家族成員的特點(diǎn)是至少含有1個(gè)Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域(Bcl-2 homology domain ，BH)，根據(jù)它們?cè)诩?xì)胞凋亡中的功能和擁有BH結(jié)構(gòu)域的數(shù)量分為三組：①抗凋亡Bcl-2蛋白(Bcl-2，Bcl-xL和Mcl-1)，含BH1-BH4四個(gè)結(jié)構(gòu)域，通過(guò)結(jié)合促凋亡蛋白抑制細(xì)胞凋亡；②多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白(Bax和Bak)，含BH1-BH4結(jié)構(gòu)域，可直接促進(jìn)線粒體外膜通透性改變；③僅含BH-3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白(Bid和Bim)[9]。

Bim在生理和病理生理?xiàng)l件下是啟動(dòng)內(nèi)在凋亡途徑的必需促凋亡蛋白[10]。Singh等[11]研究發(fā)現(xiàn)Bim與抗凋亡的Mcl-1結(jié)合而不與Bcl-2或Bcl-XL結(jié)合；中斷Mcl-1和Bak之間的相互作用，導(dǎo)致Bak從Mcl-1解離，并激活Bak[12]，引起線粒體外膜通透性改變、細(xì)胞色素C釋放和內(nèi)在細(xì)胞凋亡途徑活化[13]。Bim與Mcl-1的結(jié)合穩(wěn)定了后者[14]，Bim解離導(dǎo)致促凋亡Bim和抗凋亡Mcl-1兩者去穩(wěn)定化，這是決定細(xì)胞是否凋亡的效應(yīng)。從本研究結(jié)果看，促凋亡的Bak和Bim蛋白以及抑制凋亡的Mcl-1蛋白在膽脂瘤中的表達(dá)均明顯高于正常皮膚，同時(shí)Tunel染色結(jié)果表明與正常皮膚相比，膽脂瘤凋亡明顯增加，與Juhasz等[15]研究結(jié)果一致，說(shuō)明在膽脂瘤中促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白之間可能出現(xiàn)了平衡紊亂，使細(xì)胞過(guò)度增殖的同時(shí)凋亡也加速，從而引起膽脂瘤的形成，這也可能是膽脂瘤不像惡性腫瘤一樣無(wú)限增殖的原因之一。也有學(xué)者認(rèn)為膽脂瘤中凋亡受到抑制[4,5]，可能與膽脂瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程是多基因相互作用共同完成而非相互獨(dú)立有關(guān)；本研究結(jié)果顯示Bak、Bim和Mcl-1在中耳膽脂瘤組織中的表達(dá)之間兩兩呈正相關(guān)，但Bak、Bim與Mcl-1的相關(guān)系數(shù)較低，考慮可能的原因?yàn)锽ak、Bim與Mcl-1之間可能不是直接相互作用，而是通過(guò)其它蛋白起間接調(diào)控作用,凋亡的調(diào)控是多基因共同作用的，多通路共同介導(dǎo)，可能對(duì)蛋白與蛋白之間的相互作用產(chǎn)生一定的影響,還可能與樣本含量不足以及個(gè)體差異性有關(guān)。

膽脂瘤骨質(zhì)破壞是由多種因素造成的，如：上皮增生、細(xì)菌感染、鼓室壓力增加、破骨細(xì)胞活化、酸度增加、骨破壞酶活性升高、炎性介質(zhì)等[16]。既往主導(dǎo)理論認(rèn)為破骨細(xì)胞在骨吸收中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]，但最近研究揭示破骨細(xì)胞不參與膽脂瘤的骨質(zhì)破壞過(guò)程[18,19]，而膽脂瘤的角蛋白碎片和上皮細(xì)胞呈弱酸性[20]，且上皮細(xì)胞的通透性與正常皮膚相比增加[21],故推測(cè)膽脂瘤上皮的酸泄露可能是造成骨質(zhì)脫鈣和骨質(zhì)吸收的主要原因[22]。從本研究結(jié)果看，Mcl-1在骨質(zhì)破壞組的表達(dá)低于未破壞組，說(shuō)明Mcl-1可能與膽脂瘤的骨質(zhì)吸收有關(guān)，結(jié)合上述其他學(xué)者的研究，推測(cè)其可能機(jī)制為促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白之間的平衡紊亂，使中耳膽脂瘤上皮凋亡增加，導(dǎo)致角蛋白鱗屑大量堆積，以及慢性炎癥引起黏膜肥厚，粘稠分泌物聚集，使中耳內(nèi)通風(fēng)引流通道[23]阻塞,組織缺氧，而缺氧不僅可刺激缺氧誘導(dǎo)因子使基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生，引起骨質(zhì)破壞[24]，也可導(dǎo)致微血管閉塞，引起細(xì)胞凋亡[25]，從而導(dǎo)致惡性循環(huán)；也可能與逐漸增大的膽脂瘤使中耳壓力不斷增高，從而導(dǎo)致壓力性骨質(zhì)壞死和細(xì)胞因子激活造成骨質(zhì)破壞[26]有關(guān)。但文中結(jié)果顯示，Tunel染色細(xì)胞凋亡在骨質(zhì)破壞組與未破壞組之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與Juhasz等[15]研究不同，他們發(fā)現(xiàn)非破壞性膽脂瘤中的細(xì)胞凋亡高于破壞性膽脂瘤，推測(cè)可能與樣本含量不足及國(guó)內(nèi)外患者的個(gè)體差異有關(guān)，今后需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入研究。

綜上所述，Bak、Bim和Mcl-1在中耳膽脂瘤中的異常表達(dá)可能與膽脂瘤上皮的高凋亡相關(guān)，且 Mcl-1可能與膽脂瘤的骨質(zhì)破壞有關(guān)。迄今為止，膽脂瘤并無(wú)有效藥物治療，只能手術(shù)切除且術(shù)后復(fù)發(fā)較常見(jiàn)，因此，找到凋亡調(diào)控通路中某些關(guān)鍵分子作為“靶點(diǎn)”，促使開(kāi)展相應(yīng)藥物治療，可為干預(yù)膽脂瘤的發(fā)展提供新的思路。