馬明明，梁娟麗，蘇新科，杜 茹

西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西西安 710048

鄰甲氧基苯胺(o-methoxyaniline, OMA)又稱2-甲氧基苯胺，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1．作為醫(yī)藥和化工原料，OMA經(jīng)常被用于合成高分子聚合物和染料等．但由于OMA具有潛在的致癌性，已被列入24種潛在致癌芳香胺中，因此，對OMA的日常監(jiān)測非常重要．目前采用的方法主要有分光光度法[1]、氣質(zhì)聯(lián)用[2]和高效液相色譜法[3]等．然而，分光光度法的選擇性較差、靈敏度較低；色譜儀器本身昂貴且檢測周期長、檢測過程操作繁瑣．因此，探索檢測靈敏度高、選擇性好、操作簡便的OMA檢測方法勢在必行．

圖1 鄰甲氧基苯胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecularly structure of OMA

零流電位法是導(dǎo)電材料兩端分別與工作電極和輔助電極相端口連接，與參比電極同時(shí)浸入溶液后組成新的檢測回路，對其施加線性掃描電位后，根據(jù)其I-E曲線上I=0時(shí)的電位值(即零流電位EZCP)[4]進(jìn)行測量的一種新型檢測技術(shù)．目前，零流電位法已經(jīng)用于測定4-氨基偶氮苯[5]、 鄰甲苯胺[6]、 聯(lián)苯胺[7]、 pH值[8-11]、 脫氧核糖核酸[12]和人血清蛋白[13]． 此外，零流電位法還可以研究物質(zhì)之間的相互作用[14-16]及在滴定法中的應(yīng)用[17-18]等．

分子印跡技術(shù)是采用人工方法制備具有特定空間結(jié)構(gòu)空穴，對特定分子(印跡分子和模板分子)具有專一識別及結(jié)合作用的印跡聚合物(molecularly imprinted polymer, MIP)的技術(shù)．當(dāng)模板分子與功能單體接觸時(shí)會(huì)形成多重作用點(diǎn)，聚合過程使這種作用點(diǎn)被記憶，除去模板分子后，聚合物中形成了與模板分子空間結(jié)構(gòu)型相匹配的具有多重作用點(diǎn)的空穴，這些印跡空穴對模板分子具有特定識別與選擇性．將制備出的印跡聚合物修飾在電極表面，可以高選擇檢測血清的四環(huán)素(tetracycline，TC)[19]、胰島素[20]、雙酚A[21]、環(huán)境介質(zhì)中的甲基對硫磷[22]，以及藥物沙丁胺醇[23]、蘆丁[24]和三聚氰胺[25]等．

此外，石墨烯等新型納米材料也被應(yīng)用在MIP電化學(xué)傳感器的制備中，以增強(qiáng)電極界面電子傳遞速率，提高傳感器靈敏度．DUAN等[26]采用硅烷化磁性氧化石墨烯分子印跡聚合物制備電化學(xué)傳感器檢測多巴胺的選擇性發(fā)光；LI等[27]采用磁性石墨烯印跡傳感器測定日落黃；XIE等[28]采用石墨烯分子印跡電化學(xué)傳感器測定谷物中的噻蟲嗪；XIA等[29]基于殼聚糖/離子液體-石墨烯復(fù)合材料修飾的分子印跡電化學(xué)生物傳感器測定牛血清白蛋白；ENSAFI等[30]用石墨烯量子點(diǎn)印跡聚合物電化學(xué)傳感器測定甲硝唑．

鑒于此，本研究在石墨烯修飾的鉛筆芯電極表面(graphene-modified pencil electrode，G-PEC)，采用電聚合方式制備出OMA分子印跡聚合物零流電位傳感器(OMA-MIP-modified G-PEC，即OMA-MIP/G-PEC)，如圖2．通過MIP與模板分子OMA的重新印跡結(jié)合吸附引起傳感器零流電位的變化檢測OMA濃度．

圖2 MIP電極制備過程Fig.2 Preparation process of MIP electrode

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

支持電解質(zhì)為PBS(phosphate buffer solution)緩沖溶液(Na2HPO4-KH2PO4)；4-氨基聯(lián)苯、4-氨基偶氮苯和對氯苯胺均購自阿拉丁試劑網(wǎng)；2,4-二甲基苯胺和OMA購自西亞試劑網(wǎng)；丙烯酸和胭脂紅購自中國天津市福晨化學(xué)試劑廠；聯(lián)苯胺購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司．鄰甲苯胺購自上海山撲化工有限公司；丙烯酰胺購自天津市紅巖化學(xué)試劑廠；石墨烯購自杭州格藍(lán)豐納米科技有限公司；以上試劑均為分析純．試驗(yàn)所用水均為二次蒸餾水．2B鉛筆芯購自中國第一鉛筆制造公司．CHI610D型電化學(xué)工作站購自中國上海辰華儀器廠；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司．電聚合采用三電極系統(tǒng)：飽和甘汞電極為參比電極(saturated calomel electrode，SCE)，鉑電極為輔助電極，鉛筆芯電極為工作電極．

1.2 鄰甲氧基苯胺印跡聚合物石墨烯修飾鉛筆芯電極的制備

具體制備步驟如下：① 將預(yù)處理過的鉛筆芯先浸入0.50 mg/mL石墨烯水分散液10 min后，用二次蒸餾水沖洗電極表面的殘液，晾干；② 將處理后的鉛筆芯浸入0.50 mg/mL石墨烯石蠟分散液，10 min后取出用二次蒸餾水洗滌，電極表面干燥后即成為石墨烯修飾的鉛筆芯電極G-PEC；③ 將G-PEC置入PBS溶液(pH=7.38，含4.00×10-3mol/L OMA和1.60×10-2mol/L丙烯酰胺)中，掃描電位范圍為-1.2～1.2 V，以0.1 V/s掃描速率循環(huán)掃描16圈；④ 用二次蒸餾水清洗數(shù)次后，再將其置于無水乙醇中超聲波清洗4 min，即可得OMA-MIP/G-PEC．

非印跡電極OMA-NMIP/G-PEC制備方法同上，但沒有模板分子OMA．

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

按圖3方式，將OMA-MIP/G-PEC串聯(lián)并入CHI610D電化學(xué)工作站的工作電極端和輔助電極端，以飽和甘汞電極為參比電極，構(gòu)建成一個(gè)檢測回路，OMA-MIP/G-PEC在一定濃度的OMA溶液中靜置4 min后再進(jìn)行線性掃描，記錄I-E曲線中的EZCP． 每次測試完后將電極置于無水乙醇中超聲波清洗4 min，以備下次使用．

TRE為參比電極的端口；TWE為工作電極；TCE為輔助電極圖3 OMA-MIP/G-PEC零流電位傳感器示意圖Fig.3 Diagram of OMA-MIP/G-PEC interfacial potentiometry with double poles sensor

2 結(jié)果與討論

2.1 OMA-MIP制備條件的優(yōu)化

2.1.1 掃描電位范圍和模板分子濃度的優(yōu)化

OMA-MIP的印跡空穴能印跡吸附OMA，而裸電極沒有這樣的印跡吸附作用，界面電位與印跡電極自然不同，因此，可通過求出兩種電極的零流電位差值(ΔEZCP)優(yōu)化制備條件．ΔEZCP越大，說明印跡電極的印跡識別結(jié)合性越好．因此，本研究取ΔEZCP的最大值作為優(yōu)化的最佳指標(biāo).

掃描電位范圍和OMA濃度會(huì)影響印跡聚合物的印跡位點(diǎn)數(shù)量，繼而影響印跡電極對OMA的選擇性識別. 考察了掃描電位范圍分別為-0.60～0.60、-0.80～0.80、-1.00～1.00、-1.20～1.20、-1.40～1.40、-1.60～1.60和-1.80～1.80 V時(shí)，ΔEZCP的變化，結(jié)果如圖4．由圖4還可見，隨著掃描電位范圍的增大，ΔEZCP逐漸增加，并在-1.2～1.2 V處達(dá)到最大；當(dāng)超出-1.2～1.2 V后， ΔEZCP逐漸變小，因此，最佳掃描電位范圍為-1.2～1.2 V．圖4也顯示，OMA濃度為6.00×10-4～1.00×10-2mol/L時(shí)對ΔEZCP的影響．由圖4可見，當(dāng)OMA濃度為6.00×10-4～4.00×10-3mol/L時(shí)，隨OMA濃度增加，ΔEZCP相應(yīng)增大，在4.00×10-3mol/L處ΔEZCP達(dá)到最大值；但當(dāng)OMA濃度大于4.00×10-3mol/L，隨著濃度增加， ΔEZCP反而下降， 因而聚合反應(yīng)中OMA的濃度選擇為4.00×10-3mol/L．

圖4 掃描電位范圍和OMA濃度對ΔEZCP的影響Fig.4 Effects of scan potential range and concentration of OMA on ΔEZCP

2.1.2 功能單體、模板分子配比和掃描圈數(shù)的優(yōu)化

功能單體與模板分子的配比對印跡電極上印跡聚合物的形狀和印跡位點(diǎn)數(shù)起決定性的作用．印跡聚合物厚度直接影響傳感器的穩(wěn)定性和靈敏度，而厚度可以由掃描圈數(shù)控制．當(dāng)OMA與丙烯酰胺濃度配比為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8和1∶10時(shí)，印跡聚合物ΔEZCP的變化及掃描圈數(shù)對ΔEZCP的影響如圖5．由圖5可知，當(dāng)配比為1∶4時(shí)，ΔEZCP達(dá)到最大值，因此，最佳配比是1∶4；當(dāng)掃描圈數(shù)為6～16圈時(shí)，ΔEZCP逐漸增加并在16圈時(shí)達(dá)到最大，但超過16圈時(shí)，ΔEZCP開始下降，因此，最佳掃描圈數(shù)是16圈．

圖5 OMA與丙烯酰胺的濃度配比和 循環(huán)圈數(shù)對ΔEZCP的影響Fig.5 The influence of molar concentration (OMA and acrylamide) and scan cycles on ΔEZCP

2.1.3 PBS pH值和洗脫時(shí)間的優(yōu)化

模板分子與功能單體在聚合反應(yīng)中的結(jié)合受緩沖溶液pH值影響較大．PBS溶液pH值分別為5.91、6.24、6.47、6.98、7.38和7.73時(shí)，對ΔEZCP的影響結(jié)果如圖6．由圖6可見，當(dāng)PBS溶液的pH<7.38時(shí)，ΔEZCP隨pH值增加逐漸增加，而當(dāng)PBS的pH>7.38時(shí)，ΔEZCP隨pH值的增加卻減小，因此，pH=7.38為最優(yōu)值．

圖6 pH值和洗脫時(shí)間對ΔEZCP的影響Fig.6 The influence of pH and elution time on ΔEZCP

洗脫過程就是去除模板分子，使有效識別位點(diǎn)得以釋放，從而獲得與模板分子結(jié)構(gòu)和空間相同的三維空隙，而洗脫時(shí)間會(huì)影響分子印跡聚合物上的三維空隙．考察了洗脫時(shí)間為1～6 min時(shí)對ΔEZCP的影響．從圖6可見，在2～6 min內(nèi)，當(dāng)洗脫時(shí)間小于4 min時(shí)，ΔEZCP隨洗脫時(shí)間的延長而增大；超過4 min后ΔEZCP幾乎不變，說明此時(shí)在印跡聚合物上的有效位點(diǎn)吸附OMA已達(dá)到飽和，因此，洗脫時(shí)間選擇為4 min．

2.2 印跡傳感器的伏安性能

2.2.1 三種傳感器的比較

為考察印跡傳感器的伏安特性，本研究分別考察了OMA在OMA-MIP/G-PEC、OMA-NMIP/G-PEC和G-PEC上的氧化還原反應(yīng)，圖7是濃度為5.00 μmol/L的OMA在上述3種電極上的循環(huán)伏安曲線．如圖7曲線a，OMA在OMA-MIP/G-PEC上有一個(gè)顯著的氧化峰，峰電流大約是2.57×10-4A，這是因?yàn)镺MA-MIP/G-PEC上含有大量與OMA模板分子形狀匹配、大小適合且有相互作用功能基團(tuán)的三維空隙，使溶液中的OMA很容易被選擇性印跡吸附到電極表面的空穴中發(fā)生氧化反應(yīng)；而非印跡聚合物電極(曲線b)上并沒有印跡空穴，只是非印記聚合物的存在增大了電極面積，使少量OMA可以發(fā)生氧化反應(yīng)，因此氧化峰電流很??；裸石墨烯修飾鉛筆芯電極相比前兩個(gè)電極，電子傳遞速率相對較低，因而沒有觀察到OMA的氧化峰(曲線c)．

圖7 OMA-MIP/G-PEC、OMA-NMIP/G-PEC 和 G-PEC分別在含5.00 μmol/L OMA、 pH=7.38 PBS中的循環(huán)伏安曲線Fig.7 Cyclic voltammograms of OMA-MIP/G-PEC, OMA-NMIP/G-PEC and G-PEC in PBS, pH=7.38 containing 5.00 μmol/L OMA

2.2.2 OMA-MIP/G-PEC的多次超聲清洗差分脈沖伏安曲線

為說明多次超聲清洗對OMA-MIP/G-PEC的影響，用同一根OMA-MIP/G-PEC連續(xù)9次超聲清洗后分別測4.00×10-3mol/L OMA的差分脈沖伏安曲線的變化，結(jié)果見圖8．由圖8可見，清洗9次后，氧化峰電位基本不變．9次峰電流值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)是3.35%，說明OMA-MIP/G-PEC精密度好，可多次超聲清洗不影響傳感器的反復(fù)使用．

圖8 九次超聲清洗后，OMA-MIP/G-PEC在含4.00× 10-3 mol/L OMA、pH=7.38的PBS溶液中的 差分脈沖伏安曲線Fig.8 Differential pulse voltammetry curves of OMA-MIP/G-PEC in PBS, pH=7.38 containing 4.00× 10-3 mol/L OMA with 9 successive ultrasonic elution

2.3 OMA-MIP/G-PEC選擇性

印跡容量表示分子聚合物對底物分子的吸附結(jié)合性大小[31]. 本研究印跡容量計(jì)算式為

印跡容量=ΔE/E0

(1)

其中， ΔE為OMA-MIP/G-PEC在OMA中的EZCP與在空白PBS中EZCP的差值；E0表示該電極在空白PBS中的EZCP．考察了OMA-MIP/G-PEC在OMA及其結(jié)構(gòu)相近物質(zhì)，如4-氨基甲苯(p-toluidine， PTD)、對氨基偶氮苯(4-aminoazobenzene，4-AAB)、 4-氯苯胺(p-chloroaniline， PCA)、 鄰甲苯胺(o-toluidine， OT)、 鄰聯(lián)甲苯胺(o-tolidine，OTD)、 聯(lián)苯胺(benzidine， BZ)和胭脂紅(carmine， CME)中的印跡容量，計(jì)算結(jié)果見圖9．由圖9可知，OMA-MIP/G-PEC在OMA中的印跡容量最大，說明OMA-MIP含有與OMA形狀匹配、大小相同的三維空隙，可以對OMA產(chǎn)生選擇性強(qiáng)的印跡吸附，能夠?qū)⒋罅咳芤褐械腛MA吸附到印跡空穴內(nèi)；而對其他幾種結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)由于沒有印跡吸附作用，只是非印跡吸附，因而印跡容量要比OMA小得多.

圖9 不同物質(zhì)在OMA-MIP/G-PEC印跡容量Fig.9 The imprinting capacity of different substance on OMA-MIP/G-PEC

2.4 分析應(yīng)用

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限

考察OMA-MIP/G-PEC對不同濃度OMA的零流電位響應(yīng)．圖10(a)為OMA-MIP/G-PEC在不同濃度OMA溶液中的I-Eapp曲線,Eapp為表觀界面電位．如圖10(a)，隨OMA濃度的加大，EZCP正移，當(dāng)OMA的濃度為0.001～50.00 μmol/L時(shí)，EZCP與OMA濃度的對數(shù)lg [c(OMA)]呈線性關(guān)系，即

EZCP=-0.025 67 lg[c(OMA)]-0.104 05

(2)

其中，c(OMA)為OMA濃度；R為相關(guān)系數(shù)，R=0.99；n為樣品個(gè)數(shù)，n=10． 如圖10(b)，檢測限為0.64 nmol/L (3σ/k)．

圖10 OMA-MIP/G-PEC在不同c(OMA)中的 I-Eapp曲線及EZCP與lg[c(OMA)]的線性關(guān)系曲線Fig.10 I-Eapp curves of OMA-MIP/G-PEC in OMA solutions with different concentrations and the linear plot of EZCP and lg [c(OMA)]

2.4.2 OMA-MIP/G-PEC的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

用5根OMA-MIP/G-PEC分別檢測10.00 nmol/L的OMA，結(jié)果表明，5次測量的EZCP相對標(biāo)準(zhǔn)偏差是1.45%，因此傳感器的重現(xiàn)性好；用同一根OMA-MIP/G-PEC每隔2 d測試10.00 nmol/L的OMA，連續(xù)10次測量的EZCP的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.95%，可見傳感器穩(wěn)定性好．

2.4.3 干擾試驗(yàn)

考察了廢水中可能存在與OMA結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)及金屬陽離子對OMA-MIP/G-PEC測定OMA的影響，試驗(yàn)結(jié)果見表1．從表1可見，4-AAB、CME、PCA、OT、OTD、BZ及二價(jià)金屬離子Cu2+、Mg2+和K+不干擾OMA測定，因而OMA-MIP/G-PEC選擇性好．

2.4.4 樣品測定

用加標(biāo)實(shí)驗(yàn)測定含有OTD、PCA、OT、BZ、CME和4-AAB的廢水樣品中的OMA濃度，結(jié)果見表2．從表2可見，平均回收率為95.20%～105.72%，結(jié)果滿意．

表1 不同干擾物質(zhì)對OMA測定的影響

表2 廢水樣品中OMA濃度測定結(jié)果

結(jié) 語

綜上研究表明，在零流電位法下，采用電聚合法制備的OMA-MIP/G-PEC傳感器，可以借助OMA-MIP的印跡空穴，對模板分子OMA的特異選擇性印跡吸附所引發(fā)的零流電位變化，監(jiān)測廢水中痕量OMA．本傳感器除靈敏度高、選擇性好外，還具有穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好、操作簡單的優(yōu)異性能，未來有望進(jìn)一步檢測其他復(fù)雜體系中的OMA．