柏力萄，魏 璠，魏軍平

（中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 北京 100053）

甲狀腺功能減退癥（hypothyroidism，簡稱甲減）是由于甲狀腺激素合成和分泌減少或組織利用不足導(dǎo)致的全身代謝減低綜合征[1]。歐洲甲減的患病率在0.2%至5.3%之間[2,3]。美國甲減的患病率在0.3%至3.7%左右[4]。2010年中國十城市甲狀腺疾病患病率調(diào)查顯示甲減的患病率為17.8%[5]。由于社會(huì)壓力的增大、環(huán)境污染加劇、高碘飲食的攝入等因素，甲減的發(fā)病率逐年升高，成為影響人類健康的隱患[6]。患者主要表現(xiàn)以代謝率減低和交感神經(jīng)興奮性下降為主,臨床可出現(xiàn)畏寒、乏力、手足腫脹感、嗜睡、記憶力減退等癥狀[7]。近幾年中醫(yī)對本病的研究報(bào)告在不斷增加，中藥對甲減的治療取得一定的效果[8,9]。甲減與中醫(yī)學(xué)“癭勞”相類似。常由先天稟賦不足、飲食不節(jié)、藥物所傷、情志失調(diào)、勞逸過度等因素引起。病位在頸部，主要涉及肝、脾、腎三臟。脾氣虛為甲減發(fā)病的主要病機(jī)之一。脾氣虧損，則癥見畏寒肢冷，食少、腹脹、大便溏薄或下肢浮腫，或婦女帶下量多，舌淡苔白潤脈沉緩無力，臨床多以補(bǔ)中益氣湯加減。

補(bǔ)中益氣湯出自《內(nèi)外傷辨惑論》（元·李東垣），由黃芪、甘草、人參、升麻、柴胡、當(dāng)歸、白術(shù)、陳皮組成，具有補(bǔ)中益氣，升陽舉陷之功。臨床應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)研究均表明，經(jīng)典名方補(bǔ)中益氣湯具有改善甲減患者臨床癥狀、體征，減少西藥用量，提高患者生活質(zhì)量等作用[10,11]。補(bǔ)中益氣法在甲減心肌損傷的修復(fù)中起著重要作用,其機(jī)制與其提高心肌α-MHC mRNA的表達(dá)、降低β-MHC mRNA的表達(dá)有關(guān)[12]，并能通過下調(diào)Fas、FasL及Caspase-3的表達(dá)，降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，對甲減的心肌損害有保護(hù)作用[13]。在甲減腎損害動(dòng)物模型中，補(bǔ)中益氣湯能夠促進(jìn)VEGF分泌，VEGF升高對甲減腎損害具有保護(hù)作用[14]。自身免疫甲狀腺炎是引起甲減的原因之一，補(bǔ)中益氣湯可能通過抑制miR-155/SOCS1/STAT3信號通路減少炎癥因子釋放，從而有效改善自身免疫甲狀腺炎免疫失常狀態(tài)，對甲狀腺組織具有保護(hù)作用[15]。但目前缺乏對補(bǔ)中益氣湯活性成分及其機(jī)制的研究。中藥整合藥理學(xué)計(jì)算平臺(tái)（TCMIP，www.tcmip.cn）是以中藥方劑數(shù)據(jù)庫、中藥材數(shù)據(jù)庫、中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫、疾病癥狀靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫為支撐，以人工智能、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)科學(xué)等為手段，從整體角度研究中藥復(fù)方與疾病間的關(guān)聯(lián)性，能有效地揭示藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制，目前廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量評價(jià)、中藥臨床重定位、中醫(yī)原創(chuàng)思維揭示、方劑配伍的分子機(jī)制、中藥新藥研發(fā)等各個(gè)研究領(lǐng)域[16]。為更好地開發(fā)經(jīng)典名方補(bǔ)中益氣湯，本研究借助TCMIP篩選其主要活性成分和作用靶點(diǎn)，對于闡明其治療甲減的分子機(jī)制、進(jìn)一步利用補(bǔ)中益氣湯具有十分重要的意義。

1 材料和方法

1.1 補(bǔ)中益氣湯化學(xué)成分的篩選

通過整合藥理學(xué)平臺(tái)V1.0中藥材數(shù)據(jù)庫，對補(bǔ)中益氣湯中的柴胡、陳皮、當(dāng)歸、甘草、黃芪、人參和升麻進(jìn)行檢索，收集所有藥材化學(xué)成分，構(gòu)建補(bǔ)中益氣湯化學(xué)成分庫。

1.2 補(bǔ)中益氣湯及甲減癥靶標(biāo)預(yù)測

通過整合藥理學(xué)平臺(tái)的“中藥靶標(biāo)預(yù)測”模塊，篩選補(bǔ)中益氣湯中化學(xué)成分相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。該平臺(tái)采用二維結(jié)構(gòu)相似性搜索，結(jié)合MACCS分子指紋，并通過OpenBabel軟件進(jìn)行化學(xué)指紋特征的提取，基于Tanimoto系數(shù)定義的相似度計(jì)量方法，與DrugBank數(shù)據(jù)庫中的小分子化合物和FDA上市的藥物進(jìn)行相似性打分，并提取作用靶標(biāo)。共性靶標(biāo)越多，說明中藥間協(xié)同作用可能越強(qiáng)。在平臺(tái)的“疾病靶標(biāo)信息”設(shè)定界面，以“hypothyroidism”作為疾病或癥狀關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，即可獲得甲減的已知治療靶點(diǎn)，作為候選的疾病靶標(biāo)。在“中藥靶標(biāo)預(yù)測”界面選擇相似性分?jǐn)?shù)≥0.8的所有靶標(biāo)作為補(bǔ)中益氣湯的潛在靶標(biāo)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

基于藥物靶標(biāo)和疾病、癥狀靶標(biāo)之間相互作用關(guān)系，采用整合藥理學(xué)平臺(tái)網(wǎng)絡(luò)分析模塊，構(gòu)建補(bǔ)中益氣湯靶標(biāo)與甲減靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖，網(wǎng)絡(luò)通過hub節(jié)點(diǎn)連接，以“節(jié)點(diǎn)連接度（degree）”的2倍中位數(shù)為卡值，選取補(bǔ)中益氣湯候選靶標(biāo)-甲減候選靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)（hubs）；在構(gòu)建關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)子網(wǎng)的基礎(chǔ)上，以“degree”、“節(jié)點(diǎn)緊密度（closeness）”和“節(jié)點(diǎn)介度（betweenness）”的中位數(shù)為卡值，選取同時(shí)滿足3個(gè)卡值的節(jié)點(diǎn)為補(bǔ)中益氣湯潛在靶標(biāo)-甲減靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)；進(jìn)而，通過對上述藥物候選靶標(biāo)所參與的功能和通路進(jìn)行富集分析，可進(jìn)一步挖掘補(bǔ)中益氣湯治療甲減的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)，及其對應(yīng)的活性成分和中藥，并構(gòu)建“中藥方劑-中藥材-化學(xué)成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路-疾病關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)”的多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖，明確補(bǔ)中益氣湯的作用機(jī)制，在整合藥理學(xué)平臺(tái)點(diǎn)擊網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析可得到相應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)圖。

表1 “中藥-成分-靶標(biāo)”基本信息

1.4 基因功能和通路富集分析

為了進(jìn)一步挖掘上述網(wǎng)絡(luò)計(jì)算篩選獲得補(bǔ)中益氣湯核心靶標(biāo)的功能，采用整合藥理學(xué)平臺(tái)基因本體數(shù)據(jù)庫（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫，提取靶標(biāo)基因或蛋白質(zhì)的分子功能（molecular function）、細(xì)胞內(nèi)定位（sub cellular localization）及其所參與的生物學(xué)反應(yīng)（biological process）和通路（pathway），并通過富集計(jì)算，針對補(bǔ)中益氣湯的關(guān)鍵潛在靶標(biāo)，進(jìn)行GO和KEGG分析，將p-value值排名前十的展示在結(jié)果中。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)中益氣湯所含成分及靶標(biāo)預(yù)測

通過整合藥理學(xué)平臺(tái)，君藥黃芪收集化學(xué)成分29個(gè)，預(yù)測靶標(biāo)為77個(gè)；臣藥人參和甘草分別收集到化學(xué)成分158個(gè)和133個(gè)，預(yù)測靶標(biāo)分別為802個(gè)和18個(gè)；佐藥陳皮和當(dāng)歸分別收集到化學(xué)成分46個(gè)和65個(gè)，預(yù)測靶標(biāo)分別為15個(gè)和194個(gè)；使藥升麻和柴胡分別收集到化學(xué)成分為24個(gè)和62個(gè)，預(yù)測靶標(biāo)分別為9個(gè)和351個(gè)，補(bǔ)中益氣湯中化學(xué)成分和靶標(biāo)總數(shù)（表1）。預(yù)測靶標(biāo)前四位的的是人參、柴胡、當(dāng)歸和黃芪。此外，方中共有靶標(biāo)中共有靶標(biāo)排名前幾位的是人參-當(dāng)歸67個(gè)，人參-黃芪57個(gè)，人參-柴胡36個(gè)，當(dāng)歸-黃芪35個(gè)，當(dāng)歸-柴胡24個(gè)，柴胡-黃芪23個(gè)（表2）。

表2 補(bǔ)中益氣湯中單味藥材共有靶標(biāo)分析結(jié)果

圖1 補(bǔ)中益氣湯干預(yù)甲減的候選靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

2.2 補(bǔ)中益氣湯治療甲減的核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析

通過整合藥理學(xué)平臺(tái)網(wǎng)絡(luò)分析模塊，基于PPI相互作用數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建補(bǔ)中益氣湯潛在的靶標(biāo)與甲減靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)，共篩選出關(guān)鍵靶標(biāo)631個(gè)，根據(jù)degree值排序，顯示degree值前100個(gè)靶點(diǎn)（圖1）。其中包含藥物靶標(biāo)71個(gè)，疾病靶標(biāo)3個(gè)。從圖上可以看出，補(bǔ)中益氣湯中篩選的化學(xué)成分雖無直接作用的疾病靶點(diǎn)，但三個(gè)疾病靶點(diǎn)STAT5A、GATA4和NKX2-1與多個(gè)藥物靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，推測補(bǔ)中益氣湯可間接作用于疾病的相關(guān)靶標(biāo)來干預(yù)甲減。

2.3 關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)基因GO和KEGG分析

通過GO和KEGG對篩選出的關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行基因功能和通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因功能涉及細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)（cytosol）、線粒體（mitochondrion）、ATP結(jié)合（ATP binding）、酶結(jié)合（enzyme binding）、蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）等多個(gè)條目，根據(jù)P值僅顯示前10個(gè)條目（表3）。靶標(biāo)通路富集結(jié)果顯示其主要幾種在嘌呤代謝（Purine metabolism）、內(nèi)分泌系統(tǒng)（Endocrinesystem）、核苷酸代謝（Nucleotide metabolism）、雌激素信號通（Estrogen signaling pathway）、甲狀腺激素信號通路（Thyroid hormone signaling pathway）等信號通路，關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行基因功能和通路分析時(shí)，會(huì)富集到大量的生物學(xué)過程和相關(guān)的信號通路，而P＜0.05表明具有統(tǒng)計(jì)意義，由于P＜0.05的生物學(xué)過程和相關(guān)通路數(shù)量較多，因此根據(jù)P值的大小進(jìn)行排序，篩選前十作為代表性生物學(xué)過程和通路參考，根據(jù)P值僅顯示前10個(gè)信號通路（表4）。其中ATP結(jié)合、酶結(jié)合、線粒體氧化應(yīng)激等與甲減密切相關(guān)[17-19]。研究表明甲減期間，星形膠質(zhì)細(xì)胞中的線粒體功能障礙導(dǎo)致從有氧呼吸到糖酵解代謝的代謝轉(zhuǎn)變，在神經(jīng)元能量供應(yīng)中起重要作用[20]。此外，代謝組學(xué)研究也表明甲減的生物標(biāo)志物主要涉及嘌呤代謝、氨基酸代謝和能量代謝[20]。關(guān)鍵靶標(biāo)分析顯示補(bǔ)中益氣湯治療甲減可能與能量代謝和嘌呤代謝等多種代謝相關(guān)。

表3 補(bǔ)中益氣湯治療甲減關(guān)鍵靶標(biāo)基因功能信息

表4 補(bǔ)中益氣湯治療甲減關(guān)鍵靶標(biāo)基因功能信息

圖2 補(bǔ)中益氣湯治療甲狀腺功能減退癥“中藥材-核心成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-主要通路”多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖

2.4 補(bǔ)中益氣湯治療甲減“關(guān)鍵成分-核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”分析

關(guān)鍵通路根據(jù)P-value顯示前30個(gè)通路，這些通路涉及多個(gè)方面（圖2），如嘌呤代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)、甲狀腺信號通路、核苷酸代謝、碳水化合物代謝等多個(gè)通路。這些通路的核心靶標(biāo)共計(jì)63個(gè)，與補(bǔ)中益氣湯中36個(gè)化學(xué)成分相關(guān)聯(lián)。網(wǎng)絡(luò)中補(bǔ)中益氣湯中化學(xué)成分治療甲減核心靶標(biāo)主要集中于ATP家族、ADCY1、AKT1等，這些靶標(biāo)與能量代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)和甲狀腺激素信號通路等相關(guān)。與這些靶點(diǎn)相作用的化學(xué)成分有原人參三醇、人參皂苷Rs2、枸櫞酸、山奈酚等。相關(guān)研究也表明，山奈酚、甘草次酸和人參皂苷類成分可以通過與非雌激素核受體相互作用干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)[21]。

3 討論

補(bǔ)中益氣湯為中醫(yī)經(jīng)典名方，臨床具有治療甲減的作用，但由于藥味組成復(fù)雜，化學(xué)成分較多，其作用機(jī)制仍未得到闡明。而整合藥理學(xué)平臺(tái)以大數(shù)據(jù)和模型計(jì)算為基礎(chǔ)，融合人工智能、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)科學(xué)等多學(xué)科技術(shù)和方法，形成智能化和網(wǎng)絡(luò)化的功能模塊，構(gòu)建中藥多成分與生物活性之間的關(guān)聯(lián)，用以闡明中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，為補(bǔ)中益氣湯治療甲減提供了簡潔的思路與方法。

本文借助整合藥理學(xué)平臺(tái)，分析了補(bǔ)中益氣湯治療甲狀腺功能減退癥的物質(zhì)基礎(chǔ)及其分子機(jī)制，從方中篩選出517個(gè)候選成分，預(yù)測到1466個(gè)作用靶點(diǎn)，其中36個(gè)化學(xué)成分與63個(gè)靶點(diǎn)可能參與了通過線粒體氧化應(yīng)激、嘌呤代謝、雌激素信號通路、能量代謝內(nèi)分泌系統(tǒng)等多種代謝途徑和信號通路參與了補(bǔ)中益氣湯治療甲減。這些分析結(jié)果為進(jìn)一步研究補(bǔ)中益氣湯治療甲減提供了研究方向，也為臨床治療提供借鑒與參考。整合藥理學(xué)平臺(tái)顯示補(bǔ)中益氣湯可能通過干預(yù)STAT5A從而對甲減起到干預(yù)作用，而研究表明補(bǔ)中益氣湯可以通過調(diào)控JAK/STAT信號通路從而保護(hù)甲狀腺組織，與預(yù)測結(jié)果相符合[15]。這也提示了重視中藥的免疫調(diào)節(jié)作用可能是治療甲減的一種思路。

本文借助整合藥理學(xué)平臺(tái)，對補(bǔ)中益氣湯治療甲減的化學(xué)成分和作用機(jī)制進(jìn)行了分析與預(yù)測，但對其分析僅處于計(jì)算模擬的水平，后續(xù)仍需要進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證，從而挖掘中藥治療甲減的新思路。