痛風(fēng)和高尿酸血癥動(dòng)物模型研究進(jìn)展及代謝通路分析*

石旭柳 ，喬 淼 ，伍明江 ，張洪敏 ，丁麗琴 ，邱 峰

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301607；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

痛風(fēng)屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，其病因病機(jī)分為濕熱論、痰濁論、瘀毒論和濕熱、痰濁、瘀毒互結(jié)論，多涉及脾胃、肝、腎、三焦。痛風(fēng)是嘌呤代謝發(fā)生障礙，致使體內(nèi)尿酸含量增高，并出現(xiàn)積蓄沉淀的代謝性疾病，在臨床上主要有高尿酸血癥、累及腎臟引發(fā)的痛風(fēng)性腎病、反復(fù)發(fā)作性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。美國(guó)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎協(xié)會(huì)修訂血清尿酸含量可用于痛風(fēng)診斷[1]，且該值具性別差異[2]，男性≥416.0μmol/L（70 mg/L）和女性≥ 357.0μmol/L（60 mg/L）可確診高尿酸血癥，為痛風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)因素之一[3]。2000—2014年中國(guó)大陸高尿酸血癥的患病率為13.3%（男性為19.4%，女性為7.9%）[4]。

在全球范圍內(nèi)，痛風(fēng)患病率逐步增長(zhǎng)[5-6]，高尿酸血癥在中國(guó)成人中的校正患病率可達(dá)8.4%[7]。一般來(lái)說，痛風(fēng)和高尿酸血癥發(fā)病率有年齡、性別相關(guān)性，男性發(fā)病率多為女性的2~6倍[6]，且與2型糖尿病、代謝綜合征、慢性腎病及心血管疾病[8-10]等關(guān)聯(lián)密切，累及多個(gè)系統(tǒng)，嚴(yán)重影響人類健康。因此，選擇適合的動(dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)研究已顯得至關(guān)重要。筆者對(duì)痛風(fēng)和高尿酸血癥動(dòng)物模型進(jìn)行總結(jié)，同時(shí)，結(jié)合代謝組學(xué)研究得到的模型組與痛風(fēng)和高尿酸血癥患者差異物，采用Metaboanalyst 3.5（MetPA）（http：//www.metaboanalyst.ca/） 進(jìn)行 Pathway 分析，比較高尿酸血癥動(dòng)物模型組與臨床患者代謝通路的異同，以助于選擇更接近臨床發(fā)病特點(diǎn)的動(dòng)物模型，進(jìn)一步為痛風(fēng)和高尿酸血癥發(fā)病機(jī)制及抗痛風(fēng)中藥開發(fā)等研究提供依據(jù)。

1 痛風(fēng)和高尿酸血癥動(dòng)物模型

1.1 直接補(bǔ)充尿酸或尿酸前體法誘導(dǎo)痛風(fēng)模型 直接體內(nèi)補(bǔ)充尿酸或增加尿酸前體物質(zhì)的攝入，致使嘌呤代謝障礙，導(dǎo)致其終產(chǎn)物尿酸水平異常，當(dāng)血清尿酸超過一定飽和溶解度后，可有結(jié)晶體蓄積于軟組織，如趾關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)等，出現(xiàn)炎性反應(yīng)，發(fā)展成痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

1.1.1 尿酸鈉鹽晶體（MSU）誘導(dǎo)局部痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎已成為臨床最常見的炎性關(guān)節(jié)炎[11]，其特征是在關(guān)節(jié)或其他組織滑液中有MSU沉淀[12]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中通過直接向關(guān)節(jié)部注射尿酸，增高動(dòng)物體內(nèi)尿酸水平，造成尿酸晶體在局部沉積，誘發(fā)動(dòng)物痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。

Pineda等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在42只兔膝上隨機(jī)注射50 g/L MSU或別嘌呤醇晶體懸浮液，對(duì)照組用磷酸鹽緩沖液做同等處理，其中對(duì)照組21只兔膝，MSU組12只，別嘌呤醇晶體組9只在第1、3和7天進(jìn)行超聲評(píng)估、滑液和組織病理學(xué)分析，結(jié)果顯示MSU組關(guān)節(jié)中出現(xiàn)點(diǎn)狀聚集體，而在對(duì)照組和別嘌呤醇晶體組中未發(fā)現(xiàn)，該研究表明，MSU誘發(fā)急性關(guān)節(jié)炎兔模型有效地復(fù)制了人類急性痛風(fēng)性炎癥。Santos等[14]給Wistar大鼠關(guān)節(jié)腔注射50μL MSU 1.25 mg誘發(fā)痛風(fēng)性炎癥，以考察格列本脲3 mg/kg或地塞米松8 mg/kg對(duì)大鼠關(guān)節(jié)損傷感染、水腫及白細(xì)胞浸潤(rùn)炎性反應(yīng)的作用。通過給每只大鼠的腳踝關(guān)節(jié)注射MSU晶體（100 g/L溶于生理鹽水）誘導(dǎo)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，同時(shí)采用核磁共振方法測(cè)定了模型組血漿中差異物有 Leucine、Lysine、Lactate、Glutamine、Glucose[15]。費(fèi)洪新等[16]在昆明小鼠后足右側(cè)足底皮下注射2.5%尿酸鈉溶液0.05 mL，同時(shí)在小鼠后足右側(cè)背側(cè)足趾部注射等量的尿酸鈉溶液，足趾注射部出現(xiàn)腫脹，且沒有液體溢出提示造模成功，采用該模型考察車前子對(duì)炎性反應(yīng)的作用。

采用MSU注射法能夠誘發(fā)兔子、大鼠、小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物局部痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，該模型為外源性注入MSU介質(zhì)，易于操作，能在多種動(dòng)物上復(fù)制局部痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，可用于局部痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎藥物的篩選；借助外部方法直接給予大量的尿酸引起MSU在關(guān)節(jié)局部沉積，比人類長(zhǎng)期因嘌呤代謝途徑紊亂引發(fā)尿酸沉積所致的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎更迅速。

1.1.2 補(bǔ)充高蛋白、高嘌呤等尿酸前體飲食誘導(dǎo)高尿酸血癥動(dòng)物模型 酵母粉或酵母提取糊造價(jià)低，且富含蛋白、核酸和維生素B等，這些物質(zhì)在降解過程中會(huì)產(chǎn)生嘌呤和嘧啶。高酵母飲食會(huì)干擾嘌呤代謝途徑，誘導(dǎo)黃嘌呤氧化酶，增強(qiáng)其活性，加速黃嘌呤向尿酸轉(zhuǎn)化，致使血尿酸水平升高，與人類高蛋白飲食引發(fā)的高尿酸血癥相似，接近臨床發(fā)病。

酵母提取糊按30 g/kg劑量（0.5%CMC-Na混懸）灌胃予以昆明小鼠，每天1次持續(xù)14日，小鼠血尿酸水平增加到（135.5±29.2）μmol/L，誘發(fā)其高尿酸血癥[17]。灌胃給予小鼠30 g/kg劑量的酵母膏和300 mg/kg氧嗪酸鉀，造模14 d后，發(fā)現(xiàn)血清尿酸和尿素氮水平均顯著升高，同時(shí)腎組織病理切片可見腎小管上皮細(xì)胞脫落[18]。Chen等[1]按7.5 g/kg劑量灌胃給SD大鼠10%酵母浸提物飲食，每天1次持續(xù)35日，發(fā)現(xiàn)酵母浸提物組大鼠血尿酸水平顯著增高，確定建立高尿酸血癥模型。同時(shí)，借助代謝組學(xué)分析方法比較模型組和對(duì)照組，從中篩選出高尿酸血 癥 相 關(guān) 差 異 物 有 Urate、Lactate、Pyruvate、Ornithine、Ribonate、Galactonate、Aspartate、Proline、Glutamine、Serine、Pyroglutamate、Glucose。然而，酵母粉灌胃體積大，易造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物損害，甚至有研究顯示[19]采用酵母法造模會(huì)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。

通過給予高蛋白、高嘌呤、高膽固醇等飲食也可誘發(fā)高尿酸血癥。給予雞高蛋白高鈣飼料，復(fù)制出雞痛風(fēng)模型，該模型與人類高尿酸血癥代謝水平機(jī)制相似[20]。馬瑩瑩等[21]灌胃給大鼠高膽固醇脂肪乳劑（LE），同時(shí)設(shè)有高嘌呤飼料組（HPD）和對(duì)照組，造模6周后LE組和HPD組血尿酸水平都有顯著升高，確定高尿酸血癥；停止給LE后，各組大鼠恢復(fù)正常喂食，兩周后HPD組血尿酸恢復(fù)至正常水平，而LE組血尿酸仍處于較高水平，可見高膽固醇脂肪乳劑可誘導(dǎo)較穩(wěn)定持久的大鼠高尿酸血癥模型。以700 mg/kg的劑量灌胃給予大鼠牛肉湯，持續(xù)8日可引起尿酸水平的增加，確定大鼠高尿酸血癥[22]。牛肉湯中富含嘌呤類，這些物質(zhì)在體內(nèi)可被氧化為尿酸，尿酸含量驟增，易轉(zhuǎn)為高尿酸血癥。

1.2 氧嗪酸鉀誘導(dǎo)高尿酸血癥動(dòng)物模型 氧嗪酸鉀是一種尿酸氧化酶抑制劑，可降低尿酸氧化酶活性，導(dǎo)致尿酸分解減少，造成短時(shí)間內(nèi)體內(nèi)尿酸蓄積增多。一般采用尿酸氧化酶抑制劑時(shí)常常聯(lián)合高嘌呤飲食，一方面促進(jìn)尿酸產(chǎn)生導(dǎo)致其在體內(nèi)水平增高，另一方面由于受尿酸氧化酶抑制劑的影響使尿酸分解減少。進(jìn)而從“增加來(lái)源”和“減少去路”兩個(gè)方面提高尿酸含量，維持實(shí)驗(yàn)動(dòng)物高尿酸血癥。

持續(xù)28日灌胃SD大鼠腺嘌呤0.1 g/kg氧嗪酸鉀1.5 g/kg，得到高尿酸血癥模型[23]。Zhang[24]給小鼠腹腔注射300 mg/kg劑量的氧嗪酸鉀（CMC-Na混懸）；或連續(xù)7日腹腔注射250 mg/kg氧嗪酸鉀可誘發(fā)高尿酸血癥[25]，并且通過該模型血清樣本分析篩選出差異物有 Creatinine、Hypoxanthine、Phenylalanine、Uric acid、Hippuric acid、Tryptophan、Indolelactic acid、Kynurenine、Citric acid、Inosine、5-Aminoimidazoleribotide。通過腹腔注射200 mg/kg氧嗪酸鉀，可使ICR小鼠血清尿酸、尿素氮和肌酐的水平顯著性增加[26]。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道[27]，連續(xù)7日灌胃給予大鼠2 g/kg的氧嗪酸鉀也會(huì)造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物高尿酸血癥。

高尿酸血癥動(dòng)物相關(guān)研究常采用氧嗪酸鉀和其他幾種造模條件聯(lián)合的方法來(lái)復(fù)制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。利用代謝組學(xué)方法研究秦皮對(duì)高尿酸血癥大鼠的治療作用[28]，采用聯(lián)合造模方法，給予大鼠氧嗪酸鉀100 mg/kg、腺嘌呤200 mg/kg和酵母提取物10 g/kg，持續(xù)4周復(fù)制高尿酸血癥模型，并從中鑒定差異物有 Leucine、3-Hydroxybutyrate、Taurine、Arginine、Aspartate、Lactate、Citrate、Glycogen、Glutathione、Phenylalanine、Tryptophan。腹腔注射給予Wistar大鼠黃嘌呤和氧嗪酸鉀300 mg/kg，每日兩次持續(xù)13日，檢測(cè)血清尿酸和肌酐含量，采用聯(lián)合造模誘導(dǎo)高尿酸血癥[29]。

1.3 真菌產(chǎn)物誘導(dǎo)高尿酸血癥動(dòng)物模型 啤酒的飲用為痛風(fēng)和高尿酸血癥的常見發(fā)病因素之一[30]。啤酒作為酵母發(fā)酵產(chǎn)物，其中含有乙醇和部分真菌抗原細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)容物，還有大量的真菌代謝物和尿酸[31]，采用酵母粉或酵母膏誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，可能與之存在一定關(guān)聯(lián)。

有研究顯示其他真菌產(chǎn)物也會(huì)引起高尿酸血癥，在給予雞的飼料中按200~600μg/g添加卵孢霉素，喂食3周，會(huì)誘發(fā)內(nèi)臟病變和關(guān)節(jié)痛風(fēng)；按400~600μg/g添加卵孢霉素，第1周開始在內(nèi)臟、肌肉、膽囊內(nèi)以及心包膜尿酸鹽濃度增高出現(xiàn)尿酸沉積[32]。Kubena等[33]在小雞飼料中加入赭曲霉素和丹寧酸，喂養(yǎng)26日，赭曲霉素組和赭曲霉素聯(lián)合丹寧酸組均出現(xiàn)顯著血清尿酸水平升高，以及慢性腎損傷癥狀。有研究顯示[34]，給予獼猴黃曲霉素飲食，在炎性細(xì)胞周圍會(huì)有尿酸鹽結(jié)晶析出?？梢?，飲食攝入某些真菌代謝產(chǎn)物存在引發(fā)高尿酸血癥可能。

1.4 藥物誘導(dǎo)高尿酸血癥動(dòng)物模型 臨床上在使用某些藥物治療疾病時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)血尿酸升高這一不良反應(yīng)，常見藥物如呋塞米、吡嗪酰胺（PZA）、乙胺丁醇、環(huán)孢素[35-38]等。采用相關(guān)藥物誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物高尿酸血癥，有助于發(fā)現(xiàn)藥物引起血尿酸升高的機(jī)制，利于改善藥源性高尿酸血癥。模型復(fù)制簡(jiǎn)單、易行，且有一定的藥物針對(duì)性。

Zhao等[39]借助基于1H-NMR的代謝組學(xué)方法對(duì)給藥PZA的大鼠進(jìn)行研究顯示，以2.0 g/kg劑量每天灌胃大鼠PZA，持續(xù)28日，結(jié)果顯示血尿酸明顯增加，并且由氧化應(yīng)激相關(guān)的標(biāo)志物可以確定肝臟黃嘌呤氧化酶的活性增強(qiáng)，進(jìn)而證明PZA擾亂肝臟中嘌呤代謝，誘發(fā)動(dòng)物高尿酸血癥。以100 mg/kg和250 mg/kg每天分別灌胃大鼠腺嘌呤和乙胺丁醇，連續(xù)7日，血尿酸顯著增高，確立模型[40]。該方法也可用于小鼠動(dòng)物模型復(fù)制[41]，灌胃給小鼠腺嘌呤150 mg/kg和乙胺丁醇250 mg/kg持續(xù)14日，血尿酸、肌酐和尿素氮均與對(duì)照組呈現(xiàn)顯著性差異。

2 痛風(fēng)和高尿酸血癥代謝通路分析

多種模型復(fù)制方法已被痛風(fēng)和高尿酸血癥研究者成熟運(yùn)用，其中用于代謝組學(xué)研究的模型主要有尿酸鈉誘發(fā)大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型[15]（a）、氧嗪酸鉀誘導(dǎo)大鼠高尿酸血癥模型[25]（b）、酵母粉誘導(dǎo)大鼠高尿酸血癥模型[1]（c）、高嘌呤飲食聯(lián)合誘導(dǎo)大鼠高尿酸血癥模型[28]（d），并確定出模型組生物標(biāo)志物。同樣，借助代謝組學(xué)分析方法，對(duì)痛風(fēng)、高尿酸血癥患者和健康對(duì)照者開展的研究也有文獻(xiàn)報(bào)道[42]，鑒定相關(guān)生物標(biāo)志物有L-Homocysteic acid、4-Thiapentanoic acid 、5-Methylthioribose、D-（+）-Glyceric acid、Dihydrolipoic acid、Deoxyuridine monophosphate、L-Proline、N-Acetyl-L-citrulline 、Oxalic acid、Phosphocreatine、Palmitoleicacid、S-Lactoylglutathione、Thymidine-5'-monophosphate、Uric acid。采用 MetPA對(duì)患者生物標(biāo)志物進(jìn)行Pathway分析，結(jié)果及通路如圖1所示。

圖1 痛風(fēng)和高尿酸血癥患者代謝通路分析Fig.1 Analysis of metabolic pathways in patients with gout and hyperuricemia

依據(jù)鑒定出a、b、c、d動(dòng)物模型的標(biāo)志物，采用相同代謝通路分析方法，分別得到各模型代謝通路。基于痛風(fēng)和高尿酸血癥患者代謝通路結(jié)果，分別比較各動(dòng)物模型與患者代謝通路的異同，見表1。

表1 動(dòng)物模型組與痛風(fēng)和高尿酸血癥患者代謝通路對(duì)比分析Tab.1 Comparison of metabolic pathwaysbetween animal model group and gout and hyperuricemia

結(jié)合表1發(fā)現(xiàn)，酵母粉誘導(dǎo)大鼠高尿酸血癥模型與患者生物標(biāo)志物分析得出的代謝通路匹配6個(gè)，匹配數(shù)目最多，除酵母粉富含多種食物來(lái)源外，還可能由于酵母粉常用作酵母發(fā)酵的來(lái)源，而酵母通過發(fā)酵作用多用于釀制啤酒[31]；酵母粉誘導(dǎo)高尿酸血癥模型可能與中醫(yī)濕熱論中“飲食失慎，嗜酒、肥甘厚味”所致高尿酸血癥機(jī)制相近，研究濕熱內(nèi)蘊(yùn)，痹阻經(jīng)絡(luò)所致痛風(fēng)和高尿酸血癥時(shí)[43]，可考慮選用此模型復(fù)制方法。大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型的代謝通路，與患者5個(gè)通路一致，可見尿酸鈉誘導(dǎo)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎在一定程度上接近臨床痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，研究開發(fā)抗痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎藥物時(shí)，可考慮采用該造模方法。氧嗪酸鉀和高嘌呤聯(lián)合飲食誘導(dǎo)高尿酸血癥模型與患者通路比較，分別匹配上3個(gè)和4個(gè)，氧嗪酸鉀作為尿酸氧化酶抑制劑，通過抑制尿酸分解誘導(dǎo)高尿酸血癥，嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)存在尿素酶，與人類在尿酸代謝途徑上存有差異[44]，其可能為該模型代謝通路匹配數(shù)量比前兩者少的原因；但該模型操作簡(jiǎn)單易行，易于復(fù)制；聯(lián)合高嘌呤飲食增加體內(nèi)尿酸來(lái)源，維持其在體內(nèi)的高尿酸水平，進(jìn)行降酸藥物相關(guān)研究時(shí)，可考慮采用該模型。

3 結(jié)語(yǔ)

隨著人們生活水平的提高，受“肥甘厚味，飲食不節(jié)”飲食習(xí)慣和遺傳等因素的影響，痛風(fēng)和高尿酸血癥發(fā)病率日益增長(zhǎng)。為尋找防治痛風(fēng)和高尿酸血癥的藥物，多種痛風(fēng)和高尿酸血癥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型已用于藥物篩選：尿酸鈉誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，方法簡(jiǎn)單，操作易行；氧嗪酸鉀誘導(dǎo)高尿酸血癥模型，簡(jiǎn)便靈敏；酵母粉誘導(dǎo)高尿酸血癥模型，與人類嘌呤代謝紊亂機(jī)制相似。近年來(lái)代謝組學(xué)已運(yùn)用到痛風(fēng)和高尿酸血癥的研究中，借助其鑒定出的差異物，進(jìn)行代謝通路分析。結(jié)合動(dòng)物模型組與痛風(fēng)和高尿酸血癥患者代謝通路的對(duì)比結(jié)果，有助于從分子層面深入分析模型組是否接近患者疾病狀態(tài)，選擇與疾病代謝通路相關(guān)聯(lián)的動(dòng)物模型進(jìn)行復(fù)制，為研究痛風(fēng)和高尿酸血癥中醫(yī)病因病機(jī)、藥源性高尿酸血癥以及抗痛風(fēng)中藥開發(fā)等提供合理實(shí)驗(yàn)方法和科學(xué)依據(jù)。