藏紅花素對糖尿病所致睪丸組織損傷保護(hù)作用的研究*

王立哲，王振賢，馬曉偉

（1．邯鄲市中心醫(yī)院東區(qū)康復(fù)醫(yī)學(xué)科，邯鄲 056001；2．邯鄲市中心醫(yī)院內(nèi)分泌一科，邯鄲 056001；3．邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，邯鄲 056001）

長期高血糖將誘發(fā)多組織器官并發(fā)癥，包括睪丸組織，其發(fā)病率較非糖尿病患者高10倍以上，嚴(yán)重影響患者生命健康和質(zhì)量[1]。藏紅花素（Crocin）是在番紅花中發(fā)現(xiàn)的一種水溶性化合物，具有良好的抗氧化作用和抗炎作用[2-3]，既往研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素具有改善糖尿病大鼠胸主動脈環(huán)舒縮功能、抑制視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮損傷的作用[4-5]，并且王素蓮等[6]研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素具有降低血脂的藥理學(xué)作用。本實(shí)驗(yàn)采用鏈脲佐菌素（STZ）連續(xù)3 d腹腔注射30 mg/（kg·d）的方法制備實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型，研究藏紅花素對2型糖尿病大鼠睪丸組織并發(fā)癥的抑制作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級健康雄性SD大鼠100只（7周齡、體質(zhì)量210～250 g），購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK（冀）2013-1-003。飼養(yǎng)環(huán)境：恒溫恒濕（23～25℃、相對濕度 65%～70%），光照周期12 h：12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物、試劑 藏紅花素（美國Sigma公司，純度≥99．9%，批號：E170411b）；睪酮試劑盒、糖化血紅蛋白（GHb）測試盒（南京建成生物工程研究所）；胰島素測定試劑盒（美國密理博公司）；TUNEL試劑盒購自北京博奧森生物工程有限公司；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組、模型制備與給藥 100只SD大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對照組，模型對照組，藏紅花素25 mg/（kg·d）、50 mg/（kg·d）、100 mg/（kg·d）組，各組均20只。采用STZ連續(xù)3 d腹腔注射30 mg/（kg·d）的方法制備實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型，以空腹血糖水平持續(xù)高于16．7 mmol/L認(rèn)定為造模成功。稱取適量藏紅花素，生理鹽水溶解并分別配置濃度為50、25、12．5 mg/mL 的藏紅花素溶液，1 次/日，正常對照組和模型組均同步給予等劑量的0．9%氯化鈉溶液（2 mL/kg），療程12周。

1.3.2 空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）、糖化血紅蛋白（GHb）的測定 治療完成后，通過尾靜脈空腹采血，通過血糖儀測定FBG，并按試劑盒測定FINS水平和GHb水平。

1.3.3 稱量體質(zhì)量并計(jì)算睪丸指數(shù) 治療完成后分別稱取體質(zhì)量并記錄；腹腔注射水合氯醛實(shí)施麻醉，取睪丸組織并沖洗干凈后，稱量右側(cè)睪丸質(zhì)量，睪丸指數(shù)（%）=（睪丸質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%。

1.3.4 睪酮含量測定 各組大鼠取睪丸組織前，開腹并經(jīng)腹主動脈取血，1 500 r/min離心10 min取血清，通過生化分析儀測定各組大鼠血清中睪酮含量。

1.3.5 睪丸組織病變及細(xì)胞凋亡的觀察 取稱質(zhì)量后的右側(cè)睪丸組織，置10%甲醛溶液中進(jìn)行固定，然后依次行石蠟包埋、切片、展片，然后通過常規(guī)HE染色進(jìn)行睪丸組織病理學(xué)檢查；取石蠟切片，根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行TUNEL染色，通過倒置光學(xué)顯微鏡下觀察胰島細(xì)胞凋亡（細(xì)胞核黃染為陽性著色）；計(jì)算凋亡指數(shù)（AI）：AI=（凋亡細(xì)胞數(shù)/胰島總細(xì)胞數(shù)）×100%，每張切片分別取5個(gè)視野，分別進(jìn)行計(jì)數(shù)和計(jì)算，然后取平均值。

1.3.6 透射電鏡觀察睪丸組織超微細(xì)胞結(jié)構(gòu) 取左側(cè)睪丸組織、快速修剪成約1 mm3小塊，置于預(yù)冷（4℃）戊二醛溶液（濃度 2．5%）中固定 1 h后，進(jìn)行磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗、丙酮梯度脫水進(jìn)行逐步處理，然后依次進(jìn)行Epon812包埋、超薄切片和鉛鈾雙重染色，通過H-7650型透射電鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用軟件SPSS19．0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FBG、FINS及GHb 水平測定結(jié)果 糖尿病模型對照組大鼠FBG水平、GHb水平較正常對照組大鼠均顯著升高（P＜0．01），F(xiàn)INS 水平顯著降低（P＜0．01）。與模型對照組比較經(jīng)藏紅花素50～100mg（/kg·d）治療12周能夠顯著降低糖尿病大鼠FBG水平并提高FINS水平（P＜0．01或P＜0．05），并且藏紅花素100mg（/kg·d）組 GHb 水平顯著降低（P＜0．05）。見表 1。

2.2 體質(zhì)量、睪丸指數(shù)及睪酮含量測定結(jié)果 糖尿病模型對照組大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)和血清睪酮含量顯著降低（P＜0．01）；經(jīng)藏紅花素50～100 mg（/kg·d）治療12周能夠顯著提高糖尿病大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)和血清睪酮含量，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01 或 P＜0．05）。見表 2。

表1 各組大鼠FBG、FINS及GHb水平（s）Tab.1 Levelsof FBG，F(xiàn)INSand GHb of the rats in each group（±s）

表1 各組大鼠FBG、FINS及GHb水平（s）Tab.1 Levelsof FBG，F(xiàn)INSand GHb of the rats in each group（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0．01；與模型對照組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

GHb（μg/mL）正常對照組 20 6．09±0．91 13．17±1．98 33．16±1．54模型對照組 20 17．24±2．60* 7．42±1．36*45．82±4．63*藏紅花素25mg/（kg·d）組20 15．93±2．87 8．56±1．48 44．75±4．79藏紅花素50mg/（kg·d）組20 11．75±2．68#9．23±1．70#38．06±4．25藏紅花素100 mg/（kg·d）組20 9．52±2．61##10．54±1．49##36．72±3．68#組別 動物數(shù) FBG（mmol/L）FINS（mU/mL）

表2 各組大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)及血清睪酮含量（±s）Tab.2 Body weight，testistissue index and the contentsof serum testosterone content of the ratsin each group（±s）

表2 各組大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)及血清睪酮含量（±s）Tab.2 Body weight，testistissue index and the contentsof serum testosterone content of the ratsin each group（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0．01；與模型對照組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

睪酮（nmol/L）正常對照組 20 370．95±24．73 0．45±0．08 22．79±1．63模型對照組 20 168．14±17．68*0．28±0．07*16．16±1．58*藏紅花素25 mg/（kg·d）組20 184．26±19．03 0．30±0．08 17．28±2．09藏紅花素50 mg/（kg·d）組20 215．11±21．64#0．38±0．10##20．01±1．84#藏紅花素100 mg/（kg·d）組20 238．49±22．75##0．42±0．12##21．67±1．99##組別 動物數(shù) 體質(zhì)量（g） 睪丸指數(shù)（%）

2.3 睪丸組織病理學(xué)檢查結(jié)果 與正常對照組比較，糖尿病模型對照組大鼠睪丸組織呈現(xiàn)明顯的病理異常，主要表現(xiàn)為曲細(xì)精管萎縮、生精細(xì)胞脫落、生精細(xì)胞數(shù)量減少、精子數(shù)量嚴(yán)重減少等；與模型對照組比較經(jīng)藏紅花素治療12周能夠不同程度改善糖尿病大鼠睪丸組織病變，組間比較，以藏紅花素100 mg/（kg·d）組效果最為顯著，見圖1。

圖1 各組大鼠睪丸組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE，×400）Fig.1 Testicular histopathological examination resultsof rats in each group（HE，×400）

2.4 各組大鼠睪丸組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 正常對照組：胞核形態(tài)正常，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞器豐富；模型對照組：胞核固縮、染色質(zhì)呈塊狀聚集、細(xì)胞器數(shù)量減少；藏紅花素25 mg/（kg·d）組：染色質(zhì)塊狀邊集現(xiàn)象好轉(zhuǎn)，細(xì)胞器略增多，間質(zhì)血管內(nèi)壁較光滑；藏紅花素50 mg/（kg·d）組：胞核呈類圓形，染色質(zhì)分別較均勻，細(xì)胞器數(shù)量明顯增多；藏紅花素100 mg/（kg·d）組：胞核呈橢圓形或梭型，染色質(zhì)分布均勻且無邊集現(xiàn)象，細(xì)胞器顯著增多。見圖2。

圖2 各組大鼠睪丸組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（透射電鏡，×3 000）Fig.2 The ultrastructure of testicular tissue cells in each group（transmission electron microscope，×3 000）

2.5 細(xì)胞凋亡狀況觀察結(jié)果 與正常對照組比較，糖尿病模型對照組大鼠睪丸組織凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多；經(jīng)藏紅花素治療12周能夠不同程度減少糖尿病大鼠睪丸組織凋亡細(xì)胞數(shù)量。計(jì)算各組大鼠睪丸組織細(xì)胞 AI：正常對照組 AI為（2．61±0．79）%，模型對照組AI為（46．13±6．08）%，藏紅花素25mg/（kg·d）、50 mg/（kg·d）、100 mg/（kg·d）組AI分別為（39．35±6．37）%、（28．97±5．16）%、（25．00±4．72）%；模型對照組 AI較正常對照組顯著升高（P＜0．01），而與模型對照組比較，經(jīng)藏紅花素50～100 mg/（kg·d）治療12周能夠顯著降低糖尿病大鼠睪丸組織細(xì)胞AI（P＜0．01或 P＜0．05）。見圖 3。

3 討論

睪丸組織并發(fā)癥是糖尿病患者常見的并發(fā)癥，尤其是長期血糖控制不佳的多年糖尿病患者，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。因此，糖尿病患者應(yīng)注意睪丸組織并發(fā)癥的發(fā)生與防治。既往研究發(fā)現(xiàn)高血糖引發(fā)的睪丸組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞病變以及繼發(fā)性細(xì)胞凋亡是糖尿病所致睪丸組織并發(fā)癥的重要病理機(jī)制[7-9]。

本實(shí)驗(yàn)參照李徽徽等[10]和闞敏宸[11]的研究方法，采用連續(xù)腹腔注射STZ的方法制備實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型，研究藏紅花素對糖尿病所致睪丸組織損傷的保護(hù)作用。藏紅花素是從番紅花中提取的一種具有多種生物學(xué)活性的單體化合物，既往研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素具有改善糖尿病大鼠胸主動脈環(huán)舒縮功能、抑制視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮損傷、降低血脂的藥理學(xué)[4-6]。但藏紅花素對糖尿病所致睪丸組織損傷是否具有保護(hù)作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過制備2型糖尿病大鼠模型并給予藏紅花素進(jìn)行治療，研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素能夠改善糖尿病大鼠睪丸組織曲細(xì)精管萎縮、生精細(xì)胞脫落、生精細(xì)胞數(shù)量減少、精子數(shù)量嚴(yán)重減少等病變，改善睪丸組織細(xì)胞細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)塊狀濃集、線粒體等細(xì)胞器減少、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等超微結(jié)構(gòu)病變，抑制睪丸組織細(xì)胞凋亡，本研究結(jié)果與毛孫忠等[12]的研究報(bào)道基本一致。提示藏紅花素對糖尿病所致睪丸組織并發(fā)癥損傷具有一定的保護(hù)作用。

圖3 各組大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡狀況（TUNEL，×400）Fig.3 Theapoptosisof testicular tissueof theratsin each group（TUNEL，×400）

睪酮又稱睪丸素，由男性的睪丸或女性的卵巢分泌，是機(jī)體重要的雄性激素，對精子生成具有重要的促進(jìn)作用。血糖持續(xù)偏高是導(dǎo)致睪丸萎縮、睪丸功能降低的重要病理機(jī)制，睪丸指數(shù)也是反映睪丸狀態(tài)的重量指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)藏紅花素治療12周能夠有效提高糖尿病大鼠睪丸指數(shù)和睪酮水平，提示藏紅花素具有改善糖尿病大鼠睪丸功能的作用。

綜上所述，藏紅花素能夠有效抑制糖尿病大鼠睪丸組織損傷，其機(jī)制可能與其提高胰島素水平、降低血糖作用有關(guān)。