二氧化鋯納米顆粒荷載阿霉素經(jīng)不同途徑給藥治療兔VX2肝移植瘤

趙 璠

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院超聲科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

對(duì)無法手術(shù)切除的中晚期肝癌或術(shù)后復(fù)發(fā)肝癌患者，目前臨床常采用傳統(tǒng)化療法或經(jīng)肝動(dòng)脈化療方法[1]。因多數(shù)抗癌藥物不能很好地區(qū)別肝癌細(xì)胞與正常細(xì)胞,導(dǎo)致系統(tǒng)性毒性和負(fù)面影響，使得傳統(tǒng)化療方法受到一定局限。阿霉素(doxorubicin, DOX)為蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，是較常用的傳統(tǒng)化療藥物，廣泛用于治療各種腫瘤，包括乳腺、肺和甲狀腺等部位惡性腫瘤，但具有較強(qiáng)的心臟毒性[2-4]，用于全身及局部化療可引起心肌病變和充血性心力衰竭。另外，傳統(tǒng)介入治療將化療藥物直接經(jīng)肝動(dòng)脈注入，因血流供應(yīng)不穩(wěn)定及血管內(nèi)流體靜脈壓較高，使得僅有小部分化療藥物可有效到達(dá)腫瘤部位。

作為一種新型靶向化療藥物載體，中空納米顆粒具有較高的比表面積和介孔結(jié)構(gòu)，且空隙率高，可將大量化療藥物裝載于納米顆粒內(nèi)部或附著于其表面，通過主動(dòng)靶向或被動(dòng)靶向的方式使藥物進(jìn)入細(xì)胞，提高化療效果[5-6]。近年來，二氧化鋯作為新型納米材料已在牙科學(xué)和骨科領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但少見以其作為藥物載體治療腫瘤的報(bào)道[7-8]。本研究采用裝載化療藥物DOX的二氧化鋯納米顆粒及游離DOX治療兔VX2肝移植瘤，比較經(jīng)肝動(dòng)脈及傳統(tǒng)外周靜脈途徑給藥對(duì)腫瘤的靶向性及抑瘤效果，并探討二氧化鋯納米顆粒載DOX是否可因二氧化鋯的藥物靶向性而降低DOX的心臟毒性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立 純種新西蘭大白兔26只[批準(zhǔn)號(hào)：(2013)2013-112-2號(hào)]，雌雄不拘，體質(zhì)量2.0～2.5 kg。將VX2荷瘤瘤株置于37℃恒溫水浴箱20 min進(jìn)行復(fù)蘇。在無菌條件下將瘤株剪碎，而后任選1只實(shí)驗(yàn)兔，以20 ml注射器吸取剪碎的瘤株組織塊，直接注射至其雙側(cè)后腿肌肉內(nèi)。10～15天后，待實(shí)驗(yàn)兔后腿內(nèi)生長(zhǎng)出實(shí)性腫塊后，取出瘤塊，選取周圍新鮮、生長(zhǎng)較為旺盛的魚肉樣組織，以外科剪制成1～2 mm瘤塊，用于建立兔VX2肝移植瘤模型[9-10]。

建模時(shí)，采用Philips iU22型號(hào)超聲掃描儀，腹部探頭(頻率3.0～5.0 MHz)，進(jìn)行定位并引導(dǎo)穿刺。將實(shí)驗(yàn)兔全身麻醉后仰臥保定于自制操作臺(tái)，劍突下備皮、消毒，超聲實(shí)時(shí)引導(dǎo)下，將18G穿刺針?biāo)椭令A(yù)定種植部位，取1或2個(gè)瘤塊種植于兔肝內(nèi)。瘤塊種植后10～15天，經(jīng)CT掃描證實(shí)25只兔建模成功。

1.2 分組處理 將25只VX2肝移植瘤模型兔隨機(jī)分為5組，每組5只。A組經(jīng)肝動(dòng)脈給予載DOX二氧化鋯納米顆粒，B組外周靜脈給予載DOX二氧化鋯納米顆粒，C組經(jīng)肝動(dòng)脈給予游離DOX，D組經(jīng)外周靜脈給予游離DOX，E組為空白對(duì)照組。其中A、B組載DOX二氧化鋯納米顆粒劑量為3.7 mg/kg體質(zhì)量(所含DOX劑量相當(dāng)于1.75 mg/kg體質(zhì)量)，C、D組游離DOX劑量為1.75 mg/kg體質(zhì)量；E組不做任何處理。

1.2.1 經(jīng)肝動(dòng)脈給藥 采用Siemens Artis DTA DSA數(shù)字減影血管造影機(jī)，對(duì)A、C組經(jīng)肝動(dòng)脈途徑給藥。將模型兔全身麻醉后仰臥保定于自制操作臺(tái)，確定其右側(cè)股動(dòng)脈搏動(dòng)部位，并對(duì)右側(cè)后腿內(nèi)側(cè)區(qū)域備皮、消毒、鋪巾。沿股動(dòng)脈搏動(dòng)部位鈍性分離，剝離股動(dòng)脈。以18G穿刺針穿刺股動(dòng)脈，而后引入5F導(dǎo)管鞘，行腹腔干造影顯示肝內(nèi)血管，將微導(dǎo)絲超選擇至腫瘤供血?jiǎng)用}，造影明確供血?jiǎng)用}，經(jīng)導(dǎo)管分別注入載DOX二氧化鋯納米顆粒及游離DOX。術(shù)畢加壓包扎并縫合[11]。

1.2.2 經(jīng)外周靜脈給藥 對(duì)B、D組經(jīng)耳緣靜脈分別注入載DOX二氧化鋯納米顆粒及游離DOX。

1.3 影像學(xué)評(píng)價(jià) 采用Toshiba Aquilion 64排螺旋CT掃描儀，給藥后1、3、6天對(duì)各組行CT檢查，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況及載DOX二氧化鋯納米顆粒影像學(xué)表現(xiàn)，選取肝內(nèi)腫瘤最大層面測(cè)量病灶長(zhǎng)徑及短徑，計(jì)算腫瘤體積，體積=0.5×長(zhǎng)徑×短徑2，并分別計(jì)算3天與1天、6天與3天、6天與1天腫瘤體積比。

1.4 組織學(xué)檢查 于末次CT檢查后處死模型兔，取出心臟組織，固定后沿軸位方向切成5 mm薄片，將標(biāo)本于4%甲醛溶液中浸泡2天后取出，進(jìn)行石蠟包埋。采用Nikon Eclipse TS100-F顯微鏡，對(duì)比觀察各組心臟標(biāo)本組織學(xué)表現(xiàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析比較各組間腫瘤體積比的差異，兩兩比較采用LSD或SNK法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

給藥后各時(shí)間點(diǎn)CT檢查均顯示載DOX二氧化鋯納米顆粒在肝腫瘤病灶內(nèi)呈略高密度影(圖1)。各組兔VX2肝移植瘤模型6天內(nèi)腫瘤體積持續(xù)增大，但增大程度不同，見表1。各組間給藥后3天與1天腫瘤體積比、6天與3天腫瘤體積比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.056、1.906，P=0.125、0.149)，給藥后6天與1天腫瘤體積比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.230，P=0.012)；兩兩比較顯示，A組與B組間(P=0.012)、A組與C組間(P=0.019)、A組與D組間(P=0.024)、A組與E組間(P=0.001)及B組與E組間(P=0.029)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而B組與C組間(P=0.358)、B組與D組間(P=0.420)、C組與D組間(P=0.907)、C組與E組間(P=0.176)及D組與E組間(P=0.143)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組織學(xué)檢查顯示， E組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常(圖2A)，與之相比，A組心肌細(xì)胞幾乎無損傷(圖2B)，B組僅見心肌輕度擴(kuò)張(圖2C)，C組可見心肌纖維斷裂，心肌細(xì)胞變形，出現(xiàn)明顯細(xì)胞水腫，細(xì)胞核位于一側(cè)(圖2D)，D組可見明顯心肌擴(kuò)張及細(xì)胞核變形(圖2E)。

3 討論

近年來，聯(lián)合應(yīng)用載藥納米顆粒與介入治療方法(如肝動(dòng)脈化療灌注、肝動(dòng)脈栓塞、微波消融、射頻消融等)治療腫瘤的研究報(bào)道[12]逐漸增多。納米顆?？勺鳛榘邢蚧熕幬锏妮d體，利用其良好的靶向性、緩釋性、生物相容性及生物降解性，提高化療藥物的靶向性，以達(dá)到更有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的[13]。

載DOX二氧化鋯納米顆粒經(jīng)肝動(dòng)脈給藥后到達(dá)腫瘤部位，并釋放DOX，使DOX在局部動(dòng)脈血中達(dá)到較高的藥物濃度，可提高其抗腫瘤作用[14]。本研究結(jié)果顯示，載DOX二氧化鋯納米顆粒CT呈略高密度(圖1)，經(jīng)肝動(dòng)脈給藥后6天，兔VX2肝移植瘤雖然仍持續(xù)生長(zhǎng)，但腫瘤內(nèi)高密度的載DOX二氧化鋯納米顆粒周圍出現(xiàn)近似環(huán)形低密度區(qū)(圖1)，為腫瘤壞死區(qū)。

表1 各組VX2肝移植瘤模型兔不同時(shí)間腫瘤體積及體積比(±s)

表1 各組VX2肝移植瘤模型兔不同時(shí)間腫瘤體積及體積比(±s)

組別腫瘤體積(mm3)1天3天6天腫瘤體積比3天與1天6天與3天6天與1天A組5 471.86±4.356 758.34±2.279 988.37±7.331.27±0.081.46±0.401.85±0.45B組5 497.35±4.1610 335.51±6.6117 498.40±1.312.05±0.461.64±0.233.32±0.72C組3 090.66±2.008 132.92±6.3410 820.87±6.302.39±0.821.54±0.434.18±0.98D組5 329.43±3.3010 513.74±8.4220 258.65±1.292.12±0.852.30±1.353.88±0.91E組4 900.73±2.6113 853.18±1.1928 445.97±1.692.62±1.122.51±0.794.76±1.56

圖1 載DOX二氧化鋯納米顆粒經(jīng)肝動(dòng)脈注入兔VX2肝移植瘤后不同時(shí)間CT圖像 A、B.給藥后1天(A)及3天(B),載DOX二氧化鋯納米顆粒在病灶內(nèi)呈略高密度影(箭)； C.給藥后6天，病灶內(nèi)載DOX二氧化鋯納米顆粒周圍出現(xiàn)近似環(huán)形低密度區(qū)(箭)

圖2各組兔VX2肝移植瘤模型經(jīng)不同處理后6天心臟標(biāo)本病理圖(HE，×200) A.E組，為空白對(duì)照，不做任何處理； B.A組，經(jīng)肝動(dòng)脈注入載DOX二氧化鋯納米顆粒； C.B組，經(jīng)外周靜脈注入載DOX二氧化鋯納米顆粒； D.C組，經(jīng)肝動(dòng)脈注入游離DOX； E.D組，經(jīng)外周靜脈注入游離DOX

表面被修飾后的納米顆?？赏ㄟ^被動(dòng)-主動(dòng)靶向作用及受體-配體作用，在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的趨向，但易聚集于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)豐富的組織器官。通過外周靜脈給藥后，載DOX二氧化鋯納米顆粒經(jīng)全身血液循環(huán)到達(dá)肝內(nèi)[15]，在此過程中，部分納米顆粒被其他臟器的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬并釋放DOX，影響肝內(nèi)病灶局部的藥物濃度，使其治療效果不及經(jīng)肝動(dòng)脈給藥。本研究中，A組給藥后6天與1天腫瘤體積比明顯低于B組。游離DOX經(jīng)肝動(dòng)脈及外周靜脈給藥后，因其藥物靶向性較差，隨血液循環(huán)分布于全身各組織器官，無法實(shí)現(xiàn)肝內(nèi)局部化療目的，治療效果不佳。本研究中A組和B組給藥后6天與1天腫瘤體積比均明顯低于E組，而C組和D組均與E組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過介入手段，經(jīng)肝動(dòng)脈將化療藥物超選擇性靶向注入腫瘤供血?jiǎng)用}，有利于提高化療藥物的靶向性。

DOX具有較強(qiáng)的心臟毒性。本研究組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，C組和D組心肌損傷程度相對(duì)于A組和B組更為嚴(yán)重，可見明顯的細(xì)胞水腫、心肌纖維斷裂及心肌擴(kuò)張，而A組心肌細(xì)胞幾乎無損傷，提示載DOX二氧化鋯納米顆粒無論是通過肝動(dòng)脈途徑還是外周靜脈給藥均較游離DOX更有利于降低DOX的心臟毒性；此外，載DOX二氧化鋯納米顆粒經(jīng)肝動(dòng)脈給藥引起的心肌細(xì)胞損傷較經(jīng)外周靜脈給藥更輕微。

總之，本研究通過在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納米藥物載體與傳統(tǒng)介入超選擇性肝動(dòng)脈化療相結(jié)合，可更好地延緩腫瘤生長(zhǎng)，提高藥物靶向性，并有效降低DOX造成的荷VX2肝移植瘤兔心臟毒性。