苗瀲涓，侯艷霞，郝瑞芳，宿炳林，盧桂賓，白 斌

(山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 太原 030009)

壺瓶棗是山西省太谷縣特產(chǎn)，藥食同源植物，中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品。據(jù)報(bào)道，環(huán)磷酸腺苷(cAMP)在棗中的含量是現(xiàn)在所有已測(cè)動(dòng)植物材料中最高的。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)具有緩解抑郁癥、消化功能障礙，調(diào)節(jié)肝功能，放松平滑肌、擴(kuò)張血管，激活蛋白等作用。常用的cAMP檢測(cè)方法有蛋白免疫結(jié)合法、高效液相色譜法、紫外分光光度法、薄層色譜法等。本試驗(yàn)以壺瓶棗為研究對(duì)象，采用酶解浸提法，提高壺瓶棗中cAMP的提取量，建立了檢測(cè)壺瓶棗中cAMP含量的高效液相色譜法。該方法快捷準(zhǔn)確，可為以后研究不同時(shí)期cAMP含量變化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與藥品

試驗(yàn)材料為壺瓶棗，采自山西省農(nóng)科院果樹所國家棗種質(zhì)資源圃。

藥品為甲醇(色譜級(jí)，4 L，北京迪科馬科技有限公司)；纖維素酶(阿拉丁，25 g)；環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)品(cAMP，純度>99.0%，上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司)；檸檬酸、磷酸二氫鉀(分析純，天津化學(xué)試劑三廠)。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀(Skyray Instrument)；高速冷凍離心機(jī)(eppendorf, centrifuge 5810R)；鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；超純水機(jī)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DB型)。

1.2 方法

1.2.1 定量工作曲線

精確稱取100 mg cAMP標(biāo)準(zhǔn)品定容至100 mL，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冷藏保存。分別配制成濃度為10 μg/mL，20 μg/mL，30 μg/mL，40 μg/mL，50 μg/mL的cAMP溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 樣品預(yù)處理

選取大小均勻的壺瓶棗清洗干凈，切成細(xì)條，放入55 ℃烘箱中烘干，然后粉碎過50目篩，制備成干棗粉樣品。準(zhǔn)確稱取1.000 0 g棗粉，用熱水溶解，在60 ℃溫水浴中浸提1 h，取出后冷卻至室溫，用0.1 mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)pH至5.0.按照1∶100的質(zhì)量比加入纖維素酶，于45 ℃水浴45 min，然后超聲波浸提20 min，取出后定容至50 mL離心管。設(shè)置溫度4 ℃，轉(zhuǎn)速4 000 r/min，離心10 min，用 2 mL注射器吸取樣液過0.45 μm有機(jī)系濾膜，打入進(jìn)樣瓶待測(cè)。

1.2.3 色譜條件

采用Sino Chrom ODS-BP色譜柱(5 μm，4.6 mm×200.0 mm)，柱溫為30 ℃，流動(dòng)相為磷酸二氫鉀溶液-甲醇(80 ∶20，過0.45 μm 有機(jī)系濾膜，超聲脫氣)，流速為1 mL/min.進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長為259 nm.

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

環(huán)磷酸腺苷易溶于甲醇-磷酸二氫鉀溶液或甲醇-水溶液，因此，本試驗(yàn)選擇這2種混合溶液分別作為流動(dòng)相進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果表明，甲醇-磷酸二氫鉀溶液洗脫固定相上吸附的化合物效果更好，而且相近保留時(shí)間的組分液不容易分開。進(jìn)一步優(yōu)化流動(dòng)相比例，分別比較甲醇-磷酸二氫鉀溶液(10 ∶90)、甲醇-磷酸二氫鉀溶液(20 ∶80)、甲醇-磷酸二氫鉀溶液(30 ∶70)，結(jié)果表明，甲醇-磷酸二氫鉀溶液(20 ∶80)待測(cè)組分分離效果好，分析時(shí)間為5 min左右，符合快速檢測(cè)要求。環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)品譜圖見圖1.

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用超純水稀釋1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別配制成10 μg/mL，20 μg/mL，30 μg/mL，40 μg/mL，50 μg/mL 濃度溶液，以檢測(cè)峰面積為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖 2.

圖1 環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)品HPLC譜圖

圖2 環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

環(huán)磷酸腺苷在10.0 μg/mL～50.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，濃度和檢測(cè)峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.000 320 10x，相關(guān)系數(shù)為 0.999 076 28.

2.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

用本試驗(yàn)建立的方法測(cè)定山西太谷壺瓶棗樣品20份，檢測(cè)出環(huán)磷酸腺苷含量在129.92 μg/g～474.19 μg/g之間。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了壺瓶棗中環(huán)磷酸腺苷測(cè)定的高效液相色譜法。這種方法具有操作簡單，重復(fù)性好，選擇性好，專一性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，對(duì)提取方法的優(yōu)化也提高了環(huán)磷酸腺苷的提取量，可為后續(xù)研究不同品種、不同時(shí)期棗中環(huán)磷酸腺苷含量的變化提供方法基礎(chǔ)。