包英華，張海玲，黃依琳，陳天韻，黃晶晶，梁基敏

（韶關(guān)學(xué)院 英東生命科學(xué)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl）為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium Sw.），多年生附生草本植物，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，主要分布于貴州、云南、四川、廣西、廣東、湖南、湖北、海南、西藏、福建、臺灣等地區(qū)［1-2］.含有生物堿類、多糖類、萜類和酚類等活性成分，石斛堿是其特征性成分［3-4］，用于治療心腦血管及血栓性疾?。?］、提高免疫功能［6-7］、降血糖、改善血脂［8］.

我國石斛屬植物有 70余種，2個(gè)變種［9］，其中藥用石斛有50余種［10］，金釵石斛是各版《中國藥典》載錄的石斛類藥材之一［11］，由于市場上金釵石斛貨源少，與其同科屬的混淆品也較多，導(dǎo)致金釵石斛用藥存在安全和有效性隱患.目前，金釵石斛的鑒別研究主要集中在金釵石斛與同屬石斛種間［12］、金釵石斛與其偽品之間［13］，鑒別方法涉及到薄層色譜法［14］、紫外光譜法［15］、形態(tài)和顯微鑒定法［16］、分子鑒定法［17-18］和有效成分比較法等等［19］.

本文在前人的工作基礎(chǔ)上，通過比較廣東始興金釵石斛、貴州赤水金釵石斛和云南思茅金釵石斛等三種居群金釵石斛的性狀和顯微結(jié)構(gòu)特征，闡釋了不同居群金釵石斛品種間的特異性鑒別特征，為實(shí)現(xiàn)有效的品種區(qū)分和鑒別奠定基礎(chǔ).

1 試驗(yàn)材料

金釵石斛分別采自于廣東始興、貴州赤水、云南思茅等地；顯微結(jié)構(gòu)分析材料均采用三年期生莖.

2 主要儀器和試劑

儀器：光學(xué)顯微鏡（Nikon ECLIPSE E200）、電熱干燥箱、電子天平、游標(biāo)卡尺等.

試劑：番紅-固綠染液、Schiff’s試劑、I2-KI染液、改良碘化鉍鉀溶液、碘化鉀、乙醇等.

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 形態(tài)特征分析

金釵石斛株高采用尺子測量；莖直徑、節(jié)間長度、節(jié)長度、葉片長度和寬度等采用游標(biāo)卡尺測量.每個(gè)居群測量15份樣品.

3.2 顯微特征分析法

采用徒手切片法，制作三種居群金釵石斛莖切片，選取具一層細(xì)胞的切片，進(jìn)行番紅-固綠復(fù)染后觀察分析其顯微結(jié)構(gòu)特征.用改良碘化鉍鉀試液染色法［20］和Schiff試劑配方2法［21］，對各居群金釵石斛的生物堿和多糖進(jìn)行組織化學(xué)定位.每個(gè)居群用3組樣品，每組樣品做5個(gè)切片，每個(gè)切片隨機(jī)觀察3個(gè)視野，各項(xiàng)測量指標(biāo)共獲得135個(gè)測量數(shù)據(jù).

3.3 數(shù)據(jù)分析法

采用SPSS 25.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

4 結(jié)果與分析

4.1 三種居群金釵石斛的性狀特征分析

貴州赤水和云南思茅金釵石斛莖多為圓柱形，廣東始興金釵石斛的為扁圓柱形；貴州赤水金釵石斛莖顏色為黃綠色至深綠色，而云南思茅與廣東始興金釵石斛為黃綠色至深黃綠色.葉片均為互生，呈長圓形的革質(zhì)全緣綠葉.貴州赤水和云南思茅金釵石斛花瓣均為白色，先端淡紫紅色，唇瓣斑點(diǎn)片狀，呈暗紅色至深紫紅色；廣東始興金釵石斛的花瓣為淺粉色，先端淡紫紅色，唇瓣斑點(diǎn)點(diǎn)狀，呈深紫紅色.貴州赤水金釵石斛的小花數(shù)最少，一株上具有3～6朵小花；反之云南思茅金釵石斛的小花數(shù)目最多，一株上可達(dá)10～15朵小花；廣東始興金釵石斛的在中間，一株上可達(dá)5～8朵小花.三種居群鐵皮石斛的碩果長度一般在1.2～1.5 cm，最大的果實(shí)寬度可達(dá)1.8 cm.其中云南思茅金釵石斛的碩果較大，但數(shù)量少；廣東始興金釵石斛碩果較小，但數(shù)量多，見圖1.

圖1 三種居群金釵石斛的形態(tài)學(xué)特征注：A：貴州赤水金釵石斛；B：貴州赤水金釵石斛花；C：貴州赤水金釵石斛果實(shí)；D：廣東始興金釵石斛；E：廣東始興金釵石斛花；F：廣東始興金釵石斛果實(shí)；G：云南思茅金釵石斛；H：云南思茅金釵石斛花；I：云南思茅金釵石斛果實(shí).

從表1可見，云南思茅金釵石斛的株高、莖直徑、節(jié)間長度、葉片長寬度指標(biāo)與其他居群之間均存在顯著差異，并均高于其他兩個(gè)居群，分別可達(dá)52.49 cm、8.21 mm、4.27 cm、3.22 mm、13.63 cm和2.69 cm.貴州赤水和廣東始興金釵石斛之間節(jié)間長度與葉長度指標(biāo)間沒有顯著差異外，其他均有顯著差異.

表1 三種居群金釵石斛莖的形態(tài)特征比較分析

4.2 三種居群金釵石斛莖的顯微結(jié)構(gòu)特征分析

三種居群金釵石斛莖組織構(gòu)造由角質(zhì)層、表皮、皮下層細(xì)胞與基本組織、維管束組成.角質(zhì)層被番紅-固綠復(fù)染后變成桔黃色；表皮細(xì)胞呈規(guī)則形一層細(xì)胞，排列較緊密，壁不增厚；皮下層細(xì)胞一般是2～3列，細(xì)胞大小不一、形狀各異；基本組織細(xì)胞從外到內(nèi)逐漸變大，變化較顯著，其間多散布著呈外韌型維管束，圓形或橢圓形，外圍排列有厚壁鞘纖維,見圖2.

圖2 三種居群金釵石斛的莖顯微結(jié)構(gòu)特征注：A、B、C：貴州赤水金釵石斛； D、E、F：廣東始興金釵石斛； G、H、I：云南思茅金釵石斛；Cu：角質(zhì)層；ep：表皮；sc：皮下層細(xì)胞；gt：基本組織；v：維管束；A、D、G：10×4；B、E、H、C、F、I：10×40.

從表2可知，廣東始興金釵石斛莖的角質(zhì)層厚度、表皮細(xì)胞直徑、木質(zhì)部厚度與貴州赤水金釵石斛和云南思茅金釵石斛之間存在顯著差異；角質(zhì)層厚度和表皮細(xì)胞直徑均比后兩者大，分別可達(dá)8.34 μm、18.96 μm，木質(zhì)部厚度比后兩者薄，達(dá)23.06 μm.三種居群金釵石斛莖的鞘纖維直徑特征不存在顯著性差異.

表2 三種居群金釵石斛莖的顯微結(jié)構(gòu)特征比較分析

4.3 三種居群金釵石斛莖的生物堿與多糖的組織化學(xué)定位分析

組織化學(xué)定位結(jié)果表明，金釵石斛莖的基本組織中分布著大量生物堿，多以不規(guī)則塊狀或顆粒狀存在，前者更常見.其中維管束周圍的基本組織中分布較多，呈現(xiàn)高度聚集狀；在表皮細(xì)胞與維管束內(nèi)分布較少，甚至沒有.反之，三種居群金釵石斛莖中多糖的分布較少，零散分布于維管束和維管束與皮層之間的基本組織細(xì)胞中，呈不規(guī)則狀且大小不一的不透明暗紫紅色塊狀，有些維管束中存在連成一片的多糖.

三種居群金釵石斛所含生物堿和多糖直徑有所差異.從表3可見，貴州金釵石斛生物堿直徑與云南思茅金釵石斛之間無顯著差異，但與廣東始興金釵石斛之間有顯著性差異.其中廣東始興金釵石斛生物堿直徑(18.28 μm)明顯小于貴州赤水金釵石斛(24.04 μm)與云南思茅金釵石斛(21.39 μm)；貴州赤水金釵石斛和廣東始興金釵石斛多糖直徑之間無顯著差異，但兩者與云南思茅金釵石斛之間存在顯著差異，其中云南思茅金釵石斛多糖直徑(7.90 μm)明顯小于貴州金釵石斛(11.37 μm)和廣東金釵石斛(13.42 μm).

表3 三種居群金釵石斛莖的生物堿與多糖組織化學(xué)定位分析

5 討論

由于藥用石斛具有較高的藥用和保健作用，市場需求量很大，因其野生資源緊缺，藥材基源復(fù)雜，導(dǎo)致商品藥材混亂現(xiàn)象十分嚴(yán)重［22］.性狀和顯微鑒定方法作為中藥傳統(tǒng)鑒定方法之一，具有準(zhǔn)確、簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用等獨(dú)特的優(yōu)勢［23］.鑒于此，通過對不同居群金釵石斛的性狀和顯微特征進(jìn)行比較研究，從而選出不同居群金釵石斛品種有效的鑒別特異性具有重要現(xiàn)實(shí)意義.

研究表明，在性狀特征上充分反映出金釵石斛的遺傳變異.分析發(fā)現(xiàn)，廣東始興金釵石斛的莖形狀比貴州赤水和云南思茅較扁；花瓣為淺粉色，唇瓣斑點(diǎn)呈點(diǎn)狀，后兩者花瓣為白色，唇瓣斑點(diǎn)呈片狀.貴州金釵石斛莖顏色比廣東始興和云南思茅要深，小花數(shù)目比后兩者少.云南思茅金釵石斛小花數(shù)目比廣東始興和貴州赤水的多，株高、莖直徑、節(jié)間長度、葉寬度、碩果均比后兩者大.另外，在三種居群金釵石斛的引種栽培和生長發(fā)育過程中，其株高、莖直徑、莖形狀和顏色、節(jié)間長度、葉寬度、花瓣顏色和唇瓣斑點(diǎn)等性狀特征，與其野生種相比未見出現(xiàn)明顯的變化，說明這些性狀特征可作為鑒別三種居群金釵石斛的鑒定和評價(jià)指標(biāo).

顯微結(jié)構(gòu)特征分析結(jié)果顯示，三種居群金釵石斛中，維管束數(shù)目和韌皮部厚度存在顯著差異，鞘纖維直徑無顯著差異.而廣東始興金釵石斛莖的角質(zhì)層厚度、表皮細(xì)胞直徑、木質(zhì)部厚度與貴州赤水和云南思茅金釵石斛之間存在顯著差異，對廣東始興金釵石斛的鑒別可提供參考依據(jù).云南思茅與貴州赤水金釵石斛相比，皮下層細(xì)胞直徑和層數(shù)、維管束直徑和數(shù)目、韌皮部厚度等指標(biāo)均存在顯著差異，可作為云南思茅和貴州赤水金釵石斛的鑒別依據(jù).

組織化學(xué)(histochemistry)技術(shù)是通過化學(xué)或物理反應(yīng)原理顯示組織切片某種化學(xué)成分，對其進(jìn)行定位定量并分析相關(guān)的功能.利用組織化學(xué)技術(shù)在藥用植物有效成分(多糖、生物堿、黃酮、香豆素和皂苷等)的分布規(guī)律和動(dòng)態(tài)變化等方面研究發(fā)揮著越來越重要的作用［21］.組織化學(xué)定位方法能夠快速而簡單地觀察和分析出，三種居群金釵石斛莖中的生物堿和多糖的分布特征.其中廣東始興金釵石斛莖的生物堿直徑明顯小于貴州赤水和云南思茅金釵石斛；而云南思茅金釵石斛莖的多糖直徑明顯小于廣東始興和貴州赤水金釵石斛.金釵石斛作為藥用石斛的主要品種之一，其生物堿與多糖的含量與藥材質(zhì)量密切相關(guān).三種產(chǎn)地的金釵石斛中所含生物堿與多糖的直徑均有一定的差異，含量差異問題需進(jìn)一步深入研究.