白花兜蘭的無(wú)菌播種和離體快速繁殖

張 梅，胡 瑾，周 艷，李君一2，馮佑鴻，李依蔓

(1.貴州省植物園，貴陽(yáng) 550004； 2.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴陽(yáng) 550005)

兜蘭屬(Paphiopedilum)隸屬于蘭科(Orchidaceae)植物，全世界有80～85種，以亞洲的亞熱帶和熱帶地區(qū)的分布為主，太平洋西南的大洋洲島嶺、南洋群島、巴布亞新幾內(nèi)亞、東南亞等為分布中心[5,7-8,17]。我國(guó)擁有豐富的兜蘭屬植物資源，有30種以上，主要分布在我國(guó)西南部的亞熱帶地區(qū)和熱帶邊緣地區(qū)，以廣西、云南和貴州分布最多[9-11,28]。大部分種類的兜蘭分布范圍較狹窄，具有一定的區(qū)域特征，如白花兜蘭僅產(chǎn)廣西和貴州極其狹窄的喀斯特林下[22]。

白花兜蘭(Paphiopedilumemersonii)是我國(guó)特有種，國(guó)家Ⅰ級(jí)保護(hù)植物，已被列入《野生動(dòng)植物瀕危物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)以及紅色名錄(IUCN Red List of Threatened Species)[4,6]。隨著人口的迅速增長(zhǎng)，人類活動(dòng)和經(jīng)濟(jì)活動(dòng)也不斷的加劇，地球綠色植被覆蓋面積在不斷的減少，整個(gè)大生態(tài)系統(tǒng)每況愈下，白花兜蘭的生長(zhǎng)環(huán)境在不斷的萎縮和消失。而白花兜蘭生境主要是喀斯特林下，分布區(qū)域狹窄，且喀斯特地貌的氣候異常。生境的特殊性和不可逆性，加上掠奪性采挖，導(dǎo)致種群數(shù)量迅速減少而瀕臨滅絕[6]。因此，探尋白花兜蘭的快速繁殖方法和人工繁育途徑對(duì)白花兜蘭以及整個(gè)兜蘭屬的保護(hù)和開(kāi)發(fā)具有重要的意義。

兜蘭同其他大多數(shù)蘭花一樣，種子無(wú)胚乳，在自然環(huán)境中需要與真菌共生才能萌發(fā)，且萌發(fā)率極低，其傳統(tǒng)繁殖為分株繁殖，繁殖系數(shù)低，速度慢，不能滿足保護(hù)和開(kāi)發(fā)的需求[23]。在前期的研究中，本項(xiàng)目組采用白花兜蘭的葉片和莖尖作為外植體，通過(guò)常規(guī)消毒仍被大量的細(xì)菌、真菌和其他病源菌感染，而無(wú)污染的外植體啟動(dòng)增長(zhǎng)速度慢。為了提高白花兜蘭的繁殖能力，本實(shí)驗(yàn)擬用其種子和原球莖作為外植體，探索白花兜蘭有效的繁殖方式，為白花兜蘭的保護(hù)、利用和開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料均取自貴州省植物園溫室內(nèi)的蘭科植物，為授粉后結(jié)果180 d且未開(kāi)裂的白花兜蘭種子和在溫室中健康茁壯的原球莖植株。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1組培室的培養(yǎng)條件

組培室的培養(yǎng)溫度控制在(24±1)℃，光照2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。培養(yǎng)基中含蔗糖3.0%，瓊脂0.8%，pH值控制在5.6～6.0范圍內(nèi)。

1.2.2種子和原球莖的處理

將采收的未開(kāi)裂蒴果和健康且茁壯生長(zhǎng)植株的原球莖用自來(lái)水洗凈，再用流水沖洗15 min，然后在超凈工作臺(tái)(超凈工作臺(tái)在操作前先開(kāi)紫外滅菌燈滅菌15 min)上先用75%酒精浸泡30 s，轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液中浸泡20 min，再用無(wú)菌蒸餾水清洗5～6遍，取出未開(kāi)裂的蒴果和原球莖，用無(wú)菌濾紙吸干水分，用無(wú)菌剪刀和鑷子剖開(kāi)未開(kāi)裂的蒴果和原球莖，均勻地播撒在培養(yǎng)基表面(注：操作過(guò)程要小心，避免被污染和升汞溶液撒落，操作完成后要妥善處理好升汞溶液)。

1.2.3有機(jī)物的處理

結(jié)合前人的研究結(jié)果以及前期的工作情況[1,3,12-15]，選用香蕉和椰乳作為有機(jī)物進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，原因是香蕉和椰乳含有豐富的營(yíng)養(yǎng)和生理活性物質(zhì)，廣泛地應(yīng)用于植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和離體再生研究[12-16]。

香蕉的處理，稱500 g去皮的香蕉，切成0.5 cm3左右的細(xì)塊，放入500 mL的水中用小火慢煮，待細(xì)塊變?yōu)橹纯?；椰乳為市?gòu)椰子汁液。

1.2.4培養(yǎng)基的配置

種子萌發(fā)的培養(yǎng)基：

1) MS；

2) MS+100 mL/L香蕉汁；

3) MS+100 mL/L椰乳；

4) MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L；

5) MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+100 mL/L香蕉汁；

6) MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+100 mL/L椰乳。

原球莖增殖的培養(yǎng)基：

1) 1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg；

2) 1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+100 mL/L香蕉汁；

3) 1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+100 mL/L椰乳；

4) 1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+100 mL/L香蕉汁+0.2 g/L活性炭；

5) 1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+100 mL/L椰乳+0.2 g/L活性炭。

生根的培養(yǎng)基：

1) 1/2 MS+NAA 1.0 mg/L；

2) 1/2 MS+IBA 1.0 mg/L；

3) 1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L；

4) 1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L+1.0 g/L活性炭。

種子和原球莖在光照和黑暗均勻(光照12 h/d，黑暗12 h/d)的條件下培養(yǎng)4周后，用放大鏡觀察，以種子膨大形成白色原球莖為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)[28]，原球莖以生根和萌發(fā)幼芽為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)。待原球莖轉(zhuǎn)綠出芽后，將原球莖轉(zhuǎn)入育苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待小苗出現(xiàn)2片葉后，轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在培養(yǎng)期間不斷觀察和記錄，待3～4個(gè)月后出瓶栽培。

表1 不同基質(zhì)對(duì)種子萌發(fā)率的影響

實(shí)驗(yàn)組號(hào)培養(yǎng)基種子萌發(fā)率(%)培養(yǎng)4周培養(yǎng)6周培養(yǎng)8周1MS0072MS+100mL/L香蕉汁27133MS+100mL/L椰乳510204MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L02105MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+100mL/L香蕉汁817306MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+100mL/L椰乳122158

表2 原球莖增值培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)組號(hào)培養(yǎng)基分化情況增殖情況增殖倍數(shù)植株生長(zhǎng)11/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg———21/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+100mL/L香蕉汁轉(zhuǎn)綠成苗1.3生長(zhǎng)慢31/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+100mL/L椰乳轉(zhuǎn)綠成苗3.5生長(zhǎng)健壯,葉濃綠,生長(zhǎng)快41/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+100mL/L香蕉汁+0.2g/L活性炭轉(zhuǎn)綠成苗1.8生長(zhǎng)健壯,長(zhǎng)勢(shì)慢51/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+100mL/L椰乳+0.2g/L活性炭轉(zhuǎn)綠成苗2.0長(zhǎng)勢(shì)一般

表3 不同的激素及濃度對(duì)白花兜蘭生根的影響

實(shí)驗(yàn)組號(hào)基質(zhì)培養(yǎng)時(shí)間(d)生根率(%)根的條數(shù)(條)11/2MS+NAA1.0mg/L———21/2MS+IBA1.0mg/L———31/2MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L53322～341/2MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+1.0g/L 活性炭35654～5

1.2.5煉苗、移栽

把需要移栽的試管苗先放在培養(yǎng)室外3 d后打開(kāi)試管蓋，再在培養(yǎng)室外放5 d，然后移栽到配好的土壤基質(zhì)中，分別測(cè)定其對(duì)白花兜蘭移栽苗成活率的影響。試管生根苗移入栽培基質(zhì)后，其相對(duì)濕度保持在85%以上，可選用霧狀噴水的方式，無(wú)需設(shè)置保溫保濕的小環(huán)境，培養(yǎng)1周后再噴施營(yíng)養(yǎng)液。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基質(zhì)對(duì)白花兜蘭種子萌發(fā)的影響

為了探究不同有機(jī)物對(duì)白花兜蘭種子萌發(fā)的影響，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了6組培養(yǎng)基(表1)。由表1可見(jiàn)，第6組培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+100 mL/L椰乳)種子的發(fā)芽率最高，培養(yǎng)8周的發(fā)芽率為58%；其次是第5組培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+100 mL/L香蕉汁)種子的發(fā)芽率。發(fā)芽率最低的是第1組培養(yǎng)基(MS)，培養(yǎng)8周后的發(fā)芽率為7%。可見(jiàn)添加適量的生長(zhǎng)元素和有機(jī)物質(zhì)有利于促進(jìn)白花兜蘭種子萌發(fā)。結(jié)果表明，適宜白花兜蘭種子無(wú)菌萌發(fā)最佳的培養(yǎng)配方組合為：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+100 mL/L椰乳。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)白花兜蘭原球莖的增殖培養(yǎng)

為了解不同培養(yǎng)基對(duì)白花兜蘭原球莖增殖培養(yǎng)的影響，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了5組培養(yǎng)基來(lái)探究白花兜蘭原球莖在不同培養(yǎng)基中的增殖發(fā)芽率。如表2所示，第3組培養(yǎng)基(1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+100 mL/L椰乳)原球莖增殖最快，增值倍數(shù)為3.5；其次是第5組培養(yǎng)基(1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+100 mL/L椰乳+0.2 g/L活性炭)，增值倍數(shù)為2.0。第1組培養(yǎng)基原球莖沒(méi)有分化，可見(jiàn)添加適量的有機(jī)物質(zhì)能促進(jìn)白花兜蘭原球莖的分化。最佳增殖培養(yǎng)組合為：1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+100 mL/L椰乳。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)生根培養(yǎng)的影響

為了探究不同培養(yǎng)基對(duì)白花兜蘭生根培養(yǎng)的影響，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了4組培養(yǎng)基，每組培養(yǎng)基分別培養(yǎng)100株無(wú)根苗。如表3所示，第1組和第2組培養(yǎng)基在60 d內(nèi)均無(wú)生根，第3組培養(yǎng)基白花兜蘭培養(yǎng)53 d時(shí)開(kāi)始生根，生根率為32%，生根條數(shù)平均為2～3條。第4組培養(yǎng)基培養(yǎng)的白花兜蘭在35 d時(shí)開(kāi)始生根，生根率為65%，平均生根數(shù)為4～5條。表明白花兜蘭最佳生根培養(yǎng)組合為1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L+1.0 g/L活性炭。

2.4 煉苗時(shí)間與移栽基質(zhì)對(duì)白花兜蘭移栽苗成活率的影響

移栽前將生根瓶苗放入實(shí)驗(yàn)室中揭開(kāi)封口膜煉苗。煉苗處理如表4，分別煉苗5、7 d和14 d，以不煉苗直接移栽為對(duì)照。結(jié)果表明，煉苗時(shí)間對(duì)緩苗期和移栽成活率有一定的影響。不煉苗處理的移栽成活率最低，移栽成活率為4%。以煉苗7 d的移栽成活率最高，為72%。

把煉好的健壯苗從培養(yǎng)基取出，洗凈培養(yǎng)基，用0.1%多菌靈溶液浸泡根部4 min，清水洗去藥液，自然風(fēng)干2～4 h后栽入已滅菌的栽培基質(zhì)中。栽培基質(zhì)主要分為3組，1) 樹(shù)皮∶火山石∶腐殖土(1∶1∶1)、 2) 樹(shù)皮、 3) 樹(shù)皮∶蛭石(2∶1)，1個(gè)月后計(jì)數(shù)成活率(表5)，培養(yǎng)基質(zhì)為 1) 的小苗長(zhǎng)勢(shì)最好，成活率也最高，達(dá)76%；而栽培基質(zhì)為 3) 的小苗長(zhǎng)勢(shì)最弱，成活率為41%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4、表5)顯示，煉苗的最佳時(shí)間為7 d。樹(shù)皮∶火山石∶腐殖土(1∶1∶1)的栽培基質(zhì)最適合白花兜蘭的生長(zhǎng)。

表4 移栽苗的成活率

煉苗天數(shù)(d)成活率(%)生長(zhǎng)狀況04根基本腐爛,緩苗時(shí)間長(zhǎng),長(zhǎng)勢(shì)弱56根部分腐爛,植株黃,長(zhǎng)勢(shì)弱772根不腐爛,根抓土性強(qiáng),苗健壯,色綠,長(zhǎng)勢(shì)好1464根不腐爛,抓土性一般,苗健壯,色綠

表5 移栽基質(zhì)對(duì)移栽苗成活率的影響

栽培基質(zhì)成活率(%)生長(zhǎng)情況樹(shù)皮56根抓土性弱,苗長(zhǎng)勢(shì)一般樹(shù)皮∶蛭石(2∶1)41根不抓土,緩苗時(shí)間長(zhǎng),長(zhǎng)勢(shì)弱樹(shù)皮∶火山石∶腐殖土(1∶1∶1)76根抓土性強(qiáng),苗健壯,色綠

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)白花兜蘭種子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)組合為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+100 mL/L椰乳；原球莖的誘導(dǎo)和增殖最佳的培養(yǎng)基配比為1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+100 mL/L；有機(jī)添加物椰乳對(duì)白花兜蘭種子的萌發(fā)和原球莖的誘導(dǎo)與分化有較好的促進(jìn)作用。1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L+1.0 g/L 活性炭對(duì)白花兜蘭的根誘導(dǎo)效果最為理想；煉苗最佳時(shí)間為7 d，栽培基質(zhì)為樹(shù)皮∶火山石∶腐殖土(1∶1∶1)的移栽成活率達(dá)76%。

3.2 討 論

兜蘭是蘭科植物中極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的重點(diǎn)保護(hù)類群之一[12-16]，也是萌發(fā)較困難的種類之一[12]。本實(shí)驗(yàn)以成熟未開(kāi)裂的種子和健康茁壯成長(zhǎng)的原球莖為外植體，以MS和1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同激素配比[26]、不同的有機(jī)物、不同配比的活性炭等變量因素，研究其對(duì)白花兜蘭的種子萌發(fā)，原球莖芽的增殖、分化和生根誘導(dǎo)的影響，從中篩選出各個(gè)培養(yǎng)階段的最佳培養(yǎng)基配方。在成苗后對(duì)其進(jìn)行煉苗，選出最佳的移栽基質(zhì)[27]，使白花兜蘭能在無(wú)菌狀態(tài)下播種和離體快速繁殖。

3.2.1影響白花兜蘭種子無(wú)菌萌發(fā)的因素

培養(yǎng)基中鹽分的組成和濃度是影響兜蘭種子萌發(fā)的重要因素[24-25]，且培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)物(如椰乳、香蕉和馬鈴薯)和活性炭均有利于蘭科植物種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)[15]。實(shí)驗(yàn)顯示，加入適量(10%)的椰乳對(duì)兜蘭的種子萌發(fā)有促進(jìn)作用，結(jié)果與前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[15-16]。白花兜蘭種子發(fā)芽后在MS的培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)較好，與其他本屬物種有很大的差異[12-16]。總之，影響種子發(fā)芽率的主要因素是激素的配比和有機(jī)物質(zhì)的種類，除此之外，種子發(fā)芽率還與種子本身的基質(zhì)有關(guān)，因此在選取實(shí)驗(yàn)種子時(shí)，要注意種子的成熟度以及狀態(tài)、無(wú)菌操作等因素。

3.2.2有機(jī)物與白花兜蘭原球莖分化增殖

通過(guò)對(duì)比白花兜蘭原球莖在不同的培養(yǎng)基下分化和增殖的情況(表2)，發(fā)現(xiàn)原球莖在添加椰乳的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)綠成苗較快，且生長(zhǎng)健壯，葉濃綠，生長(zhǎng)快；培養(yǎng)基中適當(dāng)添加有機(jī)物椰乳可提高原球莖的分化與增殖能力，與王蓮輝等[14]的研究結(jié)果一致；主要原因在于有機(jī)物中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)和生理活性物質(zhì)[16]，而椰乳中含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生理活性物質(zhì)的配比與白花兜蘭原球莖分化增殖所需的配比一致，因此加快了其生長(zhǎng)速度，能夠達(dá)到短期快速增殖的效果。

3.2.3活性炭與白花兜蘭的生根

活性炭是組織培養(yǎng)工作中常用的物質(zhì)之一，它具有大量的小孔，所以具有巨大的表面積，吸附能力強(qiáng)[19]?；钚蕴吭诮M培培養(yǎng)中對(duì)苗的促進(jìn)作用最早是1974年Anagnostakis在對(duì)煙草的研究中發(fā)現(xiàn)[18]。后來(lái)活性炭的其他作用陸續(xù)被報(bào)道，如能促進(jìn)試管苗出芽，提高苗質(zhì)量；能提高花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率，促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)和胚狀體的形成，顯著提高成苗率[20-21]；能吸附培養(yǎng)基中有害物質(zhì)，還能模擬黑暗環(huán)境，促進(jìn)試管苗的生根[20-21]等。本研究結(jié)果表明，活性炭對(duì)白花兜蘭的生根具有良好的促進(jìn)作用，在培養(yǎng)基中加入活性炭，苗生長(zhǎng)快，且挺拔健壯，與劉燕等[19]的研究結(jié)論一致。