ZIP14對人肝細胞癌BEL-7404細胞生物學(xué)行為的影響*

鄭佳瑩，李亞東，鄭慶祝，余麗麗，吳慶偉，邱福南，伍嚴安，黃 毅△

(1福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，2福建省立醫(yī)院檢驗科，3福建省立醫(yī)院肝膽外科，福建 福州 350001)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤之一，具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)和死亡率高的特點，其治療仍是一個世界性的難題[1]。鋅(zinc，Zn)是人體重要的微量元素，是機體多種含有鋅指結(jié)構(gòu)的酶的關(guān)鍵組成成分[2]。正常的肝臟含有豐富的鋅[3]，而鋅在組織細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，與鋅轉(zhuǎn)運蛋白有關(guān)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)存在2個鋅轉(zhuǎn)運蛋白家族——SLC30基因家族和SLC39基因家族，其中在哺乳動物體內(nèi)SLC30基因家族又被命名為SLC39A基因家族，對應(yīng)編碼ZRT/IRT樣蛋白(ZRT/IRT-like proteins，ZIP)[4]，其功能是促進細胞外的鋅內(nèi)流入細胞漿內(nèi)[5]。研究表明HCC患者腫瘤組織中，鋅的含量明顯低于配對癌旁組織以及正常肝臟組織[6-9]；近來有國外學(xué)者報道，負責(zé)轉(zhuǎn)運鋅進入肝臟細胞的關(guān)鍵蛋白ZIP14，其在肝癌組織的表達和正常肝組織相比，亦出現(xiàn)明顯減少。因此推測HCC的腫瘤組織可能通過下調(diào)ZIP14的表達，減少胞漿內(nèi)鋅的攝入以避免鋅的積聚對腫瘤細胞的毒性作用[9]。本研究旨在觀察ZIP14在HCC腫瘤組織的表達情況，并構(gòu)建有效表達ZIP14的慢病毒載體，研究ZIP14過表達對HCC細胞活力、細胞周期及遷移和侵襲能力的影響，探討ZIP14作為一種潛在治療靶點在HCC的可能應(yīng)用前景。

材 料 和 方 法

1 臨床病例和檢材的收集

80例研究對象來自2014年2月～2016年2月期間于福建省立醫(yī)院肝膽外科住院行手術(shù)切除術(shù)的HCC患者，男66例，女14例，年齡 (54.3±12.2) 歲。收集患者經(jīng)手術(shù)切除的癌組織和距離癌灶5 cm的配對癌旁組織，經(jīng)生理鹽水清洗后，立即加入RNA保存液并置于4 ℃環(huán)境過夜，次日轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，備用real-time PCR的檢測；其中60例癌組織和配對癌旁組織收集后同時置4%甲醛固定，備用免疫組化法檢測。所有入選病例均為在肝炎與肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的HCC，術(shù)前均未接受放化療及生物治療等抗腫瘤治療，標本均經(jīng)病理檢查證實。所有被檢測者均知情同意。

2 細胞培養(yǎng)

人HCC細胞株 BEL-7404購自中國科學(xué)院細胞庫，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。2～3 d換液傳代1次。實驗用細胞為狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞。

3 主要試劑

氯仿(分析純)、異丙醇(分析純)和無水乙醇(分析純)購自上海振興化工一廠；RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒購自Thermo Fisher Scientific；DEPC水、TRIzol總RNA提取試劑和UltraSYBR Mixture (Low ROX)購自北京康為世紀生物科技有限公司；UltraSensitiveTMS-P 超敏試劑盒(兔)、酶底物顯色劑(DAB)和檸檬酸組織抗原修復(fù)液購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；兔抗人ZIP14抗體與兔抗人GAPDH抗體分別購自Rockland和CST；七水硫酸鋅(細胞培養(yǎng)級)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)和青-鏈霉素混合液(100×)均購自HyClone；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和胰蛋白酶(含EDTA)購自Gibco；MTT和DMSO購自Amresco；Matrigel 和Transwell小室購自Corning；細胞周期檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司；蛋白裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司根據(jù)設(shè)計合成，見表1。

4 主要方法

4.1Real-time PCR法檢測HCC癌組織與BEL-7404細胞ZIP14 的mRNA表達 用TRIzol法提取經(jīng)充分研磨的80例HCC癌組織和配對癌旁組織，用紫外分光光度儀對RNA純度與濃度進行測定，分別取1 μg RNA按照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以SYBR GreenⅠ為熒光染料，在real-time PCR儀(ABI ViiATM7)上進行擴增。反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 15 s、退火/延伸60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。熔解曲線分析條件為:95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參照，采用相對定量的方法，根據(jù)2-ΔΔCt計算公式對結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析。ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct，ΔΔCt=ΔCt(腫瘤組織)-ΔCt(癌旁組織)。擴增引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

4.2免疫組化法檢測HCC組織ZIP14蛋白的表達 60例HCC組織和配對癌旁組織經(jīng)4%甲醛固定后，制作成石蠟切片，采用免疫組化SP法染色，將抗ZIP14抗體按1 ∶100進行稀釋并滴加于每張切片上進行檢測，每批實驗設(shè)陽性和陰性對照。蛋白在正常肝臟細胞的表達為自身切片的陽性對照，PBS液取代 I 抗作為陰性對照。判斷方法和標準為細胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，高倍鏡下計數(shù)500個細胞，染色細胞<10%為陰性，≥10%為陽性，其中≥10%的腫瘤細胞中出現(xiàn)弱到中等強度完整細胞膜染色為弱陽性，≥10%的腫瘤細胞中出現(xiàn)中到高等強度完整細胞膜染色為強陽性。病理閱片由2個有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師雙盲閱片完成。

4.3Western blot法檢測BEL-7404細胞的ZIP14蛋白表達 按1×105∶1的比例加入細胞裂解液提取HCC細胞株BEL-7404的總蛋白，經(jīng)紫外分光光度計 (Beckman DU640)測定含量后，分別取等量總蛋白99 ℃變性5 min，進行12% SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至NC膜上；封閉NC膜1 h，加入相應(yīng)抗體4 ℃孵育過夜；TBS洗滌后，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(KPL)，室溫孵育1 h；TBS洗滌后加LumiGLO che-miluminescent substrate(KPL)室溫下孵育1 min，曝光，洗片，然后在GelDoc凝膠圖像分析儀(Bio-Rad)上掃描條帶的灰度，并以GAPDH為內(nèi)參照，計算ZIP14的相對表達量。

4.4表達ZIP14的慢病毒構(gòu)建 (1)ZIP14表達慢病毒載體的構(gòu)建：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的SLC39A14(即ZIP14)的序列NM_015359，設(shè)計出含交換配對堿基和酶切位點，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR釣取目的基因的1對引物，正向引物為：5’-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCAT-GAAGCTGCTGCTGCTGCACC-3’，反向引物為：5’- TCCTTGTAGTCCATACCCCCAATCTGGATCTGTCCTG-AATAC-3’。經(jīng)PCR擴增后，將得到的PCR產(chǎn)物(1 520 bp)，與線性化表達載體GV365(AgeI/AgeI酶切)混勻，37 ℃反應(yīng)30 min，構(gòu)建重組的GV365-ZIP14慢病毒表達載體，預(yù)期表達產(chǎn)物為56 kD的ZIP14蛋白，然后以線性環(huán)化的空載體作為陰性對照，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取重組陽性菌落行PCR及測序鑒定。(2)慢病毒包裝：通過Lipofectamine 2000(Invitrogen)將構(gòu)建的重組慢病毒表達載體和相對應(yīng)的包裝質(zhì)粒pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體共轉(zhuǎn)染293T細胞進行慢病毒包裝，48 h后收集上清液，濃縮，測定慢病毒的滴度，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?3)細胞轉(zhuǎn)染及實驗分組：根據(jù)預(yù)實驗摸索的MOI值(MOI=5)，將獲得的慢病毒轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的BEL-7404細胞(存在ZIP14的低表達)，12 h后吸去含病毒和聚凝胺的上清液，加入新鮮含有10% FBS的RPMI-1640上清液。轉(zhuǎn)染后96 h，用熒光倒置顯微鏡觀察，慢病毒轉(zhuǎn)染效率在80%以上的細胞分組用于后續(xù)實驗。每次實驗分3組：過表達(over-expression，OE)組，轉(zhuǎn)染ZIP14表達慢病毒；陰性對照(negative control，NC)組，轉(zhuǎn)染ZIP14空載體；空白對照(control，CON)組，未轉(zhuǎn)染慢病毒。(4)GV365-ZIP14表達的鑒定：收集慢病毒轉(zhuǎn)染5 d后的各組細胞，分別提取RNA和總蛋白，采用real-time PCR法檢測ZIP14的mRNA，Western blot法檢測ZIP14的蛋白，觀察ZIP14表達慢病毒在BEL-7404細胞內(nèi)表達ZIP14的效果。

4.5七水硫酸鋅預(yù)處理BEL-7404細胞 配制含有七水硫酸鋅的細胞完全培養(yǎng)基，使得鋅離子的終濃度分別為0、25、50、75和100 μmol/L。收集對數(shù)期BEL-7404細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為5.0×107/L，以每孔1 mL接種細胞于6孔板中，37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)20 h后，棄去原培養(yǎng)液，根據(jù)實驗設(shè)計加入含有相應(yīng)濃度鋅離子的完全培養(yǎng)基，每孔2 mL。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h；以此預(yù)處理的細胞用于后續(xù)的DNA倍體法檢測細胞周期、Transwell小室細胞遷移實驗和Transwell小室細胞侵襲實驗。

4.6MTT法檢測ZIP14過表達對BEL-7404細胞活力的影響 收集對數(shù)期BEL-7404細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為2.0×107/L，以每孔100 μL接種于96孔板，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)OE組、NC組和CON組細胞18 h；移去上層細胞培養(yǎng)液，加入200 μL終濃度為0、25、50、75和100 μmol/L的硫酸鋅，以NC組的0 μmol/L硫酸鋅為對照組，其余各加入不同濃度硫酸鋅的組別為實驗組，分別培養(yǎng)細胞24 h、48 h和72 h；加入20 μL MTT溶液，混勻，繼續(xù)孵育4 h。小心吸棄孔內(nèi)溶液，加入150 μL DMSO溶解甲臜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標儀(Thermo Multiskan MK3)測量各孔的吸光度(A)值(檢測波長為490 nm，校正波長為630 nm)，以空白對照孔調(diào)零，取3次試驗均值；各時間段細胞存活率(%)=A實驗組/A正常對照組×100%。

4.7DNA倍體法檢測細胞周期 收集硫酸鋅預(yù)處理的BEL-7404細胞，調(diào)整細胞懸液濃度至1.0×109/L；取1 mL單細胞懸液離心，去除培養(yǎng)基，PBS洗2次；加入1 mL DNA staining solution(已含有PI和RNase)以及10 μL破膜劑，漩渦振蕩器上振蕩5～10 s，避光30 min；在FACSCalibur流式細胞儀上對樣本進行檢測，運用Modfit軟件分析計算實驗結(jié)果。

4.8Transwell小室細胞遷移實驗 收集硫酸鋅預(yù)處理的BEL-7404細胞，PBS洗2次后，調(diào)整細胞懸液濃度至5.0×108/L；取出Transwell小室，置于24孔板內(nèi)，下室加入含有10% FBS的完全培養(yǎng)基600 μL，上室加入無血清細胞懸液100 μL。37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)24 h；將小室的上室取出，用棉簽擦去上室內(nèi)未遷移的細胞，PBS液漂洗小室2遍；用4%多聚甲醛固定上室20 min;其后PBS漂洗2遍，適當(dāng)風(fēng)干后用0.5%結(jié)晶紫染色20 min，PBS漂洗2遍，風(fēng)干。倒置顯微鏡(ZEISS Axiocam ERc 5s)高倍鏡下任意選取5個不相同的視野，拍照，計數(shù)細胞。另以各組0 μmol/L硫酸鋅預(yù)處理為正常對照組，其余不同硫酸鋅濃度組為實驗組，計算各組遷移變化率(%)=(1-實驗組平均細胞數(shù)/對照組平均細胞數(shù))×100%。

4.9Transwell小室細胞侵襲實驗 鋪膠前1 d將事先分裝好的Matrigel取出，4 ℃冰盒過夜；第2天用預(yù)冷過的RPMI-1640培養(yǎng)基以基質(zhì)膠∶RPMI-1640=1 ∶29的比例稀釋，迅速往每個小室的上室加入75 μL稀釋后的基質(zhì)膠，37 ℃靜置3 h。收集硫酸鋅預(yù)處理的BEL-7404細胞，PBS洗2次后，調(diào)整細胞懸液濃度至1.0×109/L；向已鋪好基質(zhì)膠的Transwell小室加入無血清細胞懸液100 μL，下室加入含有10% FBS的完全培養(yǎng)基600 μL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h；將小室的上室取出，用棉簽擦去上室內(nèi)未遷移的細胞，PBS液漂洗2遍；用4%多聚甲醛固定上室20 min；其后PBS漂洗2遍，適當(dāng)風(fēng)干后用0.5%結(jié)晶紫染色20 min，PBS漂洗2遍，風(fēng)干。倒置顯微鏡高倍鏡下任意選取5個不相同的視野，拍照，計數(shù)細胞。另以各組0 μmol/L硫酸鋅預(yù)處理為正常對照組，其余不同硫酸鋅濃度組為實驗組，計算各組侵襲變化率，侵襲率(%)=(1-實驗組平均細胞數(shù)/對照組平均細胞數(shù))×100%。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.0作圖，采用IBM SPSS Statistics 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。各組實驗均重復(fù)3次，所有計量資料的數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。采用Kolmogorov-Smirnov法進行正態(tài)性檢驗，對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，兩組樣本均值的差異比較采用t檢驗，多組樣本行Levene方差齊性檢驗，方差齊即采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行組間差異的顯著性檢驗，并用Bonferroni校正的t檢驗進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HCC組織ZIP14的表達

80例HCC組織ZIP14的mRNA表達水平明顯低于癌旁組織(P<0.01)，見圖1，其中86.25%(69/80)癌組織的ZIP14 mRNA表達出現(xiàn)下調(diào)。免疫組化檢測結(jié)果顯示ZIP14蛋白的陽性表達主要位于細胞膜，見圖2；60例HCC組織僅有8例呈ZIP14蛋白的強陽性表達(13.33%，8/60)，其余52例呈弱陽性表達(86.67%，52/60)，而配對癌旁組織均呈ZIP14蛋白的強陽性表達(100%，60/60)；HCC組織的ZIP14蛋白強陽性表達率明顯低于配對癌旁組織(P<0.01)。

Figure 1.The relative mRNA expression level of ZIP14 in the HCC tissues and matched liver tissues.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsmatched liver group.

圖1 HCC組織與配對癌旁組織ZIP14的mRNA表達

Figure 2.The protein expression of ZIP14 in the HCC tissues and matched liver tissues (IHC, ×400).

圖2 HCC患者癌組織和配對癌旁組織ZIP14蛋白的表達

2 GV365-ZIP14慢病毒在BEL-7404細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染效果

構(gòu)建GV365-ZIP14表達慢病毒并轉(zhuǎn)染BEL-7404細胞后，與NC組相比較，OE組ZIP14的mRNA與蛋白表達水平均明顯升高(P<0.01或P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The effect of GV365-ZIP14 on the mRNA and protein expression of ZIP14 in the BEL-7404 cells. A: the relative mRNA expression levels of ZIP14 among OE, NC and CON groups; B: the relative protein expression levels of ZIP14 among OE, NC and CON groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsNC group.

圖3 GV365-ZIP14對BEL-7404細胞ZIP14表達的影響

3 ZIP14過表達對BEL-7404細胞活力的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，100 μmol/L和125 μmol/L硫酸鋅處理的OE組細胞存活率明顯低于NC組(P<0.05)；培養(yǎng)48 h和72 h后，OE組細胞的存活率均明顯低于NC組(P<0.05或P<0.01)，見圖4。

Figure 4.The effect of GV365-ZIP14 on the viability of BEL-7404 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsNC group.

圖4 GV365-ZIP14對BEL-7404細胞活力的影響

4 ZIP14過表達對BEL-7404細胞周期分布的影響

DNA倍體法檢測結(jié)果顯示，在相同濃度硫酸鋅刺激下，OE組處于G0/G1期和S期的細胞比例均明顯低于NC組(P<0.05或P<0.01)，處于G2/M期的細胞比例均明顯高于NC組(P<0.01)，見圖5。

Figure 5.The effect of GV365-ZIP14 on the cell cycle distribution of BEL-7404 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC group.

圖5 GV365-ZIP14對BEL-7404細胞周期的影響

5 ZIP14過表達對BEL-7404細胞遷移能力的影響

Transwell小室細胞遷移實驗檢測結(jié)果顯示，在相同濃度硫酸鋅刺激下，OE組細胞的遷移能力均顯著低于NC組(P<0.01)，見圖6。 各組細胞的遷移變化率結(jié)果顯示，OE組的細胞遷移變化率改變程度均明顯高于NC組(P<0.05)，見圖7。

Figure 6.The effect of GV365-ZIP14 on the migration ability of BEL-7404 cells (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖6 GV365-ZIP14對BEL-7404細胞遷移能力的影響

Figure 7.The inhibition rate of migratory cells with ZnSO4treatment at different concentrations. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsNC group.

圖7 不同濃度硫酸鋅條件下細胞遷移的變化率

6 ZIP14過表達對BEL-7404細胞侵襲能力的影響

Transwell小室細胞侵襲實驗檢測結(jié)果顯示，在相同濃度硫酸鋅刺激下，OE組細胞的遷移能力均顯著低于NC組(P<0.01)，見圖8。各組細胞的變化率結(jié)果顯示，OE組的細胞侵襲變化率改變程度均明顯高于NC組(P<0.05)，見圖9。

討 論

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，ZIP家族部分成員在一些惡性腫瘤組織中存在異常表達，可能參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的進程。Kagara等[10]首先發(fā)現(xiàn)ZIP10蛋白表達量的增高與乳腺癌的轉(zhuǎn)移功能有關(guān)。Taylor等[11]發(fā)現(xiàn)，ZIP6是一種雌激素調(diào)控基因，與轉(zhuǎn)移性乳腺癌有關(guān)，且在低分化的腫瘤中呈高表達，有望成為新的乳腺癌診斷標志物。也有研究發(fā)現(xiàn)，ZIP4蛋白可明顯抑制前列腺癌細胞株DU145的增殖和侵襲能力[12]。

Figure 8.The effect of GV365-ZIP14 on the invasion ability of BEL-7404 cells (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖8 GV365-ZIP14對BEL-7404細胞侵襲能力的影響

Figure 9.The inhibition rate of invasive cells at different concentrations of ZnSO4.Mean±SD.n=3.##P<0.01vsNC group.

圖9 不同濃度硫酸鋅條件下細胞侵襲的變化率

作為ZIP家族的重要成員，ZIP14在肝臟組織中具有豐富的表達，是促進細胞外的鋅內(nèi)流入細胞漿內(nèi)、維護肝臟細胞鋅穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵鋅轉(zhuǎn)運蛋白。HCC癌組織存在低鋅的環(huán)境，可能與癌細胞下調(diào)ZIP14的表達以減少鋅的內(nèi)流有關(guān)[9]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，給予一定劑量外源鋅的刺激，可明顯抑制HCC細胞的生長、遷移和侵襲能力[13]；在保持外源鋅刺激的條件下，對ZIP14的表達予以上調(diào)以進一步提高細胞內(nèi)鋅的濃度，對HCC細胞的生物學(xué)行為是否具有更明顯的影響，值得探討。

本研究real-time PCR與免疫組化的檢測結(jié)果從mRNA與蛋白表達兩個層面均顯示ZIP14在HCC組織中存在明顯的低表達。在此基礎(chǔ)上，我們通過重組表達慢病毒的轉(zhuǎn)染，成功構(gòu)建了能穩(wěn)定過表達ZIP14蛋白的HCC細胞株BEL7404-ZIP14。將該BEL7404-ZIP14設(shè)為OE組，轉(zhuǎn)入空載體慢病毒的BEL-7404細胞株設(shè)為NC組，正常BEL-7404細胞株設(shè)為CON組，3組細胞共同進行后續(xù)實驗。MTT 實驗結(jié)果顯示過表達ZIP14的細胞活力受到明顯抑制，此外，ZIP14的過表達對BEL-7404細胞活力抑制的現(xiàn)象在含有外源鋅的條件下表現(xiàn)得更為明顯，表現(xiàn)為加入鋅離子培養(yǎng)24 h后在高濃度鋅離子刺激下OE組細胞的存活率相比NC組即出現(xiàn)明顯的降低。選取MTT結(jié)果具明顯改變的鋅離子濃度用于后續(xù)實驗，經(jīng)細胞周期分析發(fā)現(xiàn)ZIP14過表達的細胞處于G2/M期的比例遠高于NC組，該現(xiàn)象在鋅離子的刺激下效果更具明顯性，表明ZIP14的過表達可使HCC細胞被明顯阻滯在G2/M期，從而阻止細胞進入下一個細胞周期的循環(huán)，進而發(fā)揮對BEL-7404細胞增殖的抑制作用(在外源鋅離子的刺激抑制作用的基礎(chǔ)上)。

ZIP14的過表達對HCC細胞遷移與侵襲的能力亦具有影響，我們的實驗結(jié)果顯示，BEL-7404細胞遷移與侵襲率隨培養(yǎng)環(huán)境鋅離子濃度的提高而呈現(xiàn)降低的趨勢，而OE組遷移與侵襲的細胞數(shù)明顯低于NC組，提示ZIP14的過表達可明顯抑制BELE-7404細胞的遷移與侵襲能力，推測這與ZIP14的過表達有助于鋅離子的轉(zhuǎn)運，從而進一步促進細胞漿內(nèi)鋅的積聚，導(dǎo)致鋅對HCC細胞的毒性作用增強有關(guān)。

綜上所述，本課題組從mRNA與蛋白表達兩個層面均驗證了ZIP14在HCC組織中存在明顯的低表達。而ZIP14的過表達有助于抑制HCC細胞的活力、遷移與侵襲能力，并使細胞周期被阻滯在G2/M期，且這種抑制作用隨著外源性鋅離子濃度的提高表現(xiàn)得更為明顯；這種通過上調(diào)鋅轉(zhuǎn)運蛋白表達以促進細胞內(nèi)鋅的積聚，從而抑制HCC細胞生物學(xué)行為的方式，為HCC治療新靶點的選擇與相關(guān)研究的開展提供了新的視角。