習大林,項 靜,蔡軍偉,趙舒祺,吉晶晶,李 月,蘇 婷,姜 勇,劉靖華
(南方醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院,廣東省蛋白質(zhì)組學重點實驗室,廣東 廣州 510515)
細菌脂蛋白(bacterial lipoprotein,BLP)是廣泛存在于革蘭氏陰性和陽性細菌外膜的脂蛋白,可由生長或裂解的細菌釋放。既往研究發(fā)現(xiàn),給予動物小劑量BLP后,再給予大劑量或者致死劑量的BLP時,能大大降低動物的死亡率,這種現(xiàn)象被稱為BLP耐受[1]。研究發(fā)現(xiàn),BLP耐受不僅能減少致死劑量的BLP引起的動物死亡,而且能防御大劑量的細菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的內(nèi)毒素休克,即所謂的交叉耐受。更重要的是,BLP耐受還能降低動物感染細菌或者盲腸結(jié)扎穿刺所引起的死亡率[1]。BLP耐受是生物在長期進化過程中形成的一種保護性調(diào)節(jié)機制,目的是避免機體對BLP或者內(nèi)毒素再次刺激過度反應而造成損傷,是機體防御機制的重要組成部分。因此,探討B(tài)LP耐受保護作用的機制不僅有助于了解機體在抗感染過程中的適應性應答機制,加深我們對膿毒性休克發(fā)生機制的認識,而且還有可能為膿毒性休克的防治提供新的思路。
目前,有關(guān)BLP耐受的機制尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn),在機體(細胞)對BLP的耐受過程中,其突出表現(xiàn)之一為BLP耐受機體(細胞)對病原菌的吞噬和清除能力顯著增強[2]。吞噬細胞(例如巨噬細胞)對細菌的清除包括吞噬體形成、吞噬溶酶體內(nèi)的酶對細菌的殺滅和消化等一系列過程,其中吞噬相關(guān)受體介導的對病原微生物的吞噬是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細胞表面吞噬相關(guān)受體主要包括調(diào)理素依賴性受體(如Fc受體和補體受體)以及調(diào)理素非依賴受體(如清道夫家族受體)[3-4]。Fc受體和補體受體在BLP耐受巨噬細胞中吞噬作用增強已得到證明[1],但是膠原樣結(jié)構(gòu)巨噬細胞受體(macrophage receptor with collagenous structure,MARCO)是否也參與了BLP耐受的過程尚不清楚。本研究利用骨髓來源的巨噬細胞(bone marrow derive macrophages,BMDMs)為細胞模型,探討了MARCO在BLP耐受巨噬細胞吞噬能力增強過程中的作用。
TRIzol總RNA提取試劑和LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自Thermo Fisher;熒光定量PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ-101)及SYBR Green(QPK-201)購自TOYOBO;熒光定量PCR引物由華大基因設(shè)計合成;小干擾RNA由吉瑪基因公司(中國)合成; 小鼠MARCO-APC抗體購自R&D;MARCO(IBL-12)和抗β-actin抗體購自Santa Cruz;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)和OPTI-MEM培養(yǎng)基購自Gibco。
SPF級C57BL/6小鼠,8~10周齡,18~20 g,由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供,許可證號為SCXK(粵)2016-0041。大腸桿菌(E.coli,K12)菌株和轉(zhuǎn)染了 pET-14b-GFP質(zhì)粒的大腸桿菌(GFP-E.coli)由本室保存。L929細胞購自中國科學院細胞研究所(上海)。
3.1BMDMs的分化及培養(yǎng) BMDMs的分化及培養(yǎng)參考文獻[5]方法進行。將L929細胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)5~7 d,收集細胞培養(yǎng)上清,用0.22 μm濾器過濾后與含有20% FBS的DMEM按體積比1 ∶4比例混勻,配制成BMDMs完全培養(yǎng)基,備用。取C57BL/6小鼠處死,暴露并分離股骨和脛骨,用DMEM沖洗骨髓腔,300×g離心10 min后收集骨髓沉淀;用完全培養(yǎng)基充分吹打骨髓沉淀使其分散成單細胞懸液,平鋪至培養(yǎng)瓶中,放于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,獲得分化成熟的BMDMs。取1×105個BMDMs加入巨噬細胞分子標志F4/80抗體(1 ∶10)并在室溫下標記30 min,再與FITC熒光標記Ⅱ抗避光孵育30 min,流式細胞儀檢測F4/80抗體標記的陽性細胞比例大于96%。
3.2BLP耐受BMDMs的制備 取成熟的BMDMs細胞,給予0.1 μg/L的BLP處理24 h,該部分細胞為 BLP耐受的 BMDMs;未經(jīng) BLP預處理的即為非耐受BMDMs(naive BMDMs)。
3.3吞菌實驗 取naive或BLP耐受BMDMs,按細胞與細菌1 ∶ 50的比例加入GFP標記的大腸桿菌,感染30 min后,DPBS洗3次,洗去細胞外細菌,收集細胞用熒光顯微鏡直接觀察并拍照,或者用流式細胞儀檢測細胞吞菌情況。
3.4qPCR TRIzol法提取總RNA后,逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA,分別加入MARCO及β-actin引物進行擴增,使用熒光定量PCR儀記錄擴增循環(huán)數(shù),通過2-ΔΔCt法進行相對定量分析。目的基因的引物序列見表1。
表1 qPCR引物序列
3.5流式細胞術(shù) BMDMs感染細菌30 min后,用0.25 %胰酶消化細胞,800×g離心5 min收集細胞。加入MARCO-APC熒光抗體,避光孵育15 min后,離心棄上清,DPBS重懸,用流式細胞術(shù)進行檢測。GFP的激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為507 nm;APC熒光的激發(fā)波長為630 nm,發(fā)射波長為660 nm。
3.6MARCO小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)實驗 本實驗參照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。取1×106BMDMs與2 μg 靶向MARCO的siRNA(siMARCO)或?qū)φ誖NA(scramble siRNA,Scr RNA)混合,加入6 μL lipofectamine 3000,干擾24 h后用熒光定量PCR檢測干擾效率。siMARCO的序列如下:sense: 5’-GCAUGGCAUGCAUGGC-CAUTT-3’,antisense: 5’-CTTCTTGGGCACTGGAT-CAT-3’;ScrRNA: sence: 5’-GCGAGCACAGCTTCTTT-GC-3’,antisense: 5’-GCGCAGCGATATCGTCATC-3’。MARCO的干擾效率分別用qPCR(mRNA表達水平)及流式細胞術(shù)(蛋白表達水平)檢測,具體方法同前。
3.7細胞免疫熒光 BMDM與細菌共孵育30 min后,用DPBS洗3次,4%多聚甲醛固定10 min,之后用0.1 % Triton X-100處理10 min,并用封閉液封閉1 h;然后加入MARCO抗體室溫孵育2 h;用PBS 洗3遍后,用IF555標記的山羊抗大鼠IgG(1 ∶500)在室溫下進行染色,DAPI復染細胞核,最后在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。GFP的激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為507 nm;IF555 熒光激發(fā)波長為550 nm,發(fā)射波長為570 nm。
采用SPSS 20.0軟件進行分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,在滿足方差齊性的條件下,2組間比較使用非配對t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
圖1A是實驗流程及干預示意圖,BLP耐受(BLP-tolerized)組給予BMDMs細胞0.1 μg/L BLP預處理24 h,再給予GFP標記的大腸桿菌感染;naive組的BMDMs未經(jīng)BLP預處理。無論是BLP 耐受組BMDMs還是naive 細胞,給予細菌感染30 min后,共聚焦顯微鏡下可見細胞胞漿內(nèi)均有綠色熒光,且BLP 耐受組BMDMs的綠色熒光明顯多于naive 組細胞,見圖1B;流式細胞術(shù)檢測細胞吞菌結(jié)果顯示,BLP耐受組較naive組峰值右移,中位熒光強度(median fluorescence intensity,MFI)明顯升高(P<0.05),見圖1C,提示與naive組相比,BLP耐受組BMDMs吞噬細菌能力明顯增強。
Figure 1.The effect of BLP tolerance on phagocytosis of macrophage. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnaive BMDMs.
圖1 BLP耐受對巨噬細胞吞噬能力的影響
qPCR結(jié)果顯示,在靜息狀態(tài)時naive組BMDMs中MARCO的mRNA轉(zhuǎn)錄水平很低,3次定量PCR的Ct值均值為29.37; BLP耐受組BMDMs的MARCO mRNA轉(zhuǎn)錄增加,在加入BLP 24 h時是naive細胞的890倍;與naive組相比,BLP耐受巨噬細胞MARCO的mRNA水平顯著升高(P<0.05); 給予大腸桿菌刺激30 min后,2組巨噬細胞中MARCO mRNA的表達均較未刺激時進一步升高,BLP耐受組仍顯著高于naive組(P<0.05),見圖2A。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,BLP耐受能顯著上調(diào)巨噬細胞膜表面MARCO的蛋白表達水平(P<0.05),且在大腸桿菌刺激后仍維持高表達并顯著高于naive組(P<0.05),見圖2B。提示BLP耐受在mRNA和蛋白表達水平均能明顯上調(diào)MARCO分子的表達。
qPCR檢測顯示,siMARCO組BMDMs的 mRNA干擾效率超過70%(P<0.05),見圖3A;流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,siMARCO組BMDMs的MARCO蛋白表達水平較scrRNA組明顯降低(P<0.05),見圖3B,提示RNAi效果理想。流式結(jié)果進一步顯示,干擾MARCO表達后,無論是naive還是BLP耐受組BMDMs吞噬細菌的量都有減少,其中對BLP耐受組的吞菌影響比較顯著(P<0.05),見圖3C。
Figure 2.The effect of BLP tolerance on MARCO expression in the BMDMs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnaive BMDMs.
圖2 BLP耐受對巨噬細胞MARCO表達的影響
共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示,靜息狀態(tài)的naive細胞胞漿中有微弱的紅色熒光,表明MARCO的表達量很低;細菌刺激30 min后代表MARCO的紅色熒光增強不明顯;BLP耐受BMDMs在未受細菌刺激時,胞漿及胞膜位置有較強的紅色熒光,表明MARCO在BLP耐受BMDMs的表達較naive顯著增強;細菌刺激后BLP耐受BMDMs的紅色熒光仍然較naive組明顯增強。干擾MARCO表達后,無論是naive還是BLP耐受BMDMs細胞的綠色熒光均明顯減弱,以BLP耐受細胞綠色熒光降低較為顯著,見圖4,提示下調(diào)MARCO表達減弱BLP耐受細胞的吞菌能力。
清道夫受體是一類表達于巨噬細胞、樹突狀細胞和內(nèi)皮細胞等細胞表面的跨膜糖蛋白分子[6]。近年來發(fā)現(xiàn),清道夫受體除了吞噬脂蛋白參與脂質(zhì)調(diào)節(jié)外,還作為一種模式識別受體,通過識別多種微生物結(jié)構(gòu),即病原相關(guān)分子模式,包括LPS、磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)及細菌CpG DNA等,在固有免疫中發(fā)揮重要作用[7-9]。目前已鑒定的清道夫受體有8類,分別用A類~I類表示(C類除外)。MARCO也被稱作SCARA2或SR-A2,是A類清道夫受體的一種,在巨噬細胞的吞噬中發(fā)揮重要作用。與該家族大多數(shù)成員不同,MARCO在靜息狀態(tài)下僅表達于脾臟和淋巴結(jié)等組織的巨噬細胞,但多種病原體可通過TLR信號通路迅速上調(diào)MARCO水平,誘導大多數(shù)組織巨噬細胞MARCO表達增加,例如肝臟枯否細胞等[10-12]。我們發(fā)現(xiàn),靜息狀態(tài)的BMDMs中MARCO的mRNA水平很低;當受到BLP刺激后,MARCO的mRNA水平增加,在BLP刺激24 h時是naive細胞的890倍;與此同時細胞膜表面的MARCO表達也明顯增加,與以往的報道一致。關(guān)于BLP上調(diào)MARCO的具體機制目前尚不清楚。以往的研究表明,在感染狀態(tài)下,MARCO的上調(diào)主要是通過MyD88信號通路介導的[13];在樹突狀細胞中,這個過程還可能與p38絲裂原激活的蛋白激酶相關(guān)[14]。研究發(fā)現(xiàn)LPS或LTA耐受的巨噬細胞中MARCO的上調(diào)依賴于組蛋白第四位賴氨酸的三甲基化修飾,即H3K4me3參與了固有免疫耐受中MARCO蛋白增加的調(diào)控過程[15]。此外,研究發(fā)現(xiàn)瘧原蟲感染可通過TLR2信號通路,增加H3K4me3,出現(xiàn)類似于固有免疫耐受的表現(xiàn)[16]。BLP作為一種病原體相關(guān)分子模式,主要通過TLR2啟動內(nèi)源性免疫應答,因而推測BLP耐受上調(diào)MARCO可能是與TLR2信號通路活化、組蛋白修飾增加相關(guān)。
Figure 3.The effect of silencing MARCO on phagocytosis of BLP tolerized BMDMs.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsscrRNA group.
圖3 干擾MARCO表達對 BLP耐受巨噬細胞吞噬能力的影響
Figure 4.The effect of MARCO doion-regulation on the phagocytosis of BMDMs exhibited by fluorescence microscopy. Red: MARCO; green: GFP-E.coli; blue: DAPI.
圖4 熒光顯微鏡檢測下調(diào)MARCO表達對巨噬細胞吞菌能力的影響
以往的研究表明,MARCO參與了機體對抗細菌感染的過程。例如,MARCO基因敲除小鼠較野生型小鼠對肺炎鏈球菌感染抵抗力明顯下降[17];在斑馬魚的研究中發(fā)現(xiàn),MARCO可顯著促進巨噬細胞對細菌的內(nèi)吞和清除[18];本研究用原代的巨噬細胞BMDMs證明,MARCO與巨噬細胞吞噬細菌的能力有關(guān),因為BLP耐受時MARCO表達水平上調(diào),同時對大腸桿菌的吞噬能力增強,而敲減MARCO表達后,這種增強的吞噬作用減弱,提示BLP耐受增強巨噬細胞吞噬能力依賴于MARCO的表達水平。MARCO表達后如何促進巨噬細胞的吞噬,其機制尚不完全清楚。
吞噬作用涉及復雜的過程,包括細菌的識別和黏著、吞噬杯形成和吞噬體的閉合,這些都涉及細胞骨架的重構(gòu)。有研究發(fā)現(xiàn),肺泡巨噬細胞通過其表面的MARCO識別并結(jié)合細菌,啟動細胞骨架重構(gòu),進而上調(diào)細胞表面MARCO蛋白的表達和細菌吞噬能力[19]。進一步研究證實Rac1-GTP參與調(diào)控了MARCO的信號轉(zhuǎn)導并激活肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3復合體,從而誘導一系列吞噬細菌所必需的行為,包括纖維狀肌動蛋白(F-actin)的聚合、絲狀偽足的形成以及細胞表面MARCO蛋白表達的增加[19]。然而,從老年鼠體內(nèi)分離出的肺泡巨噬細胞表現(xiàn)出Rac1 mRNA和蛋白低表達,導致Rac1-GTP水平、肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3復合體水平的降低以及隨之而來的纖維狀肌動蛋白的聚合、絲狀偽足的形成以及細胞表面MARCO蛋白表達減弱,老年肺泡巨噬細胞的細菌吞噬能力也因此下降。值得注意的是,該研究認為MARCO在巨噬細胞表達與F-actin聚合誘導的細胞骨架重排有關(guān),后者促進MARCO的表達,反過來增強肺巨噬細胞吞噬大腸桿菌的能力;而在我們的研究中,BLP預處理24 h就能大大增加BMDMs細胞表面MARCO的表達,細菌刺激后MARCO進一步增加并不明顯;MARCO蛋白表達變化與其mRNA轉(zhuǎn)錄變化一致,提示BLP耐受巨噬細胞MARCO在細胞表面的表達可能與轉(zhuǎn)錄增強有關(guān)。但是細菌感染后MARCO在細胞膜表面的表達是否與F-actin聚合及絲狀偽足的形成有關(guān),需要進一步實驗探討。