解毒清肺合劑對肺炎支原體感染大鼠肺組織NF-κB和p38 MAPK通路的影響*

嚴(yán)春霞，何國產(chǎn)，聞人慶，張艷芳

(金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 金華 321000)

肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，MP)是常見的呼吸道感染致病原，可致嚴(yán)重肺炎，在世界各地均有發(fā)病，近年來已引起了研究者的關(guān)注。 MP感染的肺炎包括肺實(shí)質(zhì)性肺炎、重癥肺炎和支氣管炎等，患者易出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、面色不好和食欲不振等癥狀[1-2]。MP可引起肺部嚴(yán)重炎癥反應(yīng)并可累及肺外組織和多臟器，引起臟器功能紊亂，嚴(yán)重影響了患者的身體健康甚至危害生命[3]。核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和p38絲裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)信號通路在炎癥過程中發(fā)揮重要的作用，兩者通過調(diào)控多種炎癥因子，如白細(xì)胞介素12(interleukin-12,IL-12)、IL-13和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及炎性細(xì)胞的浸潤促進(jìn)肺組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展[4]。多項研究表明，NF-κB和p38 MAPK信號通路參與肺炎鏈球菌引起的肺炎，但NF-κB和p38 MAPK信號通路在MP感染肺炎中的作用報道較少。本研究以NF-κB和p38 MAPK信號通路為靶點(diǎn)，探索解毒清肺合劑對MP感染的肺組織的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級SD大鼠30只，雌雄各半，7～8周齡，體質(zhì)量(195.0±9.5) g。購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心[許可證號：SCXK(浙)2018-0029]，實(shí)驗(yàn)期間飼養(yǎng)于重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室SPF級實(shí)驗(yàn)動物房。

2 試劑與儀器

MP標(biāo)準(zhǔn)株由丹麥Statens Serum 研究院提供；RIPA裂解液、ECL發(fā)光液和2×SDS-PAGE蛋白緩沖液購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF轉(zhuǎn)印膜和SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自Bio-Rad；兔抗大鼠GAPDH、NF-κB p50、I-κBα和p38 MAPK抗體購自Abcam;HRP標(biāo)記的兔抗山羊 II 抗購自Jackson Immuno Research；免疫組化試劑盒購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；TRIzol RNA提取試劑盒購自Invitrogen；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa；ELISA試劑盒購自上海藍(lán)基生物科技有限公司。UV-1601紫外分光光度計購自Shimadzy；凝膠成像系統(tǒng)UVP；熒光定量PCR儀購自Eppendorf。

3 藥物

解毒清肺合劑(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，每瓶100 mL)，8 mL/kg；地塞米松磷酸鈉(天津金耀氨基酸有限公司)以生理鹽水配制，0.5 mg·kg-1·d-1。

4 方法

4.1實(shí)驗(yàn)動物的分組與給藥 雌雄各半SD大鼠40只，實(shí)驗(yàn)動物在SPF實(shí)驗(yàn)室適應(yīng) 1 周后隨機(jī)分為空白對照(blank control)組、模型(model)組、解毒清肺(Jiedu-Qingfei)組和陽性對照(positive control)4組，每組10只。根據(jù)文獻(xiàn)報道[5]對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行建模，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，模型組、解毒清肺組和陽性對照組均鼻孔內(nèi)緩慢滴入1×109CFU/L MP液100 μL，連續(xù)4 d，隨大鼠自然呼吸吸入氣道至肺部，空白對照組滴入等量的MP無菌培養(yǎng)液。各組均在接種完成后第2天處死1只大鼠進(jìn)行MP核酸檢測，同時其余大鼠開始灌胃治療，空白對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，解毒清肺組每天給予8 mL/kg的解毒清肺合劑，陽性對照組給予地塞米松磷酸鈉(0.5 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)治療4周。

4.2樣本的采集 治療4周結(jié)束后，各組大鼠均有死亡，每組隨機(jī)選取6只大鼠采集尾靜脈血3 mL，室溫靜置30 min，1 500×g離心15 min，分離的血清置于EP管，-80 ℃保存；處死大鼠后，解剖暴露氣管，將留置針插入氣管，夾緊近端，用0.2 mL 預(yù)冷4 ℃無菌生理鹽水反復(fù)灌洗4次，收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，-80 ℃保存；大鼠稱重，腹主動脈放血處死大鼠，取右肺組織于4%中性甲醛溶液固定48 h，轉(zhuǎn)移至0.1 mol/L PBS溶液中保存，用于病理形態(tài)和HE染色；另取左肺組織中葉，液氮保存；用于檢測NF-κB p50、NF-κB抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB α，I-κBα)和p38 MAPK的mRNA及蛋白水平。

4.3炎癥因子的檢測 采用ELISA方法檢測血清和BALF中IL-12、IL-13和TNF-α水平，檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

4.4肺組織病理評分 本次檢測由專業(yè)科室病理醫(yī)師進(jìn)行隨機(jī)檢測，該評價系統(tǒng)由0～26分范圍的可數(shù)評分組成，每張切片有5個分類評價系統(tǒng)組成，得分越高代表肺組織的炎癥浸潤程度越高[6]。得分組成由切片各部分分析，管腔周圍浸潤的支氣管和細(xì)支氣管數(shù)目、管腔內(nèi)滲出程度、管腔周圍浸潤程度、血管周圍浸潤程度和實(shí)質(zhì)性肺炎程度進(jìn)行評分，再累計總分。對每側(cè)肺分別評分，隨后2側(cè)分?jǐn)?shù)相加除以2得出平均數(shù)為肺組織病理學(xué)評分。肺組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)：(1)細(xì)支氣管和支氣管周圍浸潤數(shù)目的百分比，0表示無；1表示少許(<25%)；2表示許多(25%～75%)；3表示所有(>75%)。(2)細(xì)支氣管和支氣管滲出，0表示無；1表示輕度腔閉合(<25%閉合)；2表示重度腔閉合(25%～50%)；3表示大多數(shù)腔閉合(>50%)；(3)血管周圍浸潤部分的百分比，0表示無；1表示少(<10%閉合)；2表示許多(10%～50%)；3表示大多數(shù)(>50%)；(4)細(xì)支氣管、支氣管浸潤的定性，0表示無，見于正常動物，偶爾可見輕微浸潤或者支氣管周圍淋巴樣細(xì)胞團(tuán)塊；1表示輕度，伴有間斷的環(huán)；2表示中度，新月形的環(huán)或者完整的環(huán)；3表示嚴(yán)重，完全的環(huán)，有>5～10個細(xì)胞厚度；(5)實(shí)質(zhì)性肺炎，0表示無；1表示輕度，斑塊實(shí)質(zhì)性浸潤；2表示重度，斑塊出現(xiàn)融合的浸潤。分?jǐn)?shù)=(1)+(2)+(3)+(4)+(5)。

4.5RT-qPCR檢測肺組織中mRNA的表達(dá) 提取RNA時，迅速從液氮中取出肺組織樣品，無菌剪刀剪下0.5 g于5 mL試管中，TRIzol抽提總RNA，組織勻漿機(jī)勻漿30 s，提取總RNA。紫外分光光度計測定吸光度(A)值，記錄A260/A280和A260/A230，根據(jù)測定值計算mRNA濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-qPCR檢測mRNA表達(dá)水平，反應(yīng)體系為20 μL(Ultra SYBR Mixture(2×)10 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各0.4 μL、無RNA酶H2O 7.2 μL)。 SYBR Green法熒光定量PCR參數(shù)設(shè)置為:95 ℃預(yù)變性2 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照。根據(jù)NCBI相應(yīng)的序列，按照引物設(shè)計原則，采用Primer Premier 5.0 設(shè)計引物，由上海生工有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)的引物序列

4.6Western blot檢測肺組織中蛋白的表達(dá) 取凍存大鼠肺組織樣品約0.1 g，加入含1%蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液1 mL，裂解肺組織細(xì)胞，提取樣本總蛋白。BCA法檢測提取樣品的蛋白濃度，記錄562 nm處吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算蛋白濃度。99 ℃煮沸10 min變性蛋白，分裝儲存?zhèn)溆谩DS-PAGE后將蛋白轉(zhuǎn)于PVDF膜上，5%脫脂奶封閉液封閉1 h；稀釋 I 抗4℃孵育過夜，TBST液洗膜3次，每次5min； II抗室溫孵育2 h，TBST液洗膜3次，每次5 min。ECL法顯影，用ImageJ對顯影照片中的目的條帶進(jìn)行灰度分析。以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行比對。

5 統(tǒng)計學(xué)方法

采集的原始數(shù)據(jù)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組比較采用F檢驗(yàn)，各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；不同時點(diǎn)的組間比較采用重復(fù)測量方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 實(shí)驗(yàn)動物的一般情況

對各組大鼠接種后第2天進(jìn)行MP核酸檢測，PCR產(chǎn)物電泳發(fā)現(xiàn)模型組、解毒清肺組和陽性對照組于583 bp處有清晰條帶，空白對照組無條帶, 見圖1。由此得知除空白對照組外其余大鼠均感染了MP，表明MP感染大鼠造模成功。每天對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)感染MP第2天開始，大鼠出現(xiàn)明顯倦怠，造模第4天，部分大鼠出現(xiàn)咳嗽，食欲不振。

2 大鼠肺組織的HE染色及肺組織病理評分

HE染色觀察肺組織病理切片，統(tǒng)計肺組織病理評分，大鼠感染MP后模型組、解毒清肺組和陽性對照組肺組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤；治療后解毒清肺組和陽性對照組炎性細(xì)胞浸潤程度減輕，模型組仍存在炎性細(xì)胞浸潤；治療前后對照組變化不顯著，均無炎性細(xì)胞浸潤，見圖2；治療第1天模型組、解毒清肺組和陽性對照組肺組織病理評分顯著高于空白對照組，4組病理組織評分差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療結(jié)束后模型組的肺組織病理評分顯著高于空白對照組、解毒清肺組和陽性對照組，治療后空白對照組和解毒清肺組、陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見表2。

Figure 1.Electrophoretic strip map of PCR products

圖1 PCR產(chǎn)物電泳條帶圖

Figure 2.The pathological observation of the lung tissues (HE staining，×100).

圖2 肺組織病理表現(xiàn)

3 治療后血清和BALF中IL-12、IL-13和TNF-α水平

支原體感染后模型組血清的IL-12水平顯著低于空白對照組(P<0.05)，解毒清肺組和陽性對照組血清的IL-12水平顯著高于模型組(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)；支原體感染大鼠血清的IL-13和TNF-α水平顯著升高，解毒清肺組和陽性對照組IL-13和TNF-α水平顯著低于模型組，解毒清肺組與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見表3。

表2 4組大鼠不同時點(diǎn)肺組織病理評分比較

Table 2.Comparison of pathological scores of lung tissues in 4 groups of rats at different time points (Mean±SD.n=6)

Group 1 d28 dBlank control5.56±1.465.61±1.24Model 15.03±2.41#13.05±1.89*#Jiedu-Qingfei13.85±2.16#6.21±2.37**Positive control13.67±2.13#4.15±1.05**

#P<0.05vsblank control group;*P<0.05,**P<0.01vs1 d in the same group.

支原體感染后模型組BALF的IL-12水平顯著低于空白對照組(P<0.05)，解毒清肺組和陽性對照組BALF的IL-12水平顯著高于模型組(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)；支原體感染大鼠BALF的IL-13和TNF-α水平顯著升高，解毒清肺組和陽性對照組后IL-13和TNF-α水平顯著低于模型組，解毒清肺組與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見表4。

表3 4組大鼠血清中IL-12、IL-13和TNF-α水平的比較

*P<0.05vsblank control group;#P<0.05vsmodel group.

表4 4組大鼠BALF中IL-12、IL-13和TNF-α水平的比較

*P<0.05vsblank control group;#P<0.05vsmodel group.

4 肺組織中NF-κB p50、p38 MAPK和I-κBα的mRNA表達(dá)水平比較

RT-qPCR檢測NF-κB p50、p38 MAPK和I-κBα的mRNA表達(dá)水平結(jié)果顯示，與對照組相比，支原體感染的模型組NF-κB p50和p38MAPK的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，解毒清肺組和陽性對照組NF-κB p50和p38 MAPK的mRNA表達(dá)水平與模型組比較顯著降低(P<0.01)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)；支原體感染模型組I-κBα的mRNA表達(dá)水平較對照組顯著降低(P<0.05)，解毒清肺組和陽性對照組I-κBα mRNA表達(dá)水平較模型組顯著升高(P<0.05)，解毒清肺組與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖3。

5 肺組織中NF-κB p50、p38 MAPK和I-κBα 蛋白的表達(dá)水平

Western blot檢測肺組織NF-κB p50、p38 MAPK和I-κBα 蛋白表達(dá)水平的結(jié)果顯示，肺組織中模型組的NF-κB p50和p38 MAPK蛋白表達(dá)水平顯著高

Figure 3.The mRNA expression levels of NF-κB p50, p38 MAPK and I-κBα.Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖3 NF-κB p50、p38 MAPK和I-κBα的mRNA表達(dá)水平

于空白對照組，解毒清肺組和陽性對照組蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)；模型組的I-κBα蛋白表達(dá)水平顯著低于空白對照組，經(jīng)解毒清肺合劑治療后其蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，解毒清肺組與陽性對照組無顯著差異，見圖4。

Figure 4.The protein expression levels of NF-κB p50, p38 MAPK and I-κBα. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsmodel group.

圖4 NF-κB p50和p38 MAPK和I-κBα 蛋白的表達(dá)水平

討 論

免疫學(xué)研究認(rèn)為，MP感染與免疫反應(yīng)具有密切的聯(lián)系，并且細(xì)胞和體液免疫共同參與MP引起的肺炎，MP所引起的肺炎所致?lián)p傷屬于宿主自身免疫所致，并且多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)參與其中[7]。Th1與Th2在免疫反應(yīng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但機(jī)體受到病原入侵時，動態(tài)平衡就會受到破壞[8]。MP感染患者引起氣道高反應(yīng)，影響Th1與Th2的動態(tài)平衡，影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放[9]。

清熱解肺合劑組方有麻杏石甘湯加桔梗、僵蠶、牛蒡子、白花蛇舌草和黃芩等中草藥，全方寒熱相伍、升降結(jié)合，牛蒡子、白花蛇舌草和黃芩相伍清熱，桔梗和僵蠶具有化痰之功效，麻黃和杏仁具有宣肺降肺之功效[10]。藥物配伍起到清熱解肺、祛痰化濁之功效。因此，使用此配方治療肺炎支原體感染大鼠。

IL-12主要由Th1細(xì)胞分泌，IL-13主要由Th2細(xì)胞分泌，IL-12分泌不足時Th2反應(yīng)加強(qiáng)[11]。IL-13可調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞的平衡，參與炎癥反應(yīng)，促使氣道上皮細(xì)胞分泌黏液。文獻(xiàn)報道，MP感染后Th2細(xì)胞分泌增多，IL-13水平升高[12]。王志華等[13]報道，MP感染患者IL-13顯著升高。本研究結(jié)果顯示，MP感染后，血清和BALF中IL-13水平顯著升高，IL-12水平顯著降低，表明感染MP可引起機(jī)體IL-13和IL-12水平的顯著變化，引起機(jī)體Th1與Th2平衡失調(diào)。解毒清肺合劑治療后IL-13和IL-12與陽性對照組接近，恢復(fù)至正常水平，表明解毒清肺合劑可以抑制Th1與Th2失衡引起的炎癥因子分泌失調(diào)。田芳等[14]研究表明，TNF-α與MP的發(fā)病有關(guān)，低濃度TNF-α具有抗感染、預(yù)防腫瘤等作用，高濃度的TNF-α可引起炎癥反應(yīng)。李梅等[15]報道，MP感染患者的TNF-α水平較對照組明顯升高。本研究結(jié)果顯示，MP感染模型組大鼠血清和BALF中TNF-α水平較空白對照組均顯著升高，表明感染MP可引起TNF-α的變化，高濃度TNF-α引起局部炎癥反應(yīng)，可促進(jìn)多種因子作用引起支氣管和肺組織炎癥反應(yīng)。解毒清肺合劑治療后，MP感染大鼠TNF-α水平顯著降低，與空白對照組無差異，表明解毒清肺合劑可以抑制TNF-α的表達(dá)，進(jìn)而減弱炎癥反應(yīng)。HE染色顯示模型組大鼠比對照組淋巴細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，解毒清肺組治療后淋巴細(xì)胞浸潤減少，表明解毒清肺合劑能顯著減輕肺組織炎癥。

p38是絲裂原激活蛋白激酶家族成員，主要參與細(xì)胞凋亡與分化，細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激等過程[16]。p38是MAPK信號通路的關(guān)鍵因子，p38 MAPK被激活后影響轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而調(diào)控炎癥反應(yīng)[17]。研究報道p38 MAPK信號通路可以促進(jìn)I-κBα的磷酸化和降解，進(jìn)而激活NF-κB通路。本研究結(jié)果顯示，MP感染后大鼠肺組織p38 MAPK蛋白表達(dá)升高，解毒清肺合劑灌胃治療p38 MAPK顯著降低，與空白對照組無顯著差異。NF-κB是調(diào)控免疫反應(yīng)與炎癥通路的重要核轉(zhuǎn)錄因子，機(jī)體正常狀態(tài)下，NF-κB在包漿中與I-κBα結(jié)合處于無活性狀態(tài)[18]。機(jī)體受到致病因素刺激時，I-κBα被磷酸化降解，進(jìn)而從NF-κB異源二聚體上脫離，暴露出p50蛋白的核定位信號，NF-κB被激活[19]?；罨腘F-κB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與目的基因κB序列結(jié)合，誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)，是MP引起的炎癥反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。機(jī)體受到刺激后炎癥因子TNF-α表達(dá)升高，引起白介素分泌的改變，進(jìn)而參與激活NF-κB信號通路。有研究報道，NF-κB 是 p38 MAPK的下游信號分子，其可以將信號從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)至胞核，調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)，是信號通路末端重要的轉(zhuǎn)錄因子。本研究結(jié)果顯示MP感染后，模型組NF-κB表達(dá)水平顯著升高，I-κBα水平顯著降低，表明感染MP可激活NF-κB通路，引起炎癥反應(yīng)。解毒清肺組NF-κB較模型組表達(dá)水平顯著降低，I-κBα水平顯著升高，2者與陽性對照組均無顯著差異，表明經(jīng)解毒清肺合劑治療后，解毒清肺組炎癥反應(yīng)減弱。

綜上所述，解毒清肺合劑能夠通過調(diào)控NF-κB和p38 MAPK顯著抑制肺炎支原體引起的肺炎。本研究尚存在不足之處，對其具體分子作用機(jī)制尚未研究清楚。