黃義新 劉煒

[摘要] 目的 研究米諾環(huán)素對氟尿嘧啶（5-Fu）誘導的腸黏膜炎的保護作用。 方法 40只雄性Balb/c小鼠，隨機分為5組，正常組、模型組、米諾環(huán)素低劑量組及高劑量組，每組10只。模型組由連續(xù)腹腔注射5-Fu（80 mg/kg）3 d誘導，治療組同時灌胃給予30 mg/kg或60 mg/kg的米諾環(huán)素。測定小鼠體質(zhì)量、腹瀉指數(shù)，同時對小鼠空腸進行HE染色，測定小腸黏膜中的促炎性細胞因子，并對小鼠腸內(nèi)容物中的短鏈脂肪酸進行測定，進而評價米諾環(huán)素對小鼠腸黏膜炎的保護作用。 結(jié)果 高劑量米諾環(huán)素可顯著增加腸黏膜炎模型小鼠的體重（P < 0.01），降低其腹瀉指數(shù)（P < 0.01），增加模型小鼠的空腸絨毛長度（P < 0.01）。此外高劑量米諾環(huán)素可顯著抑制腸黏膜中的IL-6（P < 0.05）和TNF-α（P < 0.01）的表達，同時增加小鼠腸內(nèi)容物中丁酸及乙酸的含量（P < 0.01）。 結(jié)論 米諾環(huán)素具有確切的腸黏膜保護作用，其作用與其抗炎及促進短鏈脂肪酸的生成有關。

[關鍵詞] 米諾環(huán)素；氟尿嘧啶；腸黏膜炎；短鏈脂肪酸

[中圖分類號] R730.53 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（a）-0020-05

Protective effects of Minocycline on 5-Fluorouracil-induced intestinal mucositis in mice

HUANG Yixin LIU Wei

Department of Pharmacy， Beijing Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100038， China

[Abstract] Objective Forty investigate the protective effect of Minocycline on 5-Fu induced intestinal mucostitis. Methods 40 male Balb/c mice were randomly divided into four groups （n = 10）， Control group， 5-Fu induced mucositis model， high dose or low dose of Minocycline treated group. After the mice were intraperitoneal administrated with 80 mg/kg 5-Fu for 3 days and simultaneously treated with 30 or 60 mg/kg orally in Balb/c mice， the body weight loss， diarrhea scores， and HE stain of the intestinal， pro-inflammatory cytokines in intestine tissue and short chain fatty acids in colon contents were also determined. Results Data from this study indicated that high dose minocycline could attenuate the 5-Fu induced body weight loss （P < 0.01）， and lower the diarrhea scores （P < 0.01）. Also minicycline in high dose increased the intestinal vill length （P < 0.01）， decreased the IL-6 （P < 0.05） and TNF-α （P < 0.01）. In the colon contents， Minocycline could significantly increase the SCFAs concentration， especially for aceticacid butyricacid （P < 0.01）. Conclusion All these results demonstrated that Minocycline exert protective effects on 5-Fu induced intestinal damage in mice， and these protective effects may partially oriented from its anti-inflammatory effects and enhancing short chain fatty acid production.

[Key words] Minocycline； 5-Fluorouracil； Intestinal mucositis； Short-chain fatty acid

米諾環(huán)素為常見的四環(huán)素類抗生素，其抗菌譜廣、抑菌活性強且持久[1]，目前臨床上多用于治療支原體感染、尿道感染、支氣管炎、毛囊炎等[2-3]。因米諾環(huán)素具有較好的脂溶性，口服生物利用度較高，可分布于全身各組織，尤其可透過血腦屏障等生理性屏障[4]。近年來，有研究表明米諾環(huán)素具有抗炎、抗凋亡等作用，可顯著抑制炎癥、應激、腦出血等誘導的神經(jīng)損傷[5]。

氟尿嘧啶（5-Fu）為臨床上常用的化療藥物[6]，可用于治療消化系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌等[7-8]，但其胃腸道不良反應明顯，可引起化療患者食欲減退、腹瀉、便血等，嚴重限制了其臨床應用[9]。研究表明這些不良反應可能與5-Fu誘導腸黏膜損傷，進而引起炎性反應有關[10-11]。此外，5-Fu還可引起腸道菌群失衡，導致腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的減少，而短鏈脂肪酸，如丁酸等具有支撐腸上皮細胞屏障的功能[10，12]。

尋找具有抗炎及保護腸黏膜功能的藥物，進而降低5-Fu的胃腸道不良反應，這對改善化療患者的生活質(zhì)量和化療效果具有重要意義[8]。本文擬研究米諾環(huán)素對5-Fu誘導的小鼠腸黏膜炎的保護作用，以期為相關藥物的開發(fā)及拓寬米諾環(huán)素的臨床應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑 5-Fu、米諾環(huán)素、四甲基戊酸購自美國Sigma公司；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸購自德國Ehrenstorfer公司；磷酸及乙酸乙酯（GC-MS級）均由德國Merk公司提供；小鼠TNF-α和IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（批號分別為B226815， B229138）由美國Biolegend公司提供。實驗用水為超純水，由Milli-Q Gradient A10制備。實驗中其他試劑均為分析純，購自南京化學試劑廠。

1.1.2 實驗動物 SPF級Balb/c小鼠由揚州大學比較醫(yī)學實驗中心提供，合格證號為SKXK（蘇）2012-0004，小鼠雌雄各半，8～10周齡，體重18～22 g。動物倫理由首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院倫理委員會批準，符合相關規(guī)定。動物飼養(yǎng)于溫度為24～26℃房間中，每天7：00～19：00給予光照，動物自由飲食飲水。小鼠每天早上抓握半分鐘適應1周后，進行后續(xù)的動物實驗。

1.1.3 實驗儀器 Thermo 2IR型高速低溫離心機，Olympus顯微鏡（含DP2-BSW計算機圖像分析系統(tǒng)），BS323S 電子天平（Sartorius公司，精確值0.0001 g），酶標儀（Biotek公司），GC6890N型氣相色譜儀，配有 FID 檢測器（美國Agilent公司），渦旋振蕩器（Scientific Industries Inc. USA）。

1.2 方法

1.2.1 藥物的配制 5-Fu用生理鹽水配置成8 mg/mL的溶液（必要時加熱至50℃溶解后，冷卻備用），米諾環(huán)素采用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液混懸為3 mg/mL和6 mg/kg的混懸液備用。

1.2.2 小鼠腸黏膜炎的誘導及給藥方案 40只SPF級Balb/c小鼠，采用完全隨機分組法將動物隨機分為正常組、模型組、米諾環(huán)素低劑量組合米諾環(huán)素高劑量組，每組動物各為10只，雌雄各半。正常組小鼠每天腹腔注射生理鹽水10 mL/kg，模型組前3 d每天腹腔注射配制好的5-Fu10 mL/kg（即給藥劑量為80 mg/kg），米諾環(huán)素給藥組在造模1 h后，灌胃給予相應劑量的米諾環(huán)素藥液進行藥物干預[9]。

于第7天，取各組小鼠的空腸，經(jīng)生理鹽水沖洗干凈腸內(nèi)容物后，取約1 cm的空腸置于10%的中性甲醛中，固定；其余的空腸，縱向剖開，平鋪于冰板上，采用載玻片刮下腸黏膜備用；同時收集小鼠盲腸內(nèi)容物，用于后續(xù)的短鏈脂肪酸的測定。

1.2.3 小鼠體重及腹瀉指數(shù) 每隔1 d（0、1、3、5、7 d）記錄1次體重；腹瀉情況通過對糞便進行評分[13]，具體如下：0分：糞便正?；蛭匆娂S便；1分：輕度腹瀉，糞便有輕微濕軟；2分：中度腹瀉，糞便不成形，且較為濕潤較濕，且伴有輕度的肛周糞便著色；3分：重度腹瀉，水樣便并伴有重度肛周著色。通過比較各組動物的腹瀉指數(shù)及體重情況進行藥效評價。

1.2.4 HE染色劑及腸上皮絨毛長度 經(jīng)中性甲醛固定的空腸，經(jīng)過常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，切片后進行常規(guī)的HE染色，并在顯微鏡下觀察小腸病理變化，同時進行評分。主要包括腸黏膜上皮細胞有無變性、壞死，絨毛間質(zhì)是否水腫；黏膜固有層的炎細胞浸潤情況；黏膜下層、肌層、漿膜層有無充血、水腫、炎細胞浸潤等損傷。根據(jù)上述病變的嚴重程度分別記分為0分（無明顯病變）、0.5分（輕微病變）、1分（輕度改變）、2分（中度病變）、3分（較為嚴重），通過累加所有分數(shù)，得出總的病變評分[10，13]。

小腸絨毛長度的測定采用在200倍光鏡下利用顯微鏡自帶的圖像分析系統(tǒng)（DP2-BSW）測量，隨機選擇3～5各視野，計算每個視野下所有腸絨毛長度的平均值，進一步計算所有視野中的腸絨毛長度均值，進行后續(xù)的統(tǒng)計分析。

1.2.5 小鼠腸黏膜中TNF-α和IL-6的測定 取小鼠空腸的腸黏膜約50 mg，加入9倍體積的冰磷酸緩沖液（PBS，pH=6.8），冰浴下勻漿，12 000 g離心5 min，取上清，按小鼠TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒操作步驟進行。同時上清液采用BCA法定蛋白，用于校正腸黏膜中的細胞因子濃度（pg/mg蛋白）。

1.2.6 腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸測定 精密稱取約0.1 g的腸內(nèi)容物，加入9倍體積的0.5%的磷酸水溶液，在4℃條件下劇烈渦旋2 min使腸內(nèi)容物充分分散，12 000 g離心5 min，取上清0.5 mL，加入10 μL內(nèi)標（200 μg/mL的四甲基戊酸）和0.5 mL乙酸乙酯，4℃渦旋2 min后，15 000 g離心10 min，取乙酸乙酯層，進行GC-FID分析。

GC-FID分析中，色譜柱為PEG-20型彈性石英毛細管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm；程序升溫：0～5 min，85～160℃（15℃/min）；5～15 min，150～230℃（8℃/min）；15～18 min，230℃，保持3 min；18～21 min，230～170℃（20℃/min）；檢測器溫度270℃；進樣口溫度220℃；分流進樣，進樣量1.0 μL；載氣為高純氮氣，流速2.1 mL/min。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 體重及腹瀉評分

與正常組小鼠比較，腹腔注射5-Fu后，模型組小鼠給藥后體重顯著降低（P < 0.05或P < 0.01）。而給予30 mg/kg或60 mg/kg的米諾環(huán)素后，小鼠體重與模型組相比，顯著增加，其中米諾環(huán)素高劑量組效果最佳。見表1。

從腹瀉指數(shù)上看，模型組小鼠在造模前2 d未見明顯的腹瀉癥狀，從3 d開始可見輕微的腹瀉，隨著時間的延長，模型組小鼠腹瀉指數(shù)顯著增加。而給予30、60 mg/kg米諾環(huán)素后，小鼠的腹瀉情況可見明顯改善，其中米諾環(huán)素低劑量組在第5天和第7天的腹瀉指數(shù)與模型組相比，顯著降低（P < 0.05），而米諾環(huán)素高劑量組在第3天開始，其腹瀉指數(shù)顯著降低（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

2.2 小腸病理及腸上皮絨毛長度統(tǒng)計結(jié)果

正常組小鼠空腸結(jié)構完整，可見清晰的黏膜層，黏膜下層、肌層和漿膜層絨毛細長且排列規(guī)則整齊。而模型組小鼠空腸結(jié)構可見上皮細胞出現(xiàn)輕度或者中度的變性，且有部分小鼠空腸出現(xiàn)水腫，從固有層看，有一定的充血，且出現(xiàn)炎癥細胞的浸潤[6]。而給予不同劑量的米諾環(huán)素后，上述病理改變可見明顯改善。見圖1。

從病理學評分上看，正常組小鼠未見明顯病理學改變，但5-Fu誘導的腸黏膜炎小鼠的空腸，其病變評分顯著增加。給予30 mg/kg和60 mg/kg的米諾環(huán)素后，其病變評分顯著降低（P < 0.05或P < 0.01），提示米諾環(huán)素具有一定的保護5-氟尿嘧啶誘導的腸黏膜損傷的作用。進一步測定其絨毛長度，模型組絨毛長度顯著降低（P < 0.01），而給予不同劑量的米諾環(huán)素后，可顯著改善由5-Fu誘導的絨毛損傷（P < 0.05或P < 0.01）。見表3。

2.3 TNF-α和IL-6測定結(jié)果

與正常組小鼠腸黏膜中的TNF-α表達情況相比，模型組小鼠血漿中的TNF-α表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。IL-6的含量在模型組小鼠腸黏膜中亦顯著增加（P < 0.01）。給予米諾環(huán)素后，低、高劑量的米諾環(huán)素均對5-Fu誘導的小鼠腸黏膜炎癥損傷有改善作用（P < 0.05或P < 0.01）。見表4。

2.4 盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸含量

與正常組小鼠腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸、及戊酸的濃度相比，5-Fu誘導的腸黏膜炎小鼠盲腸內(nèi)容物中上述四種短鏈脂肪酸含量顯著下降（P < 0.01）。而給予低劑量米諾環(huán)素后，小鼠盲腸中的乙酸含量與模型組相比，顯著增加（P < 0.05），其他短鏈脂肪酸均有所增加但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。給予高劑量米諾環(huán)素后，小鼠盲腸中的乙酸、丙酸、丁酸的含量則顯著提高，其中乙酸和丁酸含量顯著提高（P < 0.01）。見表5。

3 討論

本實驗通過對小鼠體重、腹瀉評分、空腸病變及絨毛長度、腸黏膜中促炎性細胞因子含量及盲腸內(nèi)容物中的短鏈脂肪酸，研究米諾環(huán)素對5-氟尿嘧啶誘導的腸黏膜炎小鼠保護作用。實驗結(jié)果表明米諾環(huán)素具有較好的保護作用。

研究表明化療藥物，如5-Fu可通過直接損傷腸上皮細胞，誘導腸上皮細胞凋亡，進而發(fā)生炎癥級聯(lián)反應，誘導腸黏膜損傷[8]，進而導致腹瀉、嘔吐、便血等系列胃腸道不良反應，嚴重限制了其臨床應用。本研究選擇米諾環(huán)素作為研究對象，基于其具有一定的抗菌作用、抑制神經(jīng)炎癥等文獻報道[2，4]，發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素可顯著改善5-Fu誘導的小鼠體重減輕及腹瀉癥狀。進一步從病理學及腸絨毛長度發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素可顯著改善5-Fu誘導的小腸病變和絨毛萎縮。

由于5-Fu誘導的腸黏膜損傷可能與炎性反應和菌群失調(diào)等有關[6，8，10]，本研究進一步的通過ELISA研究米諾環(huán)素對腸黏膜中的促炎性細胞因子TNF-α和IL-6表達的影響，結(jié)果提示米諾環(huán)素可顯著抑制上述促炎性細胞因子的表達，這與米諾環(huán)素抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞活化等結(jié)果類似，進一步佐證了米諾環(huán)素的抗炎作用。

此外，由于腸黏膜損傷可能還與腸道菌群紊亂及其繼發(fā)的短鏈脂肪酸（SCFAs）生成減少有關[14-16]，SCFAs為食物中膳食纖維經(jīng)腸道菌群發(fā)酵后的降解產(chǎn)物，可為腸上皮細胞提供能量[17]，進而維護腸道上皮細胞的屏障功能，保護小腸杯狀細胞的分泌功能完好[18]，同時還可以促進腸黏膜細胞的增殖[19]。本研究通過檢測盲腸內(nèi)容物中的SCFAs的濃度，研究結(jié)果提示，米諾環(huán)素可顯著提供小鼠結(jié)腸中的丁酸的含量，而丁酸具有確切的促進腸上皮細胞增殖，保護腸上皮細胞損傷的功效[20]，這從另外一個方面確證了米諾環(huán)素對5-Fu誘導的腸黏膜炎的保護作用。

本研究對拓寬米諾環(huán)素的臨床應用，尋找較好的改善5-Fu化療的輔助用藥具有重要意義，后續(xù)應對米諾環(huán)素的保護作用機制進行深入研究。

[參考文獻]

[1] Kengkla K，Kongpakwattana K，Saokaew S，et al. Comparative efficacy and safety of treatment options for MDR and XDR Acinetobacter baumannii infections：a systematic review and network meta-analysis [J]. J Antimicrob Chemother，2018，73（1）：22-32.

[2] Garrido-Mesa N，Zarzuelo A，Gálvez J. Minocycline： far beyond an antibiotic [J]. Br J Pharmacol，2013，169（2）：337-352.

[3] Livermore DM，Mushtaq S，Warner M，et al. In Vitro Activity of Eravacycline against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae and Acinetobacter baumannii [J]. Antimicrob Agents Chemother，2016，60（6）：3840-3844.

[4] Bahrami Z，F(xiàn)irouzi M，Hashemi-Monfared A，et al. The effect of minocycline on indolamine 2，3 dioxygenase expression and the levels of kynurenic acid and quinolinic acid in LPS-activated primary rat microglia [J]. Cytokine，2018，107：125-129.

[5] Bonjoch L，Gea-Sorlí S，Jordan J，et al. Minocycline inhibits peritoneal macrophages but activates alveolar mac-rophages in acute pancreatitis [J]. J Physiol Biochem，2015，71（4）：839-846.

[6] Aketa H，Tatsumi T，Kohga K，et al. The combination therapy of α-galactosylceramide and 5-fluorouracil showed antitumor effect synergistically against liver tumor in mice [J]. Int J Cancer，2013，133（5）：1126-1134.

[7] Cheng M，Liu Z，Wan T，et al. Preliminary pharmacology of galactosylated chitosan/5-fluorouracil nanoparticles and its inhibition of hepatocellular carcinoma in mice [J]. Cancer Biol Ther，2012，13（14）：1407-1416.

[8] Tang M，Lu X，Zhang C，et al. Downregulation of SIRT7 by 5-fluorouracil induces radiosensitivity in human colorectal cancer [J]. Theranostics，2017，7（5）：1346-1359.

[9] Spencer NJ. Motility patterns in mouse colon：gastrointestinal dysfunction induced by anticancer chemotherapy [J]. Neurogastroenterol Motil，2016，28（12）：1759-1764.

[10] Chang CT，Ho TY，Lin H，et al. 5-Fluorouracil induced intestinal mucositis via nuclear factor-kappa B activation by transcriptomic analysis and in vivo bioluminescence imaging [J]. PLoS One，2012，7（3）：e31808.

[11] Zhang S，Liu Y，Xiang D，et al. Assessment of dose-response relationship of 5-fluorouracil to murine intestinal injury [J]. Biomed Pharmacother，2018，106：910-916.

[12] Ohkusa T，Yoshida T，Sato N，et al. Commensal bacteria can enter colonic epithelial cells and induce proinflammatory cytokine secretion：a possible pathogenic mechanism of ulcerative colitis [J]. J Med Microbiol，2009，58：535-545.

[13] Shimamura Y，Takeuchi I，Terada H，et al. A mouse model for oral mucositis induced by cancer chemotherapy [J]. Anticancer Res，2018，38（1）：307-312.

[14] Pinto A，F(xiàn)idalgo P，Cravo M，et al. Short chain fatty acids are effective in short-term treatment of chronic radiation proctitis： randomized，double-blind，controlled trial [J]. Dis Colon Rectum，1999，42（6）：788-795，795-796.

[15] Ooi C，Good N，Williams D，et al. Efficacy of butyrate analogues in HT-29 cancer cells [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol，2010，37（4）：482-489.

[16] 傅紅，師英強，莫善兢.短鏈脂肪酸對人結(jié)腸癌Caco-2細胞增殖分化的影響與臨床意義[J].中華消化雜志，2003，23（8）：473-475.

[17] Saif MW，Diasio RB. Benefit of uridine triacetate （Vistogard） in rescuing severe 5-fluorouracil toxicity in patients with dihydropyrimidine dehydrogenase （DPYD） deficiency [J]. Cancer Chemother Pharmacol，2016，78（1）：151-156.

[18] Yuan L，Zhang S，Li H，et al. The influence of gut microbiota dysbiosis to the efficacy of 5-Fluorouracil treatment on colorectal cancer [J]. Biomed Pharmacother，2018，108：184-193.

[19] Le Bastard Q，Ward T，Sidiropoulos D，et al. Fecal microbiota transplantation reverses antibiotic and chemotherapy-induced gut dysbiosis in mice [J]. Sci Rep，2018，8（1）：6219.

[20] Hamouda N，Sano T，Oikawa Y，et al. Apoptosis，dysbiosis and expression of inflammatory cytokines are sequential events in the development of 5-fluorouracil-induced intestinal mucositis in mice[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol，2017，121（3）：159-168.

（收稿日期：2018-08-31 本文編輯：蘇 暢）