朱一超 馬曉雯 何磊

[摘要] 目的 鑒定前期獲得的一個(gè)食管腺癌特異性靶向小肽的靶分子。 方法 小肽Pull Down和質(zhì)譜篩選該小肽的可能靶分子；計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接、Western blot、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、siRNA干擾、基因轉(zhuǎn)染等方法確認(rèn)靶分子的正確性。 結(jié)果 上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）是該小肽的特異性結(jié)合靶分子，且該小肽可特異性結(jié)合EpCAM高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞和組織。 結(jié)論 除了食管腺癌，該小肽在EpCAM高表達(dá)的結(jié)腸癌中也具有早期診斷和靶向治療的潛在應(yīng)用價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] EpCAM；多肽；分子成像；腫瘤靶向治療

[中圖分類號(hào)] R735 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）04（a）-0004-04

Identification of a small peptide targeting epithelial adhesion molecule EpCAM

ZHU Yichao1 MA Xiaowen2，3 HE Lei2 ZHOU Jiming2，4 PANG Zhijun2 ZHANG Xinlei2 MAO Zhuang1 LI Meng2

1.The Brigade of Undergraduates， the Fourth Military Medical University， Shaanxi Province， Xi′an 710032， China； 2.School of Pharmacy， the Fourth Military Medical University， Shaanxi Province， Xi′an 710032， China； 3.Department of Pharmacology， General Hospital of Ji′nan Military Region， Shandong Province， Ji′nan 250000， China； 4.Department of Cardiology， the 153rd Central Hospital of People′s Liberation Army， He′nan Province， Zhengzhou 450000， China

[Abstract] Objective To find the molecular target of an esophagus adenocarcinoma specific binding peptide （SNF*）. Methods Pull Down and Mass Spectrum were used to identify the potential target； molecular docking， Western blot， laser scanning confocal microscopy， flow cytomertry， RNA interference and gene transfection were used to verify the target of SNF*. Results Epithelial adhesion molecule （EpCAM） was the potential target of SNF*. SNF* specifically bound with EpCAM which overexpressed in colon cancer cells and tissues. Conclusion Except esophagus adenocarcinoma， SNF* can be used in the early diagnosis and targeted therapy in colorectal cancer with high EpCAM expression.

[Key words] EpCAM； Peptide； Molecular imaging； Tumor targeted therapy

利用腫瘤與正常組織的分子表型差異，篩選特異腫瘤組織探針在腫瘤早期診斷和靶向治療中具有重要作用[1-2]。特異性腫瘤組織探針的類型很多，包括抗體、多肽、模擬肽、核酸等[3]?？贵w在腫瘤早期診斷和靶向治療中的作用不言而喻，它們可以偶聯(lián)放射性核素進(jìn)行腫瘤早期成像，偶聯(lián)抗腫瘤藥物實(shí)現(xiàn)靶向治療。然而，抗體的應(yīng)用存在很多局限性。比如，抗體重鏈容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕獲，造成肝、脾和骨髓毒性[4-5]；抗體分子大，很難進(jìn)入實(shí)體瘤內(nèi)部等等。相對(duì)于抗體的這些缺陷，靶向性小肽具有分子小、免疫原性低、血漿清除快、腫瘤滲透性高等優(yōu)點(diǎn)[6]，且小肽生產(chǎn)成本低，更易大規(guī)模生產(chǎn)。前期，我們通過(guò)噬菌體肽庫(kù)篩選獲得了一條能夠特異性結(jié)合食管腺癌的七肽（SNFYMPL，SNF*）。該七肽可特異結(jié)合早期食管腺癌組織，在食管腺癌早期內(nèi)鏡診斷和靶向治療中具有潛在用途[7]。然而我們尚不清楚該小肽具體與腫瘤細(xì)胞表面什么靶分子結(jié)合。本研究中，我們希望鑒定并確認(rèn)該小肽的靶分子，為該小肽的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，并根據(jù)靶分子的表達(dá)研究，擴(kuò)展該小肽的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和組織來(lái)源

食管腺癌細(xì)胞OE33，結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、SW480、SW620，結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460均培養(yǎng)于RPMI1640。巴雷特食管上皮細(xì)胞Q-hTERT培養(yǎng)于角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（Life Technologies）。結(jié)腸癌以及癌旁組織取自空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院，患者知情同意。本研究方案通過(guò)空軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 多肽Pull Down

SNF*偶聯(lián)于EAH Sepharose 4B（GE Healthcare）。對(duì)照多肽GGGSK以同樣方式偶聯(lián)，制備SNF*-EAH和GGG*-EAH凝膠柱。OE33和Q-hTERT細(xì)胞裂解（pH 7.5，1% Triton X-100）后上柱（1 mg/mL），4℃過(guò)夜，1 mol/L NaCl洗脫，SDS-PAGE電泳分離，硝酸銀染色。部分洗脫液電泳后，進(jìn)行Western blot鑒定。

1.3 計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接

RCSB PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)獲得EpCAM晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：4MZV）。Discovery Studio 3.5軟件進(jìn)行SNF*與EpCAM的模擬對(duì)接。

1.4 siRNA干擾和EpCAM基因轉(zhuǎn)染

EpCAM干擾序列如下，siRNA1：5′-GCCGUAA-ACUGCUUUGUGATT-3′，5′-UCACAAAGCAGUUUA-CGGCTT-3′；siRNA2：5′-GACAAGGACACUGAAAU-AATT-3′，5′-UUAUUUCAGUGUCCUUGUCTT-3′；對(duì)照序列為：5′-CUAGCUAGGTTUCCAUTCCTT-3′，5′-AUCGCCUTTCGGUAUAUTCTT-3′。轉(zhuǎn)染試劑為L(zhǎng)ipofectamine 3000（Thermo Fisher）。EpCAM的DNA編碼區(qū)由上海吉瑪公司合成，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒為pcDNA3.1。突變型EpCAM序列是將預(yù)測(cè)的SNF*結(jié)合位點(diǎn)刪除的序列，轉(zhuǎn)染步驟同上。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR

TRIzol試劑提取總mRNA，采用iTaq Universal SYBR Green Supermix法在qRT-PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。EpCAM引物如下：5′-ATAACCTGCTCTGAGCGAGTG-3′；5′-TGCAGTCCGCAAACTTTTACTA-3′，β-actin為內(nèi)參。

1.6 激光共聚焦顯微鏡

細(xì)胞培養(yǎng)于4孔細(xì)胞培養(yǎng)載玻片，待生長(zhǎng)至80%滿時(shí)，血清封閉，PBS清洗，SNF*-FITC多肽（0.5 mmol/L）孵育1 min。洗滌后多聚甲醛固定，DAPI染色，激光共聚焦顯微鏡（Fv1000，OLYMPUS）觀察。Cy3-EpCAM抗體染色時(shí)，細(xì)胞先進(jìn)行固定和封閉，4℃孵育過(guò)夜。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)

細(xì)胞胰酶消化分離，20%山羊血清封閉，0.1 mmol/L SNF*-FITC 4℃孵育40 min，甲醛固定，PBS洗滌，流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，Beckton Dickinson）分析，F(xiàn)lowjo軟件作圖。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNF*靶分子的鑒定與驗(yàn)證

銀染結(jié)果顯示OE33與SNF*-EAH孵育后的洗脫液中有一新生條帶（圖1A，方框處）。質(zhì)譜給出12個(gè)可能的候選蛋白。Western blot顯示12個(gè)分子中只有EpCAM抗體能夠識(shí)別該新生條帶（圖1B）。分子對(duì)接顯示SNF*與EpCAM結(jié)合如下：絲氨酸與EpCAM的173位Arg形成兩個(gè)氫鍵，結(jié)合半徑0.27、0.31 nm；絲氨酸與174位Tyr形成氫鍵，結(jié)合半徑0.24 nm；天冬氨酸與233位Leu形成氫鍵，結(jié)合半徑0.22 nm；甲硫氨酸與241位Asp形成氫鍵，結(jié)合半徑0.2 nm（圖1C、D）。

2.2 EpCAM敲減明顯降低SNF*與OE33的結(jié)合

EpCAM的siRNA明顯降低EpCAM在OE33的表達(dá)（P < 0.01）（圖2A，封三）。激光共聚焦顯示：EpCAM敲減后，SNF*-FITC、Cy3-EpCAM抗體與細(xì)胞的結(jié)合明顯減弱（P < 0.01）（圖2B～E，封三）。流式細(xì)胞術(shù)顯示類似結(jié)果（圖2F～G，封三）。

2.3 SNF*與EpCAM過(guò)表達(dá)的Q-hTERT細(xì)胞的結(jié)合

EpCAM被過(guò)表達(dá)于Q-hTERT細(xì)胞（P < 0.01）。另外，173位Arg、174位Tyr、233位Leu敲除的EpCAM（mEpCAM）也被過(guò)表達(dá)于Q-hTERT（P < 0.01）（圖3A，封三）。激光共聚焦顯示：SNF*可以識(shí)別EpCAM轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，而不識(shí)別mEpCAM轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（P < 0.01）（圖3B～C，封三）。EpCAM單抗（識(shí)別位點(diǎn)為第250～314位氨基酸）可明顯結(jié)合兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞（圖3D～E，封三）（P < 0.01）。流式細(xì)胞術(shù)顯示類似結(jié)果（圖3F～G，封三）。

2.4 SNF*-FITC與EpCAM高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞和組織特異性結(jié)合

Western blot和qRT-PCR顯示與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460比較，HT29、SW480和SW620高表達(dá)EpCAM（P < 0.01）（圖4A，封三）。激光共聚焦顯示：SNF*-FITC特異性結(jié)合HT29、SW480和SW620；EpCAM敲除明顯降低SNF*-FITC和Cy3-EpCAM抗體對(duì)細(xì)胞的結(jié)合（P < 0.01）（圖4B～C，封三）。通過(guò)免疫組化分析，我們獲得19例EpCAM高表達(dá)的結(jié)腸癌組織和10例EpCAM低表達(dá)的癌旁組織。激光共聚焦顯示相對(duì)于癌旁組織，SNF*-FITC和Cy3-EpCAM抗體與腫瘤的結(jié)合明顯較高（P < 0.01）（圖5，封三）。

3 討論

EpCAM是單次跨膜糖蛋白[8]，主要參與鈣黏蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞黏附[9]，并能通過(guò)上調(diào)c-myc、cyclin A、cyclin E等分子促進(jìn)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖[10-11]。EpCAM高表達(dá)于包括結(jié)直腸癌、食管癌、胰腺癌在內(nèi)的多種上皮腫瘤[12-13]。歐盟在2013年批準(zhǔn)了EpCAM抗體（Catumaxomab）治療結(jié)腸癌引發(fā)的惡性腹水[14-15]。前期，我們證明SNF*特異性結(jié)合食管腺癌組織，能夠在早期食管腺癌的內(nèi)鏡診斷中發(fā)揮重要作用[7]。本研究中，我們證明了SNF*的靶分子是EpCAM，又證明了SNF*可以與EpCAM高表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞和組織特異結(jié)合，這大大拓展了SNF*在腫瘤早期診斷中的應(yīng)用范圍。未來(lái)，我們將進(jìn)行SNF*在早期結(jié)直腸癌、胰腺癌的分子診斷及腫瘤藥物靶向遞送方面的研究。另外，小肽最大的問(wèn)題是體內(nèi)半衰期太短，過(guò)短的半衰期會(huì)導(dǎo)致它們?cè)隗w應(yīng)用時(shí)靶組織的聚集性降低[16-18]。未來(lái)，我們還要通過(guò)氨基端和羧基端的保護(hù)、D型氨基酸替代、PEG大分子保護(hù)等方法對(duì)該小肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化[19-20]，以便于其更好地應(yīng)用于腫瘤早期診斷和靶向治療。

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（收稿日期：2018-08-27 本文編輯：張瑜杰）