大蒜素對大鼠心力衰竭模型心室肌細胞遲后除極和觸發(fā)活動的作用

汪晶晶，王蔚然，董穎，李彬，李潔，白婧，劉傳斌，林琨，陳韻岱，李泱

(解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心心血管內(nèi)科，北京 100853)

心源性猝死(sudden cardiac death,SCD)最常見原因是惡性室性心律失常，其與慢性心力衰竭有非常緊密的關(guān)系。Framingham研究顯示，心力衰竭患者猝死率是普通人群的6～9倍[1]。心力衰竭時心肌發(fā)生顯著的電重構(gòu)，在長期病理學(xué)因素作用下，心肌電活動出現(xiàn)多種形式的適應(yīng)性改變，這在一定程度上能代償和緩解心功能損害，但同時也成為致心律失常的因素[2]。已有研究證實，心力衰竭后遲后除極(delayed afterdepolarization,DAD)及其引起的觸發(fā)活動(triggered activity,TA)在SCD發(fā)生中起著重要的作用[3]。大蒜素(allicin,All)是一種從大蒜鱗莖中分離提取的有效成分，是具有多種生物學(xué)活性的化合物。研究發(fā)現(xiàn)，All對多種離子流均有作用，可發(fā)揮抗心律失常的效應(yīng)。我們的前期研究顯示，All可減少原發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細胞和心力衰竭后心室肌細胞上的L型鈣通道電流(L-type calcium current,ICa,L)[4-7]。但尚不可知其是否對心力衰竭后細胞內(nèi)鈣離子及DAD有作用，并進而引起TA。本文選擇心力衰竭大鼠的心室肌細胞，用全細胞膜片鉗技術(shù)觀察All對大鼠心室肌細胞DAD和TA發(fā)生的影響，進一步探討其可能的離子流機制，旨在尋找新的治療心力衰竭后抗惡性心律失常的藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半。膠原酶Ⅱ、胰蛋白酶、FBS胎牛血清、HEPES緩沖液、L-谷氨酸、4-氨基吡啶 (4-aminopyridine,4AP)、河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)和CsCl購自美國Sigma公司；依他酸(Egtazic acid,EGTA)購自美國Fluka Biochemika公司。All購自索萊寶試劑公司。細胞分離液(mmol/L)：CaCl21.5，KCl 5，NaCl 110.0，MgCl21.2，HEPES緩沖液10，葡萄糖10，pH值用NaOH調(diào)至7.4；無鈣分離液為分離液中不加CaCl2但增加EGTA 10 mmol/L。細胞外液：同細胞分離液，為排除干擾電流，加入5 mmol/L的4AP阻斷瞬時外向鉀電流(transient outward potassium current,Ito)，加入100 μmol/L的TTX阻斷鈉通道電流(INa)。細胞內(nèi)液(mmol/L)：氯化四乙基銨(tetraethylammonium chloride,TEA-Cl)20、CsCl 100、EGTA 10、Na2ATP 5、HEPES緩沖液10，pH調(diào)至7.2。KB液(mmol/L)：L-谷氨酸50，KCl 30，KOH 80，KH2PO430，?；撬?20，HEPES 10，葡萄糖10，MgSO43，EGTA 0.5，KOH調(diào)pH值至7.4。

1.2 方法

1.2.1 心力衰竭模型制作 參考文獻[8]采用腹主動脈結(jié)扎法選取SD大鼠20只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半。10%水合氯醛腹腔麻醉，于劍突下腹正中切口，分層打開腹腔，在腎動脈分支上方0.5 cm處鈍性游離腹主動脈，將8號注射器針頭磨鈍平行置于腹主動脈上，用4號手術(shù)絲線將腹主動脈和注射器針頭一同結(jié)扎，然后緩慢將注射器針頭撤出，關(guān)腹，分層縫合(模型組)。另外取10只SD大鼠，除不結(jié)扎之外，其他步驟與模型組相同(假手術(shù)組)。2組大鼠于術(shù)后予青霉素4萬U每只，腹腔注射6 d，預(yù)防感染。飼養(yǎng)至8周。

1.2.2 大鼠心室肌細胞的分離 采用改進的酶解法制備大鼠心室肌單細胞。每組大鼠首先肝素化(腹腔注射100 IU/ml)，用20%烏拉坦(1.00 mg/kg)麻醉，后迅速取其心臟，在37℃和通氧條件下行Langendorff灌流：用無Ca2+Tyrode′s液灌流3～5 min，用含膠原酶Ⅱ 70 mg、胰蛋白酶12 mg的無Ca2+Tyrode′s液(50 ml)灌流20～25 min。沿房室間溝取心室肌，剪碎入KB液中并吹打使細胞脫落，-4℃保存，1 h后進行實驗。

1.2.3 細胞分組 37℃環(huán)境下，取模型組細胞保存液加于1 ml灌流槽中，待細胞貼壁后，給予200.0 μmol/L終濃度的All，于倒置顯微鏡下選擇邊緣整齊、表面無顆粒、橫紋清晰、無收縮的心室肌細胞進行檢測(給藥組)。其給藥方式為：將All用二甲基亞砜溶解，并制備成儲備液，細胞外液稀釋成200.0 μmol/L終濃度；采用局部灌流裝置于細胞外恒流灌流方式對給藥組進行給藥，為確保藥物效應(yīng)的一致性，待平衡5 min后方可記錄電流[7]。同樣取模型組細胞(不給藥，心力衰竭組)或假手術(shù)組細胞(對照組)加于灌流槽中，除不加藥外，其余步驟均與給藥組一致。根據(jù)檢測指標(biāo)不同，分別選取不同個數(shù)細胞進行觀察。

1.2.4 全細胞膜片鉗記錄 數(shù)據(jù)記錄采用軟件(pCLAMP 10.2)。采用全細胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗制下記錄電流。將Axon-700B膜片鉗放大器(Sunnyvale,美國)同計算機連接，刺激信號及電壓輸入信號應(yīng)用Digidata 1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Sunnyvale,美國)收集。GG-17玻璃毛坯經(jīng)pp-83微電極拉制儀(Narishige公司，日本)拉制成電阻為2.0～5.5 MΩ的電極。調(diào)節(jié)三維操縱器進行封接，使封接電阻達1 GΩ以上，吸破細胞膜形成全細胞記錄模式。測定電容時，施以0.4 V/s的斜坡刺激，按方程Cm=I/(dV/dt)計算(Cm為膜電容，I為電流值，dV/dt即電壓斜率)。為消除細胞間的誤差，I值以電流密度(pA/pF)表示。信號經(jīng)截止頻率為1 kHz的四階貝塞爾低通濾波器濾波，采樣率為5 kHz。串聯(lián)電阻補償90%～95%以消除電壓偏差，液接電位補償校正至<2 mV，慢電容補償約為85%～90%，以消除膜電容的充放電影響。

1.2.5 指標(biāo)檢測及參數(shù)設(shè)置 (1)DAD和TA。電流鉗模式下，鉗制電位0 mV，1 500 pA持續(xù)10 ms的20個串刺激，頻率4.0 Hz，記錄動作電位。DAD被定義為在4期緊接著正常動作電位后出現(xiàn)的去極化幅值>5 mV、持續(xù)時間>10 ms的自動去極化波形；TA被定義為在DAD的基礎(chǔ)上出現(xiàn)的一個自發(fā)性動作電位，其特征是0相有明顯自發(fā)性除極[9]。(2)ICa,L電流及門控機制。穩(wěn)態(tài)激活曲線：保持電位-40 mV，施予150 ms，階躍10 mV，-40 mV～+40 mV的系列去極化脈沖，記錄ICa,L和ICa,L,max。標(biāo)準(zhǔn)化各電流幅值，以相對電流對各膜電位作圖得穩(wěn)態(tài)激活曲線(電流-電壓圖)。穩(wěn)態(tài)失活曲線：保持電位-40 mV，施予500 ms，階躍10 mV，-70 mV～+40 mV的系列去極化脈沖，在每一條件脈沖后緊跟一固定去極化至0 mV，150 ms的測試脈沖，記錄ICa,L和ICa,L,max，用Boltzmann方程ICa/ICa,max=1/{1+exp[(Vm-V1/2)/k]}擬合求半數(shù)失活電壓V1/2inact。(3)瞬時內(nèi)向電流(transient inward current,Iti)。在電壓鉗方式下，給予20個方波預(yù)刺激，-80 mV～+50 mV，150 ms，每組刺激間隔100 ms，之后給予2 000 ms、-100 mV～+200 mV的測試刺激，引出Iti。Iti被定義為：波峰與電流基線之間的差值，按第一個出現(xiàn)的波形進行分析。(4)Na+/Ca+交換電流(Na+/Ca+exchange current,INCX)。在電壓鉗方式下，采用斜坡刺激的模式引出INCX電流。鉗制電位為-60 mV，去極化至+80 mV，持續(xù)400 ms，以90 V/s的速率復(fù)極并超極化至-120 mV，此后恢復(fù)到-60 mV。(5)鈣瞬變。取急性分離好的心室肌細胞500 μl于新的試管中，應(yīng)用BSA混懸液稀釋至1 ml，加入Fluo 4-AM鈣熒光染料(1∶500稀釋)，水平搖床上反應(yīng)20 min。試管中加入臺式液至8 ml，離心機10 000轉(zhuǎn)/min離心20～200 s，傾去上清液，應(yīng)用BSA混懸液重懸細胞。取100 μl染色的心室肌細胞懸液加入備好的共聚焦小皿中，靜置1 h，待細胞貼壁穩(wěn)定后，將共聚焦小皿放置共聚焦顯微鏡上，刺激電極放置共聚焦小皿中，沒入臺式液，給予不同頻率刺激，觀察鈣瞬變和鈣離子濃度等指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠心室肌細胞DAD和TA發(fā)生率比較

每組選取15個細胞進行檢測。對照組、心力衰竭組及給藥組細胞上DAD和TA發(fā)生率依次為[13.3%(2/15),0.0%(0/15)]、[60.0%(9/15)，26.7%(4/15)]和[40.0%(6/15)，13.3%(2/15)]。與對照組比較，心力衰竭組細胞DAD和TA發(fā)生率顯著增加；與心力衰竭組比較，給藥組細胞上DAD和TA發(fā)生率顯著下降，下降幅度分別為20.0%和13.4%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01；圖1)。說明All對心力衰竭大鼠心室肌細胞的DAD和TA均有一定抑制效應(yīng)。

2.2 3組大鼠心室肌細胞ICa,L變化比較

每組選取15個細胞進行觀察。與對照組比較，心力衰竭組細胞膜上的ICa,L密度顯著增大；與心力衰竭組比較，給藥組ICa,L密度顯著減小，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01；圖2A，B)。在刺激電位為0 mV時，與對照組(-11.5±0.4)pA/pF比較,心力衰竭組細胞ICa,L的電流密度增加至(-17.2±0.9)pA/pF；與心力衰竭組比較，給藥組細胞電流密度則降低為(-13.5±1.0)pA/pF，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01；圖2C)。但3組穩(wěn)態(tài)激活曲線比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組[(-26.5±3.9)mV]比較，心力衰竭組細胞鈣電流的V1/2,inact移向更正的電位為(-7.2±1.9)mV(P<0.01)；與心力衰竭組比較，給藥組細胞鈣電流的V1/2,inact恢復(fù)至(-18.5±2.5)mV(P<0.01)。且3組穩(wěn)態(tài)失活曲線比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01；圖2D)。以上結(jié)果提示心力衰竭時鈣電流增加，主要可能通過穩(wěn)態(tài)失活曲線向去極化電位移動，導(dǎo)致相同電位刺激時通道失活速率減慢，而應(yīng)用All可以抑制此現(xiàn)象。

圖1 3組大鼠心室肌細胞DAD和TA發(fā)生率比較Figure 1 Effects of allicin on DAD and TA in ventricular myocytes of heart failure ratsA:the original recording diagram of DAD and TA in ventricular myocytes;B:histogram of DAD incidence;C:histogram of TA incidence. Ctrl:control group;HF:heart failure group;All:allicin;DAD:delayed afterdepolarization;TA:triggered activity. Compared with control group,**P<0.01;compared with heart failure group,##P<0.01.

圖2 3組大鼠心室肌細胞ICa,L變化比較Figure 2 Comparison of ICa,L in ventricular myocytes among three groupsA:original recording diagram of peak calcium current in ventricular myocytes;B:changes in peak ICa,L density;C:current-voltage curve of ICa,L; D:homeostasis inactivation curve of ICa,L.Ctrl:control group;HF:heart failure group;All:allicin.Compared with control group,**P<0.01; compared with heart failure group,##P<0.01.

2.3 3組大鼠心室肌細胞Iti變化比較

每組選取10個細胞進行觀察。與對照組比較，心力衰竭組細胞Iti電流密度顯著增加；與心力衰竭組比較，給藥組細胞Iti電流密度又顯著下降(P<0.01；圖3A，B)。電流-電壓圖(圖3C)顯示，在-50 mV去極化時，對照組的內(nèi)向峰電流密度為(-0.23±0.01)pA/pF，而心力衰竭組細胞顯著增加至(-1.05±0.06)pA/pF；與心力衰竭組比較，給藥組則又顯著降低為(-0.53±0.05)pA/pF，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Iti電流在-50 mV去極化時最大，在更負(fù)或更正的刺激電位時，電流幅值均減少。其中心力衰竭組電流密度在-90 mV～+10 mV刺激下增加最為明顯，而在+20 mV以上電位刺激時，Iti呈現(xiàn)出外向電流特征。

2.4 3組大鼠心室肌細胞INCX變化比較

每組選取10個細胞進行觀察。INCX分為內(nèi)向(順向)和外向(逆向)電流。其中內(nèi)向電流為3個鈉離子內(nèi)流及一個鈣離子外排所致，外向電流反之。與對照組比較，心力衰竭組內(nèi)向電流密度從(-3.2±0.1)pA/pF顯著增加至(-5.8±0.7)pA/pF(P<0.01)；而與心力衰竭組比較，給藥組電流密度則顯著恢復(fù)至(-4.2±0.4)pA/pF(P<0.01；圖4)。外相電流變化不大。

2.5 3組大鼠心室肌細胞內(nèi)鈣瞬變和鈣離子濃度比較

每組選取15個細胞進行觀察。與對照組比較，心力衰竭組細胞靜息態(tài)鈣濃度、鈣瞬變幅度和胞內(nèi)鈣峰值50%的時間等參數(shù)顯著升高(P<0.01)；與心力衰竭組比較，上述參數(shù)在給藥組細胞中均顯著降低(P<0.01；圖5A，B，圖6A，B，C)。心力衰竭后大鼠心室肌細胞內(nèi)鈣瞬變衰減率與對照組比較顯著下降，而應(yīng)用All后，得到顯著恢復(fù)(P<0.05；圖6D)。

圖3 3組大鼠心室肌細胞Iti變化比較Figure 3 Comparison of Iti in ventricular myocytes among three groupsA:original recording diagram of Iti in ventricular myocytes;B:changes in peak Iti density;C:current-voltage curve of Iti.Ctrl:control group;HF:heart failure group;All:allicin.Compared with control group,**P<0.01;compared with heart failure group,##P<0.01.

圖4 3組大鼠心室肌細胞INCX變化比較Figure 4 Comparison of INCX in ventricular myocytes among three groupsA:original recording of INCX in ventricular myocytes;B:changes in peak INCX density.Ctrl:control group;HF:heart failure group;All:allicin. Compared with control group,**P<0.01;compared with heart failure group,##P<0.01.

圖5 3組大鼠心室肌細胞內(nèi)鈣濃度的比較Figure 5 Comparison of calcium concentration in ventricular myocytes among three groupsA:fluorescence image of the calcium ions in ventricular myocytes;B:intracellular calcium ion concentration in resting state.Ctrl:control group; HF:heart failure group;All:allicin.Compared with control group,**P<0.01;compared with heart failure group,##P<0.01.

圖6 3組大鼠心室肌細胞內(nèi)鈣瞬變的比較Figure 6 Comparison of intracellular calcium transients in ventricular myocytes among 3 groupsA:intracellular calcium waves change of ventricular myocytes in 3 groups;B:cell calcium transient amplitude changes;C:transient time of 50% peak calcium;D:changes in the transient decay rate of calcium.Ctrl:control group;HF:heart failure group;All:allicin.Compared with control group,**P<0.01;compared with heart failure group,#P<0.05,##P<0.01.

3 討 論

心力衰竭致心律失常作用是電重構(gòu)的不良后果，心力衰竭除心功能不全引起的血流動力學(xué)障礙外，還因心臟電重構(gòu)引發(fā)惡性心律失常導(dǎo)致猝死。而心力衰竭后觸發(fā)性心律失常則是猝死的主要原因[10,11]。本研究顯示，All可以降低心力衰竭時心室細胞DAD和由此引起的觸發(fā)性心律失常的發(fā)生，使其分別降低20.0%和13.4%，這可能為心力衰竭后心律失常的防治提供新的潛在藥物。

竇房結(jié)的沖動產(chǎn)生動作電位使整個心臟出現(xiàn)節(jié)律性搏動。每一動作電位末期常伴有一個緩慢的除極波。正常情況下，該波隨動作電位的恢復(fù)而消失。心力衰竭時，其可增大或產(chǎn)生若干除極波，即DAD或振蕩后電位，該電位增高達到閾值時，則發(fā)出新的動作電位，從而形成期前收縮，如此產(chǎn)生連續(xù)沖動，則形成心動過速，產(chǎn)生TA而導(dǎo)致觸發(fā)性心律失常[12]。DAD是誘發(fā)觸發(fā)性心律失常的主要原因之一，其發(fā)生在4相復(fù)極后，主要由Iti引起。Iti電流的載流離子主要是鈣離子和鈉離子，直接受INCX和細胞內(nèi)鈣離子的調(diào)控，也有少部分受鈣激活氯電流(ICl,Ca)和非選擇性陽離子穩(wěn)態(tài)電流(Isus)的影響[13-15]。其中，細胞內(nèi)鈣離子超載起著關(guān)鍵性作用，故凡是引起細胞內(nèi)Ca2+超載的因素都可促發(fā)這一離子流，從而產(chǎn)生DAD或TA。反之，抑制細胞內(nèi)Ca2+超載，降低Iti電流，則可減少DAD和TA的發(fā)生[16,17]。本研究結(jié)果顯示，All可減少心力衰竭時細胞內(nèi)鈣瞬變，降低鈉鈣交換體內(nèi)向電流的增加，直接或間接降低Iti電流，特別是內(nèi)向電流的增加，同時緩解ICa,L的升高。因此，All通過抑制多個離子流和細胞內(nèi)鈣離子的改變，減少了心力衰竭DAD及由此引發(fā)的TA的發(fā)生，為緩解心力衰竭時SCD的干預(yù)提供了可能，也為該藥物的研發(fā)提供了部分實驗依據(jù)。

然而，All是否影響參與心力衰竭時細胞內(nèi)鈣離子改變的蛋白尚未可知，也無法得知其對細胞內(nèi)鈣作用的分子基礎(chǔ)，同時也未在整體動物層面就All對心力衰竭后觸發(fā)性心律失常的效應(yīng)進行探究，因此，本課題下一步工作需要對上述問題進行探究。