游海星，林 堅(jiān)，林魯飛

(海南省?？谑械谌嗣襻t(yī)院兒科 570102)

支氣管哮喘是一種常見的兒童呼吸道疾病。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，近年來(lái)美國(guó)、澳大利亞及歐洲發(fā)達(dá)國(guó)家兒童哮喘的發(fā)病率和病死率均有所上升。在中國(guó)，兒童哮喘患病率也呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)[1]。哮喘嚴(yán)重影響兒童的身心健康，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[2]。香草醛亞型1(TRPV1)受體是由辣椒素激活的辣椒素受體，它為陽(yáng)離子通道超家族成員并廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物呼吸系統(tǒng)[3]。研究表明TRPV1在兒童支氣管哮喘發(fā)病調(diào)控中有重要影響[4]。隨著對(duì)呼吸系統(tǒng)炎癥機(jī)制的深入了解，哮喘中TRPV1基因信號(hào)調(diào)節(jié)已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。眾所周知，支氣管哮喘是一種由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子共同參與的慢性呼吸道炎癥性疾病[5]。然而，目前TRPV1及相關(guān)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在兒童支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制中尚不清楚。本研究擬通過(guò)臨床數(shù)據(jù)，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)及回顧性分析篩選兒童支氣管哮喘相關(guān)的細(xì)胞因子，建立兒童支氣管哮喘TRPV1及相關(guān)細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為研究?jī)和夤芟陌l(fā)病機(jī)制提供一定的線索。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2016年12月在本院兒科就診的3～14歲哮喘患兒100例作為病例組，其中男57例，女43例，體質(zhì)量(18.2±5.4)kg。選擇同期來(lái)本院做健康體檢的兒童100例作為對(duì)照組，其中男59例，女41例，體質(zhì)量(17.7±4.8)kg。病例組患兒的哮喘診斷均符合國(guó)際哮喘指南。對(duì)照組兒童無(wú)哮喘家族史、個(gè)人過(guò)敏史及支氣管哮喘病史。所有研究對(duì)象的監(jiān)護(hù)人均簽訂知情同意書，本研究獲得海口市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2方法

1.2.1血液標(biāo)本采集 接受哮喘治療前，采集兩組兒童的5 mL外周靜脈血，吸取1 mL標(biāo)本與乙二胺四乙酸(EDTA)混合抗凝用于提取總RNA，其余血液標(biāo)本以2 000 r/min離心10 min后放于-70 ℃冰箱用于檢測(cè)。

1.2.2受試者TRPV1 mRNA水平實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 將1 mL外周靜脈血與EDTA混合抗凝，用總RNA快速提取試劑盒從外周血淋巴細(xì)胞中提取RNA 。根據(jù)試劑盒操作手冊(cè)使用Oligo DT作為引物，總RNA作為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank所列的TRPV1基因序列，合成TRPV1 mRNA上游引物序列和下游引物序列。上游引物序列:5′-GGC TGT CTT CAT CAT CCT GCT GCT-3′;下游引物序列:5′-GTT CTT GCT CTC CTG TGC GAT CTT GT-3′;PCR產(chǎn)物的大小是117 bp 。以GAPDH作為內(nèi)參，實(shí)時(shí)定量PCR合成的GAPDH上游引物序列和下游組成引物序列為：上游引物序列:5′-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3′,下游引物序列:5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3′GAPDH PCR產(chǎn)物大小為87 bp。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：預(yù)變性94 ℃ 10 min；變性94 ℃ 30 s；退火56 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 30 s，總共40個(gè)循環(huán)，30個(gè)循環(huán)后延伸溫度改為7 min，由Wilcoxon秩和檢驗(yàn)計(jì)算置信區(qū)間和相對(duì)定量，用2-ΔΔCT比較病例組和對(duì)照組的TRPV1的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 兩組rs4790521和rs4790522基因型分布差異(n)

1.2.3篩選和檢測(cè)目標(biāo)SNP位點(diǎn) 參考美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心NCBI SNP數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定MAF(minor allele frequency)> 5%且r2>0.8，篩選出UTR-3基因的特定SNP。SNP檢測(cè):上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.4血涂片細(xì)胞計(jì)數(shù)和全血清IgE檢測(cè) 在400倍鏡下進(jìn)行嗜酸性粒細(xì)胞的計(jì)數(shù)，總血清IgE水平則通過(guò)雙抗夾心的ELISA檢測(cè)。

1.2.5細(xì)胞因子檢測(cè) ELISA檢測(cè)病例組患兒治療前后及對(duì)照組兒童血清中γ-干擾素(IFN-γ)，IL-2，IL-17A，IL-4 和IL-5的水平，所有的檢測(cè)步驟均按試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1兩組TRPV1基因表達(dá)水平和SNP位點(diǎn)分析 病例組患兒外周血中的TRPV1基因表達(dá)水平為6.27±2.13高于健康兒童的3.08±1.25(t=12.92，P<0.01)。根據(jù)基因測(cè)序，兩組間兩個(gè)SNP位點(diǎn)(rs4790521和rs4790522)基因型分布也不同。根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果rs4790521位點(diǎn)的分布，病例組與對(duì)照組的CC、CT、TT 3個(gè)基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；等位基因C在病例組中遠(yuǎn)多于對(duì)照組(P<0.05)。而rs4790522位點(diǎn)的CC、CA、AA 3個(gè)基因型分布在兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，等位基因C在病例組中遠(yuǎn)多于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

2.2兒童支氣管哮喘的相關(guān)細(xì)胞因子水平和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 病例組患兒血清中IgE水平，嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)計(jì)數(shù)，IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-4和IL-5水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 兩組哮喘的相關(guān)細(xì)胞因子水平和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

2.3兒童支氣管哮喘相關(guān)的細(xì)胞因子和TRPV1基因Logistic回歸分析 通過(guò)Logistic回歸分析結(jié)果顯示：外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、TRPV1 mRNA表達(dá)水平、IL-4和IL-5水平是兒童支氣管哮喘的危險(xiǎn)因素。見表3。

表3 兒童哮喘相關(guān)細(xì)胞因子和TRPV1基因的Logistic回歸分析

2.4建立TRPV1基因的兒童支氣管哮喘調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 根據(jù)KEGG信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)TRPV1和兒童支氣管哮喘相關(guān)的細(xì)胞因子包括IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-17A進(jìn)行了分析，繪制出一個(gè)初步的兒童支氣管哮喘的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，見圖1。兒童支氣管哮喘調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，且TRPV1與TH1、Th2和Th17等細(xì)胞因子均能引發(fā)兒童支氣管哮喘。Th1可能提升腫瘤壞死因子(TNF)-β，IFN-γ和IL-2水平，Th2可能提升IL-4、IL-5和IL-10水平，Th17可能提升IL-17A水平，而IL-17A會(huì)影響IL-1β從而影響TRPV1。此外，某些可能導(dǎo)致免疫功能紊亂或外周敏感性增加、氣管黏膜損傷的因素都會(huì)影響TRPV1水平，最后導(dǎo)致兒童支氣管哮喘。

2.5突變位點(diǎn)rs4790522和rs4790521的具體定位 突變位點(diǎn)rs4790522和rs4790521均定位于TRPV1基因的3′非翻譯區(qū)，見圖2。

圖1 兒童支氣管哮喘部分調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

兩條豎紅線間的基因序列為TRPV1基因的CDS區(qū)基因序列;藍(lán)色盒子中的為突變堿基；點(diǎn)線區(qū)的基因序列正是突變后消失的miRNA結(jié)合位點(diǎn)；直線區(qū)基因序列則為突變后新的miRNA結(jié)合位點(diǎn)

圖2 突變位點(diǎn)rs4790522和rs4790521的具體定位

3 討 論

近年來(lái)，TRPV1與兒童支氣管哮喘的關(guān)系已成為哮喘病理機(jī)制研究的熱點(diǎn)，且取得了一定的進(jìn)展。如BAKER等[4]研究表明TRPV1可能是誘導(dǎo)兒童哮喘的重要信號(hào)調(diào)節(jié)因子。此外，TRPV1在支氣管狹窄、蛋白分泌、氣管黏膜水腫、炎性細(xì)胞趨化、咳嗽反射等方面也起著重要作用[6]。最近的研究表明TRPV1存在于免疫組化的T細(xì)胞中，且能調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞活性及炎癥細(xì)胞的特異性[7]。MCGARVEY等[8]在人氣道上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)功能性的TRPV1在難治性支氣管哮喘患者氣道中高表達(dá)。本研究對(duì)TRPV1基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)病例組和對(duì)照組兩個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布存在明顯差異。TRPV1的mRNA水平和兩個(gè)SNP位點(diǎn)可能是兒童哮喘發(fā)病的反映指標(biāo)。

哮喘的另一個(gè)重要的致病機(jī)制與 Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞因子不平衡有關(guān)。Th1型細(xì)胞因子主要參與細(xì)胞免疫。Th2型細(xì)胞因子主要引起一些病理反應(yīng)，如增加血漿IgE水平，升高氣道EOS，引起氣道平滑肌的增生和肥大等。細(xì)胞因子Th17在促炎癥反應(yīng)和自身免疫中起重要作用。Treg型細(xì)胞因子可以通過(guò)分泌IL-10或細(xì)胞接觸機(jī)制(CTLA-4和GITR)調(diào)節(jié)和抑制免疫反應(yīng)。本研究顯示兩組外周血IgE水平、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均存在差異，這也表明了IgE水平和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在兒童支氣管哮喘中起重要作用。此外，兩組IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-17A水平也差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、IL-1、IL-5和TRPV1 mRNA水平是兒童支氣管哮喘的危險(xiǎn)因素。

本研究中建立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包含的基因和細(xì)胞因子是通過(guò)搜索KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合其他的文獻(xiàn)所構(gòu)建的。兒童支氣管哮喘調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，且其中TRPV1、Th1、Th2、Th17之間又相互影響共同導(dǎo)致免疫功能紊亂或外周敏感增加引起兒童支氣管哮喘。本研究建立的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)僅為兒童支氣管哮喘調(diào)控機(jī)制的一部分。 國(guó)內(nèi)外關(guān)于miRNA和兒童支氣管哮喘的研究大多數(shù)集中于miRNA在支氣管哮喘信號(hào)通路或者miRNA作為哮喘診斷標(biāo)志等方面。HUO等[9]發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞和血漿的miR-181b-15p是呼吸道嗜酸性增多的標(biāo)志物，且能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)促炎因子的表達(dá)產(chǎn)生嗜酸細(xì)胞性氣道炎癥。MAES等[10]的研究發(fā)現(xiàn)miR-223-3p、miR-142-3p及miR-629-3p在嚴(yán)重哮喘患者痰液中高表達(dá)。本研究顯示TRPV1miRNA能作為氣道炎癥標(biāo)志物。另外，rs4790522和rs4790521兩個(gè)位點(diǎn)的突變?cè)赥RPV1的3′UTR端，3′調(diào)控區(qū)在基因表達(dá)方面起重要作用，在這個(gè)區(qū)域突變可能影響基因的表達(dá)。TRPV1基因rs4790521和rs4790522突變位點(diǎn)介導(dǎo)相應(yīng)miRNA的改變可能是病例組和對(duì)照組間存在顯著差異的潛在分子機(jī)制。本研究建立的兒童支氣管哮喘調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為兒童支氣管哮喘機(jī)制研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。