朱新鋒，張 霞，白建華，高紅強(qiáng)

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院肝膽胰外科，武漢430000；2.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院肝膽胰外科，昆明 650011)

肝癌是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、病死率高等特點(diǎn)。早期肝癌常癥狀無(wú)特異性，隨病情進(jìn)展可導(dǎo)致肝區(qū)疼痛、乏力、消瘦等癥狀，嚴(yán)重者可引起肝衰竭，甚至引起死亡[1]。目前，肝癌的治療方法有多種，由于多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期階段，手術(shù)治療療效欠佳，化療、放療等治療成為了其極重要的治療方法，但由于肝癌的化療耐藥明顯，易導(dǎo)致療效欠佳，故如何提高患者的療效具有重要的臨床意義[2-3]。而全反式維甲酸(ATRA)是臨床上常用的一種分化劑，已逐漸被應(yīng)用于惡性腫瘤的治療中，有利于增加癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，同時(shí)加速腫瘤細(xì)胞分化和凋亡[4]。對(duì)此，本研究對(duì)在肝癌細(xì)胞系HepG2中應(yīng)用ATRA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探討其對(duì)腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與儀器 肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，ATRA和二甲基亞砜(DMSO)和四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，雙抗(青霉素/鏈霉素)購(gòu)于上海Hyclone公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于上海Gibico公司，0.25%胰蛋白酶購(gòu)于上海Hyclone公司，細(xì)胞因子EGF、FGF2、B27購(gòu)于德國(guó)Miltenyi公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)于北京Solarbio公司，CD133磁珠、MACS分選柱、磁珠分選套裝購(gòu)于德國(guó)Miltenyi公司，新生胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司，鼠抗人Cyclin D和STAT3抗體購(gòu)于上海聯(lián)世生物科技有限公司，顯色試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce公司，其中ATRA通過(guò)二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成20 mmol/L，-20 ℃避光保存，使用時(shí)通過(guò)完全培養(yǎng)基稀釋至使用濃度。

1.1.2儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)，680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，倒置顯微鏡和共聚焦熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，核酸蛋白測(cè)定儀和化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(美國(guó)GE公司)。

1.2方法

1.2.1肝癌細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇后的人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞通過(guò)含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好和密度達(dá)到85%以上的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2HepG2肝癌細(xì)胞株中CD133+細(xì)胞的磁珠分選 取出培養(yǎng)箱中的HepG2進(jìn)行胰酶消化后，在細(xì)胞沖洗液里加入FcR Blocking 20 μL和CD133磁珠抗體20 μL，混勻后在4 ℃孵育30 min后進(jìn)行磁珠抗體孵育，再進(jìn)行磁珠分選，分選出CD133+的HepG2肝癌干細(xì)胞。

1.2.3干細(xì)胞培養(yǎng)、純化和鑒定 肝癌干細(xì)胞(HepG2/CD133+)的培養(yǎng)基為不含酚紅的DMEM/F12，含有20 ng/mL EGF、10 ng/mL FGF2和1%B27生長(zhǎng)因子以維持干細(xì)胞的干性和生長(zhǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)于懸浮細(xì)胞6孔培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到5 d形成干細(xì)胞球后，300 r/min離心收集細(xì)胞；移除上清液，加入1 mL胰酶進(jìn)行重懸，靜置5 min；用移液器反復(fù)吹打直至細(xì)胞球變成單個(gè)細(xì)胞，PBS清洗后再次300 r/min離心收集細(xì)胞；去除上清液，將細(xì)胞重懸于干細(xì)胞培養(yǎng)基中，按1∶2比例傳代于新的6孔懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板中；每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，防止污染；CD133+細(xì)胞每培養(yǎng)3代后(每代5～7 d)，用CD133磁珠抗體進(jìn)行分離純化，保證CD133的高陽(yáng)性率，分離純化后進(jìn)行流式細(xì)胞鑒定CD33+細(xì)胞純度。

1.2.4細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT法) 取培養(yǎng)后肝腫瘤相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞樣細(xì)胞以2.5×107/L密度接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103/mL、每孔200 μL、邊緣孔200 μL的PBS填充，按1∶1比例分為高量組、低量組、對(duì)照組，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3次，高量組加入10 μmol/L ATRA，低量組加入1 μmol/L ATRA，對(duì)照組不作任何處理，按 1、5、10 d共3個(gè)時(shí)相培養(yǎng)，每孔加入10 μL的MTT(5 g/L)孵育 4 h后，每孔加入100 μL DMSO終止，振蕩10 min，全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)吸光度(A)，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.2.5Cyclin D和STAT3基因蛋白檢測(cè)(蛋白質(zhì)印跡法) 提取細(xì)胞總蛋白、測(cè)定蛋白濃度后定量、加上樣緩沖液99 ℃變性10 min、蛋白上樣后，電泳、轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉2 h后，按分別加入1∶1 000的Cyclin D和1∶20 000的GAPDH一抗，4 ℃過(guò)夜雜交，第2天洗膜后分別加入羊和鼠二抗室溫雜交1 h，洗膜后加入顯影液顯影，以對(duì)照組1.00為對(duì)照，3次實(shí)驗(yàn)，取平均值，以相同的方法測(cè)定STAT3基因蛋白表達(dá)情況。

表1 ATRA對(duì)HepG2肝癌干細(xì)胞增殖能力的影響

2 結(jié) 果

2.1ATRA對(duì)HepG2肝癌干細(xì)胞增殖能力的影響 HepG2肝癌干細(xì)胞在1、5、10 d細(xì)胞增殖能力方面，高量組、低量組、對(duì)照組呈逐漸上升趨勢(shì)，但高量組上升值明顯低于低量組，低量組上升值明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

圖1 ATRA對(duì)HepG2肝癌干細(xì)胞增殖能力的影響

2.2ATRA對(duì)HepG2肝癌干細(xì)胞Cyclin D基因蛋白表達(dá)的影響 蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，高量組、低量組Cyclin D基因蛋白表達(dá)水平不斷下降，但高量組下降值明顯高于低量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖2～3。

表2 ATRA對(duì)HepG2肝癌干細(xì)胞Cyclin D基因蛋白表達(dá)的影響

2.3ATRA對(duì)HepG2肝癌干細(xì)胞STAT3基因蛋白表達(dá)的影響 蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，高量組、低量組STAT3基因蛋白表達(dá)水平不斷下降，但高量組下降值明顯高于低量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3、圖4和5。

圖2 ATRA對(duì)HepG2肝癌干細(xì)胞Cyclin D基因蛋白表達(dá)的影響

圖3 Cyclin D基因蛋白蛋白質(zhì)印跡法

組別孔數(shù)(n)1 d5 d10 d下降值對(duì)照組321.00±0.001.00±0.001.00±0.000低量組320.94±0.080.88±0.060.82±0.050.20±0.03高量組320.87±0.070.79±0.050.70±0.040.31±0.04F20.43626.75138.92753.612P<0.05<0.05<0.05<0.05

圖4 ATRA對(duì)HepG2肝癌干細(xì)胞STAT3基因蛋白表達(dá)的影響

圖5 STAT3基因蛋白蛋白質(zhì)印跡法

3 討 論

肝癌是指發(fā)生在肝臟部位的惡性腫瘤病變，其病因尚未明確，是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，主要與病毒感染、環(huán)境、肝硬化等有關(guān)，患者在早期一般無(wú)臨床癥狀亦難以察覺(jué)，臨床確診時(shí)多已至中晚期，導(dǎo)致無(wú)法接受手術(shù)切除治療[5]。而化療是臨床上治療肝癌的重要方法之一，通過(guò)化療藥物的細(xì)胞毒作用可有效滅殺肝癌細(xì)胞，但由于肝癌細(xì)胞易出現(xiàn)化療耐藥，影響患者的治療效果，故如何有效確保患者的臨床療效具有重要的價(jià)值[6]。

有研究表明，腫瘤組織中存在一類具有干細(xì)胞性狀的腫瘤細(xì)胞即腫瘤干細(xì)胞，有自我更新、多能分化、高速增殖等特性，這類細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中占有的比例雖小，但可高表達(dá)耐藥相關(guān)基因，以對(duì)抗腫瘤細(xì)胞凋亡及改變腫瘤細(xì)胞表面的藥物作用靶點(diǎn)，還可將化療藥物泵出腫瘤細(xì)胞，使細(xì)胞毒類藥物對(duì)靜息期的腫瘤干細(xì)胞及活躍期腫瘤細(xì)胞的殺傷作用下降，從而對(duì)化療藥物產(chǎn)生抗性[7]。目前已明確的肝癌干細(xì)胞標(biāo)志有CD133、EpCAM、CD44、OV6、CK19、CD90 和甲胎蛋白(AFP)等，其中CD133最具代表性[8]，本研究選用肝癌公認(rèn)且最常見(jiàn)的CD133抗原作為分選標(biāo)記。

而有研究表明，細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)是細(xì)胞增殖調(diào)控的關(guān)鍵位點(diǎn)，Cyclin D蛋白則是調(diào)節(jié)G1期細(xì)胞增殖信號(hào)的關(guān)鍵蛋白，可與CDK4或CDK6形成激酶復(fù)合物，在細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如加快釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F、使關(guān)鍵底物 PRb磷酸化等，進(jìn)而促使細(xì)胞生長(zhǎng)周期加快，在腫瘤干細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，在誘導(dǎo)細(xì)胞惡性增殖中發(fā)揮重要的作用[9]。同時(shí)，有研究顯示STAT3基因是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等一系列生物學(xué)行為的信號(hào)通路，其基因表達(dá)可促使腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡、缺氧反應(yīng)、轉(zhuǎn)移、血管生成等多種相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等生物學(xué)行為的能力[10]。

ATRA是臨床上常用的一種分化劑，是動(dòng)物體內(nèi)維生素A的代謝中間產(chǎn)物，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡、增加癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性、促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖、增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺滅作用等作用，已逐漸被應(yīng)用于多種惡性腫瘤治療中，且具有良好的療效[11]。

本研究通過(guò)在肝癌細(xì)胞系HepG2中應(yīng)用ATRA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在HepG2肝癌干細(xì)胞1、5、10 d的A570值方面，高量組、低量組、對(duì)照組呈逐漸上升趨勢(shì)，但高量組上升值明顯低于低量組，低量組上升值明顯低于對(duì)照組，表明ATRA可有效抑制HepG2肝癌干細(xì)胞的增殖，且其藥物濃度越高，抑制作用越顯著。這可能是由于ATRA可誘使腫瘤干細(xì)胞分化，使異常的腫瘤干細(xì)胞分裂方式增加細(xì)胞數(shù)量的復(fù)雜過(guò)程得以恢復(fù)，并使其分化[12-13]，尤其是使其中的肝腫瘤干細(xì)胞分化而失去干細(xì)胞自我更新、多能分化、高速增殖等特性，進(jìn)而被ATRA誘導(dǎo)和分化為肝癌細(xì)胞，從而有效抑制HepG2肝癌干細(xì)胞的增殖。同時(shí)，隨著時(shí)間的推移，可能因?yàn)樵鲋持芷?2～3 d)比肝癌干細(xì)胞短(5～7 d)，肝癌細(xì)胞又可再被ATRA分化為增殖周期接近正常的細(xì)胞[13-14]，從而有效降低了腫瘤細(xì)胞侵襲及遷移能力及抑制了腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，并有效減少了干細(xì)胞高表達(dá)耐藥相關(guān)基因的作用，有利于提高療效。同時(shí)研究中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)印跡法ATRA的1、5、10 d結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，高量組、低量組Cyclin D和STAT3基因蛋白表達(dá)水平不斷下降，但高量組下降值明顯高于低量組，表明ATRA可有效降低肝癌細(xì)胞系HepG2中腫瘤干細(xì)胞Cyclin D、STAT3等基因蛋白表達(dá)水平。這可能是ATRA能夠有效激發(fā)肝腫瘤干細(xì)胞的分化潛能，使肝腫瘤干細(xì)胞周期得以調(diào)節(jié)，導(dǎo)致肝腫瘤干細(xì)胞無(wú)法獲得自主生長(zhǎng)信號(hào)，尤其是可能通過(guò)抑制調(diào)節(jié)G1期細(xì)胞增殖信號(hào)的關(guān)鍵蛋白Cyclin D的表達(dá)，使肝腫瘤干細(xì)胞增殖周期延長(zhǎng)，并可能通過(guò)抑制STAT3基因的活化，使肝腫瘤干細(xì)增殖、抗凋亡、缺氧反應(yīng)、轉(zhuǎn)移、血管生成等多種相關(guān)基因的表達(dá)下降[15]，有效抑制了HepG2肝癌干細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其向肝腫瘤細(xì)胞分化，并隨著ATRA的持續(xù)分化作用，能夠進(jìn)一步促使肝腫瘤細(xì)胞趨向分化為接近正常的細(xì)胞，從而減弱肝腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等生物學(xué)行為的能力。但本研究仍存在不足，ATRA如何下調(diào)Cyclin D、STAT3的機(jī)制及相關(guān)通路仍不清楚，還需做大量的研究以作探討。

綜上所述，ATRA可有效降低HepG2肝癌干細(xì)胞Cyclin D、STAT3等基因蛋白表達(dá)水平，有利于抑制HepG2肝癌干細(xì)胞的增殖。