金文松，劉文君，李立志，夏俊慧，李長樂，林 輝，張燎原*，胡開輝*

1福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2福建農(nóng)林大學(xué)(古田)菌業(yè)研究院，古田352200

茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf是一種古老的大型藥食兩用真菌，在我國具有悠久的藥用歷史。茯苓主要成分包括多糖、三萜、蛋白質(zhì)、脂肪與氨基酸，同時還含有少量的月桂酸、膽堿及一些微量元素，其中茯苓三萜類化合物與多糖因其藥用功效備受關(guān)注。截至目前為止，對茯苓進行的植物化學(xué)研究結(jié)果表明超過80種茯苓三萜類化合物被成功分離與鑒定[1-6]；根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)特征，茯苓三萜類化合物可以細分為四大類，分別為羊毛甾烷-8-烯型，羊毛甾烷-7，9(11)-二烯型，3，4-開環(huán)-羊毛甾烷-8-烯型與3，4-開環(huán)-羊毛甾烷-7，9(11)-二烯型[5]。并且茯苓三萜類化合物幾乎都被認為是羊毛甾烷與開環(huán)羊毛甾烷骨架的衍生物。藥理學(xué)研究結(jié)果表明茯苓三萜類化合物具有顯著的利尿、健胃補脾、治療失眠、抗炎癥，抗腫瘤細胞增殖，抗氧化和抗高血糖癥等功效[1,5,7]。真菌多糖因其免疫調(diào)節(jié)功能與抗腫瘤功效受到了越來越多的關(guān)注[8]。茯苓菌核與菌絲中主要成分為茯苓多糖，茯苓多糖含量可以達到茯苓干重的80%以上。然而茯苓發(fā)酵菌絲與菌核中多糖主要是一種水不溶性多糖[9,10]，β-(1→3)-D-葡聚糖，其并沒有展現(xiàn)抗腫瘤活力，而β-(1→3)-D-葡聚糖的三種水溶性衍生物均表現(xiàn)出體內(nèi)與體外抗腫瘤細胞的生物學(xué)功能[11,12]。

目前茯苓資源主要以人工鍛木栽培獲得。這種栽培方式消耗大量林業(yè)資源，使得菌林矛盾日益尖銳化。并且人工栽培茯苓過程生長周期長，生物學(xué)效率低，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差，且易受產(chǎn)地、氣候、病蟲害等環(huán)境因素影響。茯苓的人工栽培也存在連作障礙現(xiàn)象，影響茯苓產(chǎn)量與質(zhì)量[13]。因此，尋求替代茯苓人工栽培方式獲取茯苓藥用成分資源成為當前的一個研究熱點。茯苓菌絲液體發(fā)酵是替代人工栽培獲取藥用成分資源的良好選擇。實驗數(shù)據(jù)表明提純的茯苓功效三萜類化合物比茯苓天然藥的藥效更好[14]；盡管茯苓菌絲多糖含量低于茯苓菌核[15]，但兩者多糖的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)基本相同[9]。因此，如若應(yīng)用茯苓菌絲液體發(fā)酵策略實現(xiàn)生產(chǎn)具有明確功效的茯苓藥用成分，可能將進一步提高茯苓的藥用功效，同時可以緩解當前日益緊張的菌林矛盾。

要實現(xiàn)茯苓功效藥用成分的發(fā)酵生產(chǎn)，需要明確解決以下四個方面的科學(xué)問題。第一，篩選高產(chǎn)茯苓藥用成分的優(yōu)良菌株；第二，茯苓產(chǎn)藥用成分培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件的優(yōu)化；第三，解析茯苓藥用成分的合成途徑；第四，明確茯苓藥用成分的提純條件。在本項研究中，課題組基于前期茯苓菌株的收集工作，應(yīng)用液體發(fā)酵策略，分析16種茯苓菌株產(chǎn)胞內(nèi)三萜類化合物與胞內(nèi)多糖的能力，以期從這16種茯苓菌株中篩選高產(chǎn)三萜類化合物和多糖的優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 茯苓菌株收集

本項目前期通過菌株購買方式與新鮮茯苓菌核分離方式，共收集到16種茯苓菌株，具體菌株編號、菌株來源與菌株俗名見表1。

表1 茯苓菌株收集信息

1.2 試劑

熊果酸(U820363-250MG)購自于北京普益華科技有限公司；Vitamin B1，苯酚，香蘭素與化學(xué)試劑如KH2PO4，無水MgSO4，葡萄糖等均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司(北京，中國)。

1.3 茯苓菌株培養(yǎng)基配方

茯苓菌株固體PDA加富培養(yǎng)基(1 L)配方：土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，酵母粉 3 g，KH2PO41.5 g，無水MgSO40.75 g，Vitamin B1 100 mg，瓊脂20 g，pH自然。

茯苓菌株一級種子培養(yǎng)基(1 L)配方：土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，酵母粉 3 g，KH2PO41.5 g，無水MgSO40.75 g，Vitamin B1 100 mg，pH4.0。二級種子培養(yǎng)基配方同一級種子培養(yǎng)基，pH自然。

茯苓菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L)配方：蔗糖20 g，酵母浸膏2 g，KH2PO41.5 g，無水 MgSO40.75 g，Vitamin B1 5 mg，pH自然。

1.4 茯苓菌絲生長特性測定

1.4.1 固體培養(yǎng)基上茯苓菌絲生長速率測定

應(yīng)用直徑1.5 cm的打孔器在菌絲生長尖端打孔，接種到新鮮固體PDA加富平板(直徑9 cm)的正中央，菌絲面朝上。26 ℃，避光正置培養(yǎng)。應(yīng)用十字交叉法測量菌株的生長速率，并仔細觀察與記錄菌絲生長形態(tài)。

1.4.2 液體培養(yǎng)基中茯苓菌絲生長速率測定

應(yīng)用直徑1.5 cm的打孔器在菌絲生長尖端打孔，共6塊菌絲塊，接種到一級種子培養(yǎng)基(100 mL)，26 ℃，120 rpm，避光培養(yǎng)120 h。提高搖床轉(zhuǎn)速至200 rpm，培養(yǎng)12 h。隨后于120 rpm，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，即為制備好的茯苓一級菌種。以5%(v/v)比例，將一級菌種接種到二級種子培養(yǎng)基(100 mL)，120 rpm，26 ℃，避光培養(yǎng)120 h，即為制備好的茯苓二級菌種。

本研究在制備二級菌種時，每種菌株制備4瓶菌種，其中三瓶用于測定pH值與測定二級菌種的菌絲干重，余下一瓶作為發(fā)酵菌種暫時存放于4 ℃。用八層紗布過濾沖洗菌絲，收集菌絲到50 mL已稱重的離心管，10 000 rpm，離心20 min，倒置瀝干液體，置于60 ℃烘干至恒重，大約48 h，最后稱重量并作記錄。計算每種菌株三瓶二級菌絲干重平均值。茯苓菌株液體菌絲生長速率=菌絲干重/菌絲培養(yǎng)天數(shù)(11天)。

1.5 茯苓胞內(nèi)多糖含量測定

探索茯苓產(chǎn)胞內(nèi)多糖含量的最佳發(fā)酵天數(shù)。P0二級菌種按5%(v/v)接種至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，26 ℃，120 rpm，培養(yǎng)1、3、5、7、9、11、13天，收集菌絲操作同1.4.2。以蔗糖作為標準品，采用苯酚-濃硫酸法測定P0胞內(nèi)多糖含量[16]。分別接種相當于0.02 g干菌絲重量的二級菌種至發(fā)酵培養(yǎng)基，26 ℃，120 rpm，避光培養(yǎng)11天。測定pH值，收集菌絲操作同1.4.2。向樣品加入20 mL 1 M的NaOH， 60 ℃浸提1 h，浸提期間每隔20 min搖晃一次。取一定稀釋倍數(shù)的浸提液2 mL于試管中，最后應(yīng)用苯酚-濃硫酸法測定多糖含量。多糖產(chǎn)量換算公式如下。

y=(PC×W)/V2

y指多糖產(chǎn)量(g/L)，PC指多糖含量(mg/g)，W指菌絲干重(g)，V2指發(fā)酵液體積(L)。

1.6 茯苓胞內(nèi)三萜含量測定

探索茯苓產(chǎn)胞內(nèi)三萜含量的最佳發(fā)酵天數(shù)。P0二級菌種按5%(v/v)接種至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，26 ℃，120 rpm，培養(yǎng)1、3、5、7、9、11、13、15天，收集菌絲操作同1.4.2。以熊果酸作為標準品，采用香草醛-高氯酸法測定P0胞內(nèi)三萜含量[17]。分別接種相當于0.02 g干菌絲重量的二級菌種至發(fā)酵培養(yǎng)基，26 ℃，120 rpm，避光培養(yǎng)11天。測定pH值，收集菌絲操作同1.4.2。將樣品轉(zhuǎn)入到250 mL三角瓶，并向其入50 mL甲醇，37 ℃，180 rpm搖床中浸提15 h，取0.2 mL浸提液加入到10 mL試管，烘干，最后應(yīng)用香草醛-高氯酸法測定三萜含量。三萜產(chǎn)量換算公式如下。

y=(TC×W)/V2

y指三萜產(chǎn)量(g/L)，TC指茯苓三萜含量(mg/g)，W指菌絲干重(g)，V2指發(fā)酵液體積(L)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均設(shè)置三個平行，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)于三個平行測定數(shù)據(jù)平均值±SD。應(yīng)用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 茯苓菌絲生長于固體培養(yǎng)基的特性描述

16種茯苓菌株接種于PDA加富固體平板，分析茯苓菌絲在固體培養(yǎng)基上的生長特性，實驗結(jié)果見表2。就生長速率而言，AS5.137，AS5.78，Y1，SC與Z(z)菌株生長速率明顯較其他菌株生長快，其中Z(z)表現(xiàn)出最快的生長速率，達1.42±0.05 cm/天。W.C0003生長最慢，生長速率僅為0.81±0.02 cm/天。此外，菌絲生長特性大概可以歸為四類：第一類為菌絲層厚，菌絲邊緣齊整，氣生菌絲發(fā)達的菌株如Jingzhou28；第二類為菌絲層中等厚度，邊緣齊整，氣生菌絲較發(fā)達的菌株如Y1；第三類為菌絲層薄或較薄，邊緣齊整或較齊整，氣生菌絲不發(fā)達的菌株如AS5.137；第四類包括DB與A5兩個菌株，其菌絲邊緣呈鋸齒狀，明顯區(qū)別于其他菌株齊整或較齊整的菌絲邊緣。

表2 16株茯苓菌絲生長于固體培養(yǎng)基上的特性描述

注：同列中不同字母表示均值之間的顯著差異性(P<0.05)。

Note:The different letter in the same column represents the significant difference among the mean values (P<0.05).

2.2 茯苓菌絲生長于液體培養(yǎng)基的特性描述

16種茯苓菌株分別被接種于pH自然的一級種子培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)。培養(yǎng)1天后，菌絲開始圍繞著菌種塊生長，約第5天時，菌種塊被菌絲完全包圍，變成橢圓形的菌絲球。然而，在本研究分析的16種茯苓菌株中，發(fā)現(xiàn)約有一半菌株隨著培養(yǎng)的進行，培養(yǎng)物顏色逐步加深，甚至完全變黑(圖1A)。我們觀察到在培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化之后，菌絲幾乎不生長，或生長極慢。通過多次嘗試，發(fā)現(xiàn)降低培養(yǎng)基的初始pH到4.0時，可以適度緩解那些大部分在pH自然培養(yǎng)基中培養(yǎng)時發(fā)生培養(yǎng)物變黑的現(xiàn)象(圖1B)。因此，本研究后續(xù)實驗將一級菌種液體培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)成4.0。通過測定一級與二級培養(yǎng)物終pH，數(shù)據(jù)顯示茯苓菌絲會分泌酸性物質(zhì)，致使培養(yǎng)基的pH下降，大部分菌株培養(yǎng)物的pH值在2～4之間(表3)。此外，我們對茯苓菌株生長于固體培養(yǎng)基的生長速率是否能代表其在液體中的生長速率很感興趣。茯苓菌株在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長速率測定數(shù)據(jù)表明 AS5.78生長速率最快，超過0.06 g/d；G1菌株生長最慢，僅為0.02 g/d(表3)。將16種菌株在固體培養(yǎng)基上的生長速率數(shù)值與它們在液體培養(yǎng)基中的生長速率數(shù)值進行線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)R2小于0.3，表明茯苓菌株生長于固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基的生長速率之間不具有關(guān)聯(lián)性。

2.3 16種茯苓菌株產(chǎn)胞內(nèi)多糖比較

在基本了解16種茯苓菌株的基本生長特性之后，我們采用液體發(fā)酵策略分析這些菌株產(chǎn)胞內(nèi)多糖的性能。為了確定茯苓產(chǎn)胞內(nèi)多糖的最佳發(fā)酵天數(shù)，P0菌株被隨機選擇作為研究對象，通過測定一系列發(fā)酵天數(shù)P0菌絲生物量與胞內(nèi)多糖的OD值，根據(jù)蔗糖標準曲線回歸方程(圖2A)，計算發(fā)酵不同天數(shù)P0的胞內(nèi)多糖含量。實驗結(jié)果表明第7天時菌絲生物量達到最大值，胞內(nèi)多糖含量也在該天達到最大值，因此本研究確定發(fā)酵天數(shù)7天為茯苓產(chǎn)胞內(nèi)多糖的最佳發(fā)酵天數(shù)(圖2B)。

圖1 一級種子培養(yǎng)基初始pH對茯苓液體菌絲生長的影響Fig.1 Effect of the initial pH of the first-class seed medium on the mycelium growth of W.cocos注：A：如圖中的菌株接種到pH自然的一級種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)5天，一些菌株(如Jingzhou28)的發(fā)酵液變成褐色；B：G1接種于不同初始pH的一級種子培養(yǎng)基，圖片拍攝于培養(yǎng)5天的發(fā)酵液。Note:A:Strains were inoculated into the first seed medium (pH nature),and cultured for 5 d.The color of the culture of certain strains like Jingzhou28 was brown;B:G1 was individually inoculated into the first-class seed media with initial pH values varying from 4.0 to 5.5,and the picture was taken at the fifth day of fermentation.

表3 16種茯苓菌絲生長于種子培養(yǎng)基的特性描述

注：同列中不同字母表示均值之間的顯著差異性(P<0.05)。

Note:The different letter in the same column represents the significant difference among the mean values (P<0.05).

通過對二級菌種的菌絲干重進行測定，Jingzhou28二級菌種干重為0.45±0.05 g，該值居于本研究中所有菌株二級菌絲干重的中等水平(表3)，因此本研究以5%(V/V)Jingzhou28二級菌種干重(0.02 g)作為參照，其他菌株按相當于各菌株菌絲干重0.02 g的液體菌種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，進行發(fā)酵培養(yǎng)7天，收集與檢測樣品胞內(nèi)多糖。實驗結(jié)果表明AS5.137胞內(nèi)多糖含量最高，達377.60±0.10 mg/g，G1胞內(nèi)多糖含量最低，僅為188.13±13.58 mg/g，其余菌株胞內(nèi)多糖含量介于188～377 mg/g (表4)。多糖產(chǎn)量最高的菌株為DB，達1.01±0.13 g/L，多糖產(chǎn)量最低的菌株為TT，僅為0.34±0.02 g/L，其余菌株的多糖產(chǎn)量介于0.34～1.01 g/L之間。

圖2 發(fā)酵天數(shù)對胞內(nèi)多糖含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time course on intracelluar polysaccharide contents注A：蔗糖標準曲線；B：P0接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，收集不同發(fā)酵天數(shù)的菌絲體并測定菌絲干重與胞內(nèi)多糖含量。Note:A:The sucrose standard curve;B:P0 was inoculated into fermentation medium and the corresponding cultures were harvested at the indicated time points,followed by dry cell mass and intracellular polysaccharide determination assays.

表4 16種茯苓菌株產(chǎn)胞內(nèi)多糖信息

注：同列中不同字母表示均值之間的顯著差異性(P<0.05)。

Note:The different letter in the same column represents the significant difference among the mean values (P<0.05).

2.4 16種茯苓菌株產(chǎn)三萜化合物比較

為了明確茯苓產(chǎn)胞內(nèi)三萜的最佳發(fā)酵天數(shù)，本研究以P0作為研究對象，分別在如圖3B中標示的時間點收集樣品，測定菌絲干重與測定胞內(nèi)三萜類化合物在548 nm處的吸光值。以熊果酸作為標準品，繪制標準曲線(圖3A)，根據(jù)熊果酸標準曲線回歸方程計算茯苓產(chǎn)胞內(nèi)三萜的量。發(fā)酵11天的P0菌絲顯示最高的三萜類化合物含量，約達70 mg/g，盡管發(fā)酵第11天的菌絲干重生物量較第7天有稍許減少(圖3B)。綜合考慮菌絲干重與胞內(nèi)三萜含量兩個參數(shù)，本研究明確茯苓產(chǎn)胞內(nèi)三萜的最佳發(fā)酵天數(shù)為11天。為了比較16種茯苓菌株產(chǎn)胞內(nèi)三萜的性能，我們一致地將發(fā)酵培養(yǎng)的接種量調(diào)整為相當于各菌株菌絲干重的0.02 g。通過對16種茯苓菌株進行11天的發(fā)酵培養(yǎng)，收集樣品，測定菌絲干重與胞內(nèi)三萜含量。實驗結(jié)果表明Y1菌絲胞內(nèi)三萜含量最高，達83.89±4.28 mg/g，G1菌絲胞內(nèi)三萜含量最低，僅16.09±5.25 mg/g (表5)。Y1菌絲胞內(nèi)三萜含量是G1菌絲胞內(nèi)三萜含量的5倍多，說明茯苓菌株之間產(chǎn)胞內(nèi)三萜能力具有顯著差異性。盡管Jingzhou28胞內(nèi)三萜含量僅為73.39±9.97 mg/g，但因其菌絲生物量較大，Jingzhou28顯示最高的胞內(nèi)三萜產(chǎn)量，達136.63±26.66 mg/L(表5)。

圖3 發(fā)酵天數(shù)對胞內(nèi)三萜含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time course on intracelluar triterpenoid contents注A：熊果酸標準曲線；B：P0接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，收集不同發(fā)酵天數(shù)的菌絲體并測定菌絲干重與胞內(nèi)三萜含量。Note:A:The ursolic acid standard curve;B:P0 was inoculated into fermentation medium and the corresponding cultures were harvested at the indicated time points,followed by dry cell mass and intracellular triterpenoid determination assays.

表5 16種茯苓菌株產(chǎn)胞內(nèi)三萜信息

注：同列中不同字母表示均值之間的顯著差異性(P<0.05)。

Note:The different letter in the same column represents the significant difference among the mean values (P<0.05).

3 結(jié)論

茯苓菌絲液體發(fā)酵的研究進展已由唐艷平等人綜述[18]。但較系統(tǒng)地分析茯苓菌株之間產(chǎn)三萜與多糖的研究尚未見報導(dǎo)。本研究收集了共16種茯苓菌株，較系統(tǒng)性地分析各菌株產(chǎn)茯苓藥效成分的潛能是本文的目的。生長速率測定結(jié)果表明菌株生長于固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基的生長速率之間不具有相關(guān)性(表2與3)。茯苓在發(fā)酵過程中培養(yǎng)物變黑的現(xiàn)象已有報導(dǎo)[19]，我們分析的菌株在pH自然的一級種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)時都會或多或少出現(xiàn)培養(yǎng)物變黑的現(xiàn)象。通過將一級種子培養(yǎng)基的初始pH調(diào)整到4.0，大部分的菌株都可以正常的生長，但SD菌株(ACCC 51978)即使在初始pH3.0的條件下培養(yǎng)，仍會發(fā)生一定程度的褐化(數(shù)據(jù)未顯示)。本研究中發(fā)現(xiàn)茯苓產(chǎn)胞內(nèi)多糖的最佳發(fā)酵天數(shù)為7天，同時該天菌絲的生物量也達最大值，這與唐業(yè)剛等報導(dǎo)的結(jié)果大致相同[20]。16種茯苓菌株的胞內(nèi)多糖含量從188.13±13.58 mg/g到377.60±0.10 mg/g不等，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量介于0.34±0.02 g/L到1.01±0.13 g/L之間。以多糖含量為指標時，AS5.137菌絲單位重量內(nèi)的多糖含量最高，達377.60±0.10 mg/g；然而，以胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為指標時，DB顯示出最高的多糖產(chǎn)量，達1.01±0.13 g/L。綜合來看，茯苓菌株DB與AS5.137菌株均可以考慮作為茯苓發(fā)酵產(chǎn)胞內(nèi)多糖的出發(fā)菌株。在分析茯苓產(chǎn)胞內(nèi)三萜類化合物最佳發(fā)酵天數(shù)時，發(fā)現(xiàn)第11天時胞內(nèi)三萜類化合物含量最高，盡管此時的菌絲生物量較第7天有稍許下降。我們所確定的茯苓產(chǎn)胞內(nèi)三萜類化合物最佳發(fā)酵天數(shù)與周燕麗等報導(dǎo)的一致[21]。就胞內(nèi)三萜含量而言，Y1的胞內(nèi)三萜含量最高，達83.89±4.28 mg/g。但以三萜產(chǎn)量作為指標時，Y1，Jingzhou28，Z(z)與Xinpinzhong的胞內(nèi)三萜產(chǎn)量均大于130 mg/L，因此該四種菌株均適合作為產(chǎn)胞內(nèi)三萜的出發(fā)菌株。