動物源活性蛋白多肽的分離純化方法研究進展

付文鵬，楊永壽，肖培云*

1大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院；2云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，大理 671000

蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要作用。多肽是一類具有蛋白質(zhì)特性、分子量比蛋白質(zhì)小、由2～16個氨基酸通過肽鍵連接的化合物[1]。它涉及生物體內(nèi)各種細胞功能的調(diào)節(jié)，是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，人體攝入的蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解后，主要以肽的形式被消化吸收?？蒲泄ぷ髡哐芯堪l(fā)現(xiàn)，多肽具有抗凝血、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、增強免疫力、降血壓等作用[1]。蛋白多肽類藥物在預(yù)防和治療疾病中具有用藥劑量小、療效好、毒副作用低等突出優(yōu)點[2]，因此具有較大的研究開發(fā)價值。目前研究比較熱門的美洲大蠊、地龍、蜈蚣、鹿茸等動物類中藥的有效成分均以蛋白多肽為主。研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊中環(huán)二肽類化合物是發(fā)揮創(chuàng)面愈合的重要成分之一[3]，我國重要的中藥動物藥地龍和鹿茸的主要有效成分都是蛋白質(zhì)和多肽[4,5]，蜈蚣毒素有大量分子量在 3～10 KDa的多肽分子[6]。而蛋白多肽的分離純化是其研究與開發(fā)過程中的重要環(huán)節(jié)。蛋白多肽屬于大分子物質(zhì)，在分離純化過程中既要保持其組成成分、結(jié)構(gòu)性質(zhì)和生物活性均不變，還要保證其安全性和高回收率，以達到經(jīng)濟環(huán)保的目的。因此，諸多因素限制了傳統(tǒng)的植化分離方法在動物源蛋白多肽分離純化中的應(yīng)用，嚴重阻礙了對其的研究與開發(fā)。本文對近年來動物源活性蛋白多肽分離純化方法的研究進展進行綜述，以期為動物藥的研究開發(fā)提供思路和參考。

1 沉淀法

1.1 鹽析沉淀

中性鹽對蛋白多肽的溶解度有顯著影響，一般隨著鹽濃度的升高，蛋白多肽的溶解度也會增加，當鹽濃度繼續(xù)升高時，其溶解度不同程度下降并先后析出的過程稱為鹽析。分子大小、親水程度不同的蛋白多肽，鹽析時所需的鹽濃度不同，因此調(diào)節(jié)混合蛋白多肽溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白多肽分段沉淀，再通過透析除去鹽，達到分離的目的。

蛋白多肽鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉等。因為硫酸銨具有溫度系數(shù)小而溶解度大以及不易引起蛋白質(zhì)變性的優(yōu)點[7]，其在蛋白多肽的鹽析中應(yīng)用最多。冼永權(quán)等[8]在黑螞蟻纖溶活性蛋白的分離純化中，用硫酸銨逐級鹽析黑螞蟻浸提液，確定其最佳硫酸銨鹽析濃度為30%～90%。周愛梅等[9]用鹽析-柱層析結(jié)合法分離純化重組人源膠原蛋白，通過40%飽和度的硫酸銨沉淀與Sephadex G100凝膠柱純化后獲得二聚體，其達到了電泳純。Mariam等[10]用硫酸銨沉淀法純化兔多克隆免疫球蛋白G(IgG)，用40%飽和度的硫酸銨沉淀時，回收的多克隆IgG濃度最高(7.8mg/mL)，除白蛋白效果最好(除去72%的白蛋白)。

1.2 等電點沉淀

等電點沉淀是利用蛋白多肽在等電點時溶解度最小，而各種蛋白多肽的等電點有差別，通過調(diào)節(jié)溶液的pH達到某一蛋白多肽的等電點使之沉淀的方法。梁姍姍等[11]采用等電點絮凝法對蝦夷扇貝外套膜蛋白質(zhì)進行分離回收，不僅分離的蛋白質(zhì)純度高，還有明顯的脫脂及脫色效果。Geng等[12]用聚乙二醇(PEG)沉淀法將雞蛋清中的卵清蛋白(OVA)與卵粘蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵類粘蛋白分離，富含OVA的上清液再用等電點沉淀(pI為4.5和溫度為4 ℃)進一步純化，HPLC檢測OVA的純度為95.1%，產(chǎn)率為46.4%。

1.3 低溫有機溶劑沉淀

低溫有機溶劑沉淀是通過加入與水可混溶的甲醇、乙醇或丙酮等中性有機溶劑，降低電解質(zhì)的介電常數(shù)和破壞了蛋白多肽的膠體性，使多數(shù)蛋白多肽的溶解度降低并析出的方法。用不同濃度的有機溶劑并結(jié)合調(diào)節(jié)pH和離子強度可以分段沉淀不同的蛋白質(zhì)[13]。馬建[14]采用有機溶劑沉淀法對還原型谷胱甘肽抽提液進行了初步分離提純，確定了最佳工藝為：有機溶劑選用乙醇，乙醇與樣品的體積比為5，pH的適宜范圍為3.0～3.4，溫度為5 ℃。

2 色譜法

2.1 反相高效液相色譜

反相色譜(Reversed phase chromatography， RPC)是用極性大于固定相的有機溶劑(如甲醇、異丙醇、乙腈等)水溶液為流動相，進行物質(zhì)分離和分析的一種色譜方法。用于分離蛋白多肽的反相色譜固定相使用最廣是C8或C4配基的填料；應(yīng)用最廣的流動相是水-甲醇、水-乙腈和水-異丙醇。為使樣品組分有較好的溶解性，通常流動相pH在2～4之間，并且低pH抑制了樣品組分中酸性基團及硅膠上硅羥基的解離及非特異性吸附作用[15]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，向流動相中添加10%～16%三氟乙醇(TFE)能顯著改善肽的色譜分離[16]。Ghassem等[17]應(yīng)用反相高效液相色譜將鯉魚肌原纖維蛋白具有ACE抑制活性最高的組分F2分成五個組分(A～E)，并結(jié)合ESI-TOF MS / MS進行氨基酸序列分析，得知這些肽具有高ACE抑制活性的原因是在C-末端序列處存在兩個脯氨酸殘基。Basseri等[18]用高效液相色譜從美洲大蠊免疫誘導(dǎo)的血淋巴中分離到分子量62 KDa的抗菌肽。Ennaas等[19]用反相高效液相色譜從大鯖魚的副產(chǎn)物protamex水解產(chǎn)物中分離得到四種抗菌肽。

2.2 凝膠排阻色譜

凝膠排阻色譜(gel exclusion chromatography)又叫凝膠色譜、分子篩色譜、凝膠過濾等，其分離機理是根據(jù)溶質(zhì)分子大小進行過篩，溶液中所有組分按分子尺寸由大到小的順序流出 ，達到分離的目的。它既適用于分子量較低的多肽、聚核苷酸等生物分子的分離，也適用于蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)的純化。凝膠色譜主要有Sephadex G系列、Superose系列、硅膠系列、Bio-Gel Px系列等。Wang等[20]將鯊魚皮水解產(chǎn)物通過SP-Sephadex C-25柱，Sephadex G-50柱和C18反相高效液相色譜分離，得到一個分子量為906Da的親水性三肽，氨基酸序列是GAIGPAGPLGP。宋雪梅[21]通過Sephadex G-25凝膠色譜對牛乳硬質(zhì)干酪中的苦味肽進行分離，得到3個組分，經(jīng)鑒定組分Ⅱ中存在14種苦味肽。Jiang等[22]通過Sephadex G-50凝膠色譜，用75%乙醇洗脫，從乳清蛋白的胰蛋白酶水解物中分離出分子量范圍為1.9 KDa～3.1 KDa降膽固醇肽。

2.3 離子交換色譜

離子交換色譜(ion exchange chromatography，IEC)是利用離子交換樹脂對各種離子的親和力不同，從而使能離子化的化合物得到分離的方法。目前在蛋白質(zhì)或多肽的分離純化中，離子交換色譜是應(yīng)用最廣泛的方法之一，占75%[15]。離子交換色譜主要分為陽離子交換柱和陰離子交換柱兩大類型，根據(jù)蛋白或多肽所帶電荷的差異并盡量保持其活性選擇柱型。影響離子交換的因素有pH值、溫度、洗脫劑、離子強度等。在離子交換色譜純化多肽的試驗中，柱填料的選擇對于分離效果影響很大，查恩輝[23]比較了不同柱填料對梅花鹿茸多肽的分離效果，其中CM-Sepharose Fast Flow離子交換柱與Q-Sepharose Fast Flow離子交換柱，分離速度較快，柱料再生較為簡単，只需用3個柱床體積的高濃度鹽溶液沖洗即可。Geng等[24]用聚乙二醇沉淀雞蛋清，將其分成四個組分(A～D)，除卵霉素(沉淀物A)外，其他三個組分都通過Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析進一步純化。分別從沉淀物B、沉淀物C和上清液D中純化得到溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵清蛋白和卵黃蛋白，HPLC測定純度分別為91.84%、94.55%、96.45%和88.16%。Wang等[25]通過DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱純化兔和豚鼠血清中的免疫球蛋白G，用Tris-HCl緩沖液作為洗脫劑，考察了pH7.0和pH8.5的Tris-HCl緩沖液對免疫球蛋白G回收率和純度的影響，發(fā)現(xiàn)pH8.5的Tris-HCl緩沖液較好。

2.4 親和色譜

親和色譜(affinity chromatography)是利用生物分子間專一的親和力進行分離的一種色譜技術(shù)。蛋白多肽等生物大分子能和某些相對應(yīng)的分子專一而可逆地結(jié)合，可以用于對生物分子的分離純化。由于親和力具有高度的專一性，使得親和色譜分辨率很高，是分離生物大分子的一種理想色譜方法。按照特異親和作用分為抗原-抗體、酶-底物、凝集素-多糖、寡核苷酸與其互補鏈等[26]，對多肽類物質(zhì)分離目前主要應(yīng)用其單抗或生物模擬配基與其親和。Xin等[27]用親和色譜分離牛肺抑肽酶，通過SDS-PAGE電泳分析和凝膠過濾層析表明該蛋白為單一多肽，純度分別約為97%和100%。Lan等[28]利用磁性親和分離法快速純化和表征蜥蜴魚蛋白水解物中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽，并通過反相高效液相色譜進一步純化，得到活性最高的ACE抑制肽，其氨基酸序列為Gly-Met-Lys-Cys-Ala-Phe。

3 膜分離

膜分離技術(shù)(membrane separation technique)是借助一定孔徑的高分子薄膜，通過在膜兩側(cè)施加一個推動力，將不同大小、性狀和特性的物質(zhì)分離的技術(shù)。根據(jù)驅(qū)動方式和分離原理，膜分離可分為微濾、超濾、反滲透、電滲析等。微濾能截留直徑0.2～2 μm的顆粒，可除去淀粉、細菌、霉菌、乳化油等雜質(zhì)；超濾截留直徑0.02～0.22 μm的顆粒，相當于分子量1000～5×105Da，可濾出蛋白質(zhì)、脂肪、色素等物質(zhì)；反滲透膜孔徑小至納米級，在一定壓力下，水分子可以通過反滲透膜，而水中的無機鹽、重金屬離子、有機物、膠體、細菌、病毒等無法通過反滲透膜；電滲析主要用于水溶液中除去電解質(zhì)、電解質(zhì)與非電解質(zhì)的分離和膜電解等[7]。

李水清等[29]在鱉甲多肽的膜分離工藝的研究中，先采用0.3 μm微濾膜預(yù)處理鱉甲多肽提取液，再依次通過截留相對分子質(zhì)量20 KDa和8 KDa的超濾膜，經(jīng)過多級超濾，鱉甲多肽的分離效果較為理想。Lin等[30]采用截留相對分子質(zhì)量為5 KDa和1 KDa的超濾膜對蛤蜊肌肉水解產(chǎn)物進行分離，得到兩種氨基酸序列為Val-Lys-Pro和Val-Lys-Lys的降膽固醇肽。Zhang等[31]用截留相對分子質(zhì)量為10 KDa,5 KDa和3 KDa的超濾膜對大黃魚蛋白水解產(chǎn)物進行分級處理，獲得抗氧化活性最高的組分后再用其他分離手段進一步純化，得到兩種抗氧化肽，其氨基酸序列為Ser-Arg-Cys-His-Val和Pro-Glu-His-Trp。

4 電泳法

電泳(phoresis)是帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。1809年俄國的物理學(xué)家Pence首先發(fā)現(xiàn)了電泳現(xiàn)象，直到1937年瑞典科學(xué)家Tiselius設(shè)計出世界上第一臺自由電泳儀，才作為一種分析方法不斷發(fā)展和應(yīng)用。根據(jù)電泳的分離特點，電泳法分為自由界面電泳、區(qū)帶電泳、高效毛細管電泳。其中，區(qū)帶電泳是目前應(yīng)用最廣泛的電泳技術(shù)。在蛋白多肽的分析研究中，應(yīng)用最廣泛的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)就是屬于區(qū)帶電泳。用SDS-PAGE既能測定蛋白多肽的分子質(zhì)量，又可以用于蛋白多肽混合組分的分離和亞組分的分析。

目前，電泳法主要應(yīng)用在測定蛋白多肽的分子質(zhì)量。蘇翔等[32]用SDS-PAGE對螞蟻抗菌肽進行相對分子質(zhì)量測定，SDS-PAGE電泳結(jié)果為單一條帶，其分子質(zhì)量為3.746 KDa。Cheema等[33]用瓊脂糖凝膠親和層析從雜交公牛的精漿中純化得到肝素結(jié)合蛋白，通過SDS-PAGE分析鑒定出14個條帶，分子量范圍為14～150 KDa。但是SDS-PAGE對于小分子量尤其是10 KDa以下的蛋白質(zhì)分辨率較低，在分離膠中添加甘油或尿素的Tricine-SDS-PAGE能檢測小分子多肽的分子量，該方法能夠消除由于多肽分子與標準蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的不同帶來的誤差[34]。高世杰等[35]用SDS-PAGE對全蝎蛋白進行分離，所得的結(jié)果不理想，僅可獲得7條譜帶，且條帶分辨率低。采用Tricine-SDS-PAGE，利用三層不連續(xù)凝膠系統(tǒng)，可以得到11條分辨率較高的電泳譜帶，而利用兩層不連續(xù)系統(tǒng)時則分離效果稍差，只能得到9條較清晰譜帶，因此對于小分子量蛋白的分離應(yīng)盡量使用三層膠系統(tǒng)。SDS-PAGE測定許多高分子量蛋白質(zhì)(MW﹥100 KDa)時分辨率差，故測定高分子量蛋白質(zhì)應(yīng)采用能提高分辨率的脈沖SDS-PAGE電泳[36]。

表1 動物源活性蛋白多肽分離純化方法總結(jié)

5 多方法聯(lián)用

由表1可看出不同方法各有優(yōu)缺點和所適用的范圍，對于動物蛋白多肽的分離純化，要根據(jù)樣品的性質(zhì)來選擇合適的方法，而且只用一種方法是很難實現(xiàn)的，大多數(shù)都要采用兩種或兩種以上方法聯(lián)用。王心龍等[3]采用MCI gel CHP 20P柱、Sephadex LH-20凝膠柱、制備型HPLC和半制備型HPLC等色譜手段，從美洲大蠊中分離出14個環(huán)二肽類化合物。Nimalaratne等[39]采用超濾、陽離子交換色譜和反相高效液相色譜從蛋清水解產(chǎn)物中分離純化到16種抗氧化肽，并用LC-MS/MS測定其氨基酸序列。胡春玲等[40]通過超濾、葡聚糖凝膠Sephadex G-15及高效液相色譜法對鱉甲水解產(chǎn)物進行分離，得到一個純化的寡肽(CTEPH-1:Asn-Pro-Asn-Pro-Thr)。Matsumoto等[41]對牡蠣消化性水解產(chǎn)物A-3中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的分離純化時，先用SP-Sephadex C-25和Toyopearl HW-40凝膠色譜分離，然后再通過三步高效液相色譜法，分離出血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽。Huang等[42]通過DEAE陰離子交換色譜，Sephadex G-25凝膠過濾和反相高效液相色譜從乳清蛋白水解物中分離鈣結(jié)合肽，在色譜/電噴霧電離(LC/ESI)串聯(lián)質(zhì)譜上鑒定出該純化肽的分子量為20 402 Da。

6 總結(jié)與展望

動物源蛋白多肽類物質(zhì)，分子量較大，極性較強且容易變解，采用傳統(tǒng)的植化分離方法很難得到目標物質(zhì)，故需結(jié)合物質(zhì)組分的特殊性質(zhì)來選擇合適的分離手段。對于動物蛋白多肽的分離純化，目前為止沒有一種萬能的方法，只能根據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)和具體的實驗條件來選擇適合的分離方法。沉淀分級和膜分離主要用于動物蛋白多肽的初級分離，但是蛋白多肽沉淀分級的條件較難控制；而膜分離技術(shù)在分離過程中無相變或化學(xué)變化，并且具有高選擇性、低能耗、適應(yīng)性強、操作條件要求不高、環(huán)保等優(yōu)點，對性質(zhì)相似組分可以達到很好的分離效果[43,44]。色譜法是蛋白多肽分離純化中的高效分離方法，也是目前動物蛋白多肽分離純化的主要技術(shù)手段，但是不同動物蛋白多肽分離時所需的條件又各不相同，尋找分離條件耗時長，導(dǎo)致效率低；高效液相色譜法具有分離度高、分離能力強及分離速度快等優(yōu)點，因此在分離動物蛋白多肽時得到廣泛應(yīng)用。電泳主要作為一種分析方法用于測定蛋白多肽的分子質(zhì)量，而作為制備電泳來分離蛋白多肽混合組分還應(yīng)用較少。因此，對于大多數(shù)動物源活性蛋白多肽的分離純化，高效、經(jīng)濟、適應(yīng)性強的多方法聯(lián)用將會得到更加廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及國家對中醫(yī)藥發(fā)展的重視，動物源活性蛋白多肽的醫(yī)療保健價值將會不斷被發(fā)掘。對于動物源活性蛋白多肽的分離純化方法也會趨向于更加安全、高效、經(jīng)濟、環(huán)保的方向發(fā)展。