羥基酪醇抑菌活性及抑菌穩(wěn)定性研究

羅思源，楊秋瑜，李 敏，譚程月，蔣雪蓮，賈利平，杜彥霖，丁春邦

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，雅安，625014

羥基酪醇(hydroxytyrosol)，化學(xué)名為3，4-二羥基苯乙醇，化學(xué)式為C8H10O3，屬于酚類化合物，廣泛存在于橄欖科橄欖屬植物的枝葉和果實中。在油橄欖葉和橄欖油中，少量的羥基酪醇以游離形式存在，而大部分與葡萄糖和橄欖酸相結(jié)合而形成橄欖苦苷。在酸性或者堿性環(huán)境下，橄欖苦苷易降解產(chǎn)生羥基酪醇[1]。羥基酪醇具有多種生物活性，Wani等[2]發(fā)現(xiàn)羥基酪醇可以顯著地清除體外自由基，并且能夠保護(hù)細(xì)胞，具有預(yù)防心腦血管疾病的作用[3,4]。羥基酪醇結(jié)合形成的橄欖苦苷被證實具有一定的抑菌活性，吳遵秋等人發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷對大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.025 mg/mL[5]。也有研究指出多酚類化合物也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，從香菜、茶樹花和女貞等植物中提取出的多酚類化合物均表現(xiàn)出顯著的抑菌作用[6-8]。劉靜等人發(fā)現(xiàn)紫甘藍(lán)多酚對醋酸菌的抑菌作用較強(qiáng)，而對大腸桿菌的抑制作用較弱[9]。但關(guān)于羥基酪醇抑菌的報道較少。

因此，本研究采用試管半倍稀釋法來測定羥基酪醇對大腸桿菌(Escherichiacoli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)共四種供試菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，探究了羥基酪醇對四種供試菌生長情況和細(xì)胞膜完整性的影響，并探討了其在鹽和蔗糖兩種介質(zhì)中抑菌活性的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羥基酪醇購于陜西米爾康生物科技有限公司，純度為70%。

大腸桿菌(Escherichiacoli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)植物學(xué)實驗室保存。

牛血清白蛋白和考馬斯亮藍(lán)G-250(北京博奧拓達(dá)科技有限公司)；蛋白胨和酵母提取物(英國OXOID 公司)；瓊脂粉、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鈉等(成都市科龍化工試劑廠)，所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BT-124S型電子天平(德國Sartorius公司)，RM-220實驗室超純水機(jī)(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)，YYQ-SG41-280高壓蒸汽滅菌鍋(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司)，SW-CJ-2FD超凈工作臺(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)，Spectra Max M2酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)，DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)，THZ-100恒溫培養(yǎng)床(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測定

采用試管半倍稀釋法[10]測定羥基酪醇的MIC。羥基酪醇溶解于LB液體培養(yǎng)基，配制為10 mg/mL的母液。根據(jù)試管半倍稀釋法稀釋成相應(yīng)濃度，向每管中加入50 μL菌濃度為106CFU/mL的菌懸液，另取兩個試管分別作為陰性對照和空白對照。放于37 ℃恒溫?fù)u床上，震蕩(180 rpm)24 h，對比陰性對照和空白對照管，觀察渾濁程度，第一個不出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象的試管所對應(yīng)的濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。從所有不渾濁的試管中吸取100 μL液體均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，菌落數(shù)小于5個的平板所對應(yīng)的濃度即為最小殺菌濃度(MBC)。

1.3.2 生長曲線測定

根據(jù)Liu等[11]的方法測定四種供試菌的生長曲線。將四種供試菌調(diào)整濃度為2.5×106CFU/mL，分別取1.6 mL菌液于試管中，加入用LB液體溶解的羥基酪醇，使其終濃度為0、0.5、1倍MIC。置于37 ℃恒溫?fù)u床中，200 rpm震蕩培養(yǎng)，每間隔1 h吸取菌液于600 nm處測定吸光值，連續(xù)測定12 h。以吸光值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，繪制四種供試菌的生長曲線。

1.3.3 細(xì)胞膜完整性檢測

1.3.3.1 核酸泄漏測定

根據(jù)Lv等[12]方法測定核酸泄露情況。四種供試菌用0.1 M PBS(pH=7.4)清洗2遍后調(diào)整濃度為2×108CFU/mL，取菌液0.5 mL于試管中，加入用PBS(pH=7.4)溶解的羥基酪醇，使其終濃度為0、0.5、1 MIC。放于37 ℃恒溫?fù)u床上，250 rpm震蕩4 h，12 000 rpm離心5 min，取上清液在260 nm處測定吸光值。

1.3.3.2 可溶性蛋白泄漏測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：配置牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照Liu等[13]方法配置考馬斯亮藍(lán)G-250顯色液，取無菌試管，加入0.1 mL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液和0.5 mL 顯色液，震蕩混勻后加入1 mL蒸餾水，混勻，靜置2 min，595 nm處測定吸光值，以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品可溶性蛋白測定[14]：取離心后的上清液0.1 mL，加入0.5 mL顯色液，震蕩混勻后加入1 mL蒸餾水，混勻，靜置2 min，595 nm處測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算可溶性蛋白含量。

1.3.4 抑菌穩(wěn)定性測定

1.3.4.1 鹽濃度對抑菌穩(wěn)定性的影響

羥基酪醇用LB液體培養(yǎng)基溶解，并加入不同濃度的NaCl，取1.6 mL樣液和1.6 mL菌液，使菌終濃度為1×106CFU/mL，羥基酪醇的終濃度為0.5 MIC和1 MIC，NaCl的終濃度為0.5%、1.0%、1.5%和2.0%，放于恒溫?fù)u床(37 ℃)中200 rpm震蕩12 h，每隔1 h在無菌環(huán)境中吸取樣液在600 nm處測定吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)繪制曲線圖。

1.3.4.2 蔗糖濃度對抑菌穩(wěn)定性的影響

用LB液體培養(yǎng)基溶解羥基酪醇，并加入不同濃度的蔗糖(C12H22O11)，取1.6 mL樣液和1.6 mL菌液，使菌終濃度為1×106CFU/mL，羥基酪醇的終濃度為0.5 MIC和1 MIC，C12H22O11的終濃度為0.05%、0.10%、0.15%和0.20%，放于恒溫?fù)u床(37 ℃)中200 rpm震蕩12 h，每隔1 h在無菌環(huán)境中吸取樣液在600 nm處測定吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)繪制曲線圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad prism 6.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析并制圖，所有實驗均重復(fù)三次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)

從表1中可以看出，羥基酪醇對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果最好， MIC均為0.625 mg/mL，MBC均為1.250 mg/mL；對銅綠假單胞桿菌的抑制效果次之，MIC為1.250 mg/mL，MBC為2.500 mg/mL；而對枯草芽孢桿菌的抑制效果相對較弱，MIC為2.500 mg/mL，MBC為5.000 mg/mL。

羥基酪醇屬于多酚類化合物，多酚化合物具有較強(qiáng)的抑菌活性。李應(yīng)洪等[15]發(fā)現(xiàn)樟樹葉多酚對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC相同，為1.250 mg/mL，王明華等[16,17]也發(fā)現(xiàn)玉米須多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有一定的抑制作用，申凱等[18]發(fā)現(xiàn)菱莖多酚對大腸桿菌的MIC為6.250 mg/mL。相比之下，本研究中羥基酪醇對四種供試菌的MIC小于其他的研究結(jié)果。因此本研究結(jié)果表明，羥基酪醇的抑菌活性強(qiáng)于總多酚的抑菌活性。

表1 羥基酪醇對四種供試菌的MIC和MBC測定結(jié)果

注：“+”表示長菌，“-”表示無菌生長。

Note:“+” means bacteria grows,“-” means no bacteria grows.

2.2 羥基酪醇對細(xì)菌生長曲線的影響

從圖1中可以看出羥基酪醇對四種供試菌的生長均有一定的抑制效果，且隨著濃度的增大抑制效果越明顯。在12 h內(nèi)，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌快速繁殖，成對數(shù)生長。加入1 MIC的羥基酪醇很明顯抑制了細(xì)菌的生長，而低濃度的羥基酪醇對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長無顯著抑制作用，對銅綠假單胞桿菌的生長有一定的抑制作用?？莶菅挎邨U菌在7小時后開始成對數(shù)生長，而0.5 MIC和1 MIC的羥基酪醇均在對數(shù)期抑制該菌的生長。結(jié)果表明羥基酪醇抑制細(xì)菌生長主要是在對數(shù)生長期起抑制作用。

圖1 羥基酪醇對四種菌生長狀況的影響Fig.1 The effect of hydroxytyrosol on the four test-supplied strains’ growth 注：(A)大腸桿菌;(B)金黃色葡萄球菌;(C)銅綠假單胞桿菌;(D)枯草芽孢桿菌Note:(A) E.coli;(B) S.aureus;(C) P.aeruginosa;(D) B.subtilis

2.3 羥基酪醇對細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的影響

細(xì)胞膜作為防止胞外物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的一個重要屏障，保障了細(xì)胞內(nèi)相對穩(wěn)定的狀態(tài)，且能選擇和調(diào)節(jié)物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞，維持整個細(xì)胞內(nèi)各個生理反應(yīng)的正常進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變時，細(xì)胞內(nèi)的一些對細(xì)胞生存必不可少的內(nèi)容物如核酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生泄露，細(xì)胞的生存能力逐漸減弱，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[14]。

從圖2中可以看到，與對照組相比，低濃度的羥基酪醇對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌的核酸泄露無顯著影響(P> 0.05)，而高濃度卻顯著提高這三種菌核酸泄漏量(P< 0.001)。由圖1也可以看出低濃度的羥基酪醇對這三種菌的生長抑制并不明顯，而高濃度卻顯著抑制菌的生長。在低濃度下，羥基酪醇就能夠顯著提高枯草芽孢桿菌的核酸泄漏量(P< 0.05)，這與圖1中低濃度的羥基酪醇就能顯著抑制枯草芽孢桿菌的生長相符合。

從圖3可以看出高濃度的羥基酪醇明顯的促進(jìn)四種供試菌可溶性蛋白的泄漏，在低濃度下僅枯草芽孢桿菌的可溶性蛋白泄漏與對照組有顯著差異(P< 0.05)。從圖2可以看出，低濃度的羥基酪醇僅顯著導(dǎo)致枯草芽孢桿菌體內(nèi)核酸的泄露，因此，圖3的結(jié)果與圖2的結(jié)果相符合。菌體內(nèi)可溶性蛋白和核酸的大量泄露往往是由于細(xì)胞屏障—細(xì)胞膜受損而導(dǎo)致的。黃詩琪等[19]發(fā)現(xiàn)經(jīng)客家黃酒多酚處理后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜完整性被破壞，體內(nèi)蛋白質(zhì)泄露顯著。錢麗紅等[20]也發(fā)現(xiàn)茶多酚會破壞金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致胞內(nèi)內(nèi)容物大量泄露。從圖2和圖3可以看出經(jīng)羥基酪醇處理后，細(xì)菌體內(nèi)的核酸和可溶性蛋白質(zhì)大量外泄，表明羥基酪醇主要是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性來抑制細(xì)菌生長。

2.4 鹽濃度對抑菌穩(wěn)定性的影響

在食品添加劑中常常加入一定濃度的鹽，高濃度的鹽引起高滲透壓，抑制細(xì)菌的生長。大腸桿菌在0～3.0%的NaCl濃度中可以正常生長，在0～5.0% NaCl濃度下枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌能夠正常生長，對于大多數(shù)微生物而言，0～2.0% NaCl濃度是其最適宜生長的環(huán)境[21]。因此，本實驗探究在0.5%～2.0%的NaCl濃度下，羥基酪醇對四種供試菌的抑制作用是否有影響。

從圖4可以看出，在含有1.0% NaCl的培養(yǎng)基中，低、高濃度的羥基酪醇對大腸桿菌的抑菌活性穩(wěn)定(圖4 A、圖4 B)；低濃度的羥基酪醇在2.0% NaCl濃度下對金黃色葡萄球菌的抑菌活性穩(wěn)定(圖4 C)，但在1.0% NaCl介質(zhì)中，經(jīng)高濃度羥基酪醇處理后，細(xì)菌的生長和對照組無差異(圖4 D)，因此抑菌穩(wěn)定性被破壞。由圖4 E、圖4 F可以看出，在2.0% NaCl介質(zhì)下，經(jīng)低濃度和高濃度的羥基酪醇處理后，細(xì)菌的生長與對照相比更弱，因此在此鹽濃度下，低、高濃度的羥基酪醇對銅綠假單胞桿菌的抑菌活性穩(wěn)定；而在不同濃度的NaCl下，低、高濃度的羥基酪醇對枯草芽孢桿菌的抑菌活性均未受到改變，仍對枯草芽孢桿菌的生長有顯著抑制作用。因此在NaCl介質(zhì)中，羥基酪醇對枯草芽孢桿菌的抑菌活性均穩(wěn)定。

圖2 四種供試菌核酸泄露情況Fig.2 The effect of hydroxytyrosol on the four test-supplied strains’ growth注：(A)大腸桿菌;(B)金黃色葡萄球菌;(C)銅綠假單胞桿菌;(D)枯草芽孢桿菌；*表示P <0.05;***表示P <0.001。Note:(A) E.coli;(B) S.aureus;(C) P.aeruginosa;(D) B.subtilis.“*” means P < 0.05;“***” means P < 0.001.

圖3 四種供試菌可溶性蛋白泄露情況Fig.3 The soluble protein leakage of the four test-supplied strains’ growth注：(A)大腸桿菌;(B)金黃色葡萄球菌;(C)銅綠假單胞桿菌;(D)枯草芽孢桿菌；*表示P <0.05;***表示P <0.001。Note:(A) E.coli;(B) S.aureus;(C) P.aeruginosa;(D) B.subtilis.“*” means P < 0.05;“***” means P < 0.001.

圖4 不同NaCl濃度下四種供試菌的生長情況Fig.4 The effect of different concentration NaCl on the four test-supplied strains’ growth.注：大腸桿菌(A)0.5 MIC;(B)1 MIC；金黃色葡萄球菌(C)0.5 MIC;(D)1 MIC；銅綠假單胞桿菌(E)0.5 MIC;(F)1 MIC；枯草芽孢桿菌(G)0.5 MIC;(H)1 MIC。Note:E.coli (A) 0.5 MIC;(B) 1 MIC；S.aureus (C) 0.5 MIC;(D) 1 MIC; P.aeruginosa (E) 0.5 MIC;(F) 1 MIC;B.subtilis (G) 0.5 MIC;(H) 1 MIC.

2.5 蔗糖濃度對抑菌穩(wěn)定性的影響

在食品中常常加入一定濃度的糖來調(diào)節(jié)風(fēng)味，在一定程度上，這類糖成了細(xì)菌生長的碳源。在食品中常常加入一些抑菌物質(zhì)來實現(xiàn)防腐效果，而抑菌物質(zhì)的抑菌效果又受到介質(zhì)如pH、鹽和糖等的影響[22]，因此為了探究蔗糖介質(zhì)對羥基酪醇抑菌穩(wěn)定性影響，本實驗將羥基酪醇處于不同濃度的蔗糖介質(zhì)下，通過供試菌的生長曲線來探究其抑菌穩(wěn)定性。

從圖5可以看出在低、高濃度羥基酪醇下，加入不同濃度的C12H22O11，實驗組中細(xì)菌的生長均超過對照組，所以羥基酪醇對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌的抑菌活性遭到破壞。加入不同濃度的C12H22O11會減弱羥基酪醇對枯草芽孢桿菌的抑制效果。加入低濃度的C12H22O11，高濃度的羥基酪醇仍然對枯草芽孢桿菌有明顯的抑制作用；但加入高濃度的C12H22O11(0.20%)會破壞羥基酪醇對枯草芽孢桿菌的抑菌效果。

高濃度的糖會抑制細(xì)菌生長，而本實驗中，采用的蔗糖濃度為0.05%～0.20%之間，相對而言屬于低濃度，不會對細(xì)菌的生長有抑制作用。在此濃度下實驗結(jié)果表明羥基酪醇的抑菌穩(wěn)定性被破壞，可能是由于羥基酪醇破壞了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，而及時補(bǔ)充碳源，讓細(xì)菌快速合成所被破壞掉的成分，這樣就破壞了羥基酪醇的抑菌能力。因此羥基酪醇不適合用于作為低糖濃度下的防腐劑。相關(guān)原因需要進(jìn)一步研究探討。

3 結(jié)論

大多數(shù)多酚類化合物具有抑菌活性，茶多酚[20]、黃酒多酚[19]、玉米須多酚[17]等。在抑菌活性研究中，多以多酚提取物為主要研究對象進(jìn)行研究，而少有文獻(xiàn)對組成多酚的單體進(jìn)行單獨(dú)抑菌活性研究。李應(yīng)洪等[15]發(fā)現(xiàn)樟樹葉多酚對大腸桿菌的MIC為1.250 mg/mL，而本研究中羥基酪醇對大腸桿菌的MIC為0.625 mg/mL；申凱等[18]發(fā)現(xiàn)菱莖多酚對金黃色葡萄球菌的MIC為6.250 mg/mL，而羥基酪醇對金黃色葡萄球菌的MIC為0.625 mg/mL；張?zhí)砭盏热薣23]發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓葉多酚對枯草芽孢桿菌的MIC為9.300 mg/mL，而羥基酪醇對枯草芽孢桿菌的MIC為2.500 mg/mL。因此可以得出羥基酪醇的抑菌活性比多酚提取物的抑菌活性較強(qiáng)，可以作為一種新型的防腐劑。

圖5 不同C12H22O11濃度下四種供試菌的生長情況Fig.5 The effect of different concentration C12H22O11 on the four test-supplied strains’ growth注：大腸桿菌(A)0.5 MIC;(B)1 MIC；金黃色葡萄球菌(C)0.5 MIC;(D)1 MIC；銅綠假單胞桿菌(E)0.5 MIC;(F)1 MIC；枯草芽孢桿菌(G)0.5 MIC;(H)1 MIC。Note:E.coli (A) 0.5 MIC;(B)1 MIC；S.aureus (C) 0.5 MIC;(D) 1 MIC;P.aeruginosa(E) 0.5 MIC;(F) 1 MIC;B.subtilis (G) 0.5 MIC;(H) 1 MIC.

本實驗結(jié)果表明，羥基酪醇具有較強(qiáng)的抑菌效果，對四種供試菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌和枯草芽孢桿菌的MIC分別為0.625、0.625、1.250、2.500 mg/mL，MBC分別為1.250、1.250、2.500、5.000 mg/mL。羥基酪醇主要在細(xì)菌對數(shù)生長期抑制其生長。經(jīng)羥基酪醇處理后，菌體泄漏大量核酸和可溶性蛋白，初步推測羥基酪醇抑菌的機(jī)理可能是破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。羥基酪醇在1.0% NaCl介質(zhì)中抑制大腸桿菌的抑菌活性穩(wěn)定；低濃度的羥基酪醇在2.0% NaCl下對金黃色葡萄球菌的抑菌活性穩(wěn)定，高濃度的羥基酪醇在0.5%、1.5%和2.0% NaCl下抑菌活性穩(wěn)定；2.0% NaCl濃度下，羥基酪醇對銅綠假單胞桿菌抑菌活性穩(wěn)定；在不同鹽濃度下羥基酪醇對枯草芽孢桿菌的抑菌活性均穩(wěn)定。而在不同糖溶液中，羥基酪醇對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌的抑制效果被破壞，對枯草芽孢桿菌的抑制效果減弱，因此羥基酪醇在糖介質(zhì)中抑菌活性不穩(wěn)定。