六味地黃膠囊大孔吸附樹(shù)脂純化工藝的優(yōu)化

吳 萍， 高 陸， 田淋淋， 任 晶， 白 冰， 徐 建?

（1. 吉林修正藥業(yè)新藥開(kāi)發(fā)有限公司， 吉林省中藥標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 吉林 長(zhǎng)春 130103；2. 修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司， 吉林 通化 134100）

六味地黃方出自錢(qián)乙《小兒藥證直訣》， 由熟地黃、 牡丹皮、 酒萸肉、 山藥、 澤瀉、 茯苓組成，用于腎陰虧損、 頭暈耳鳴、 腰膝酸軟、 骨蒸潮熱、盜汗遺精、 消渴[1］， 六味地黃膠囊是其精制產(chǎn)品，服用量小， 廣泛應(yīng)用于臨床。 在中藥生產(chǎn)中， 工藝參數(shù)及生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)量控制對(duì)制劑的有效性、 均一性、 穩(wěn)定性有著較大影響， 但目前關(guān)于六味地黃膠囊的研究大多涉及質(zhì)量控制， 而鮮有工藝研究及生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)量控制的報(bào)道。 因此， 本實(shí)驗(yàn)以六味地黃膠囊主要藥效成分莫諾苷、 馬錢(qián)苷、 芍藥苷[2-3］為評(píng)價(jià)指標(biāo)， 對(duì)大孔吸附樹(shù)脂純化工藝進(jìn)行優(yōu)化[4-6］， 以期保證該制劑均一穩(wěn)定， 質(zhì)量可靠。

1 材料

1.1 儀器 Ultimae-3000 雙三元高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司）； AE240 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； KQ-300DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 芍藥苷（批號(hào)110736-201741）、 莫諾苷（批號(hào)111998-201602）、 馬錢(qián)苷（批號(hào)111640-201605） 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、 磷酸為色譜純； 其他試劑均為分析純； 水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含有量測(cè)定[7-12］

2.1.1 色譜條件 Kromasil-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流 動(dòng) 相 甲 醇-0.1% 磷 酸（20 ∶80）； 檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm； 柱溫30 ℃； 體積流量1.0 mL／min； 進(jìn)樣量10 μL。 色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取莫諾苷、 馬錢(qián)苷、 芍藥苷對(duì)照品適量， 甲醇制成每l mL 分別含50、 30、 30 μg 上述成分的溶液， 即得。

2.1.3 供試品溶液制備 精密吸取供試液10 mL，置于具塞錐形瓶中蒸干， 精密加入25 mL 甲醇， 稱定質(zhì)量， 超聲（250 W、 50 kHz） 30 min， 放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻， 濾過(guò)， 取續(xù)濾液，即得。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液2、5、 8、 10、 15 μL， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。 以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）， 進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸， 得到莫諾苷、 馬錢(qián)苷、 芍藥苷回歸方程分別為Y=16.872X＋0.068 （r=1.000 0）、Y=26.133X＋0.352 9 （r=1.000 0）、 Y=26.611X＋1.271 5 （r=0.980 0）， 分別在0.118 2 ～0.886 5、0.442 6～3.319 5、 0.051 ～0.382 5 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 大孔吸附樹(shù)脂純化工藝優(yōu)化

2.2.1 上樣液前處理 稱取酒萸肉（176 g） 醇提后藥渣、 牡丹皮（132 g） 水蒸氣蒸餾后水溶液和藥渣、 熟地黃352 g、 澤瀉132 g、 山藥176 g， 加水煎煮3 次， 加水量依次為6、 4、 4 倍量， 每次1 h， 濾過(guò)， 濾液合并[1］， 濃縮至7 000 m L （每1 mL藥液含生藥材0.14 g）， 莫諾苷、 馬錢(qián)苷、 芍藥苷含有量分別為0.093、 0.057、 0.139 mg／mL。

2.2.2 泄漏曲線繪制 取濕D101 大孔吸附樹(shù)脂15 g， 裝入層析柱（內(nèi)徑1.5 cm、 高20 cm） 中，徑高比1 ∶4。 另取“2.2.1” 項(xiàng)下水煎液200 mL上樣， 體積流量1 mL／min， 每20 mL 收集1 份，共10 份， 測(cè)定每份泄漏液中芍藥苷、 莫諾苷、 馬錢(qián)苷含有量， 以泄漏量為縱坐標(biāo)， 上樣量為橫坐標(biāo)繪制泄漏曲線， 結(jié)果見(jiàn)圖2。 由圖可知， 上樣60 mL時(shí)莫諾苷開(kāi)始泄漏， 80 mL 時(shí)其他2 種成分也開(kāi)始泄漏。

圖2 各成分泄漏曲線Fig.2 Leakage curves for various constituents

表1 藥液-樹(shù)脂用量比例考察結(jié)果Tab.1 Results of drug liquid-resin consumption ratio investigation

2.2.3 藥液-樹(shù)脂用量比例考察 取3 根相同型號(hào)的層析柱（內(nèi)徑1.5 cm， 高20 cm）， 按徑高比1 ∶4 裝 柱， 濕 樹(shù) 脂 量15 g， 上 樣 量 75、 60、45 mL， 即藥液-樹(shù)脂用量比例5 ∶1、 4 ∶1、 3 ∶1，上樣后純化水洗脫， 收集水洗液， 計(jì)算泄漏量和泄漏率， 結(jié)果見(jiàn)表1。 由表可知， 最佳藥液-樹(shù)脂用量比例為3 ∶1。

2.2.4 樹(shù)脂徑高比考察 取3 份濕樹(shù)脂， 每份15 g， 分別裝入不同型號(hào)樹(shù)脂柱中， 使徑高比為1 ∶3、 1 ∶4、 1 ∶5， 各取45 mL 藥液上樣， 純化水洗滌至流出液無(wú)色， 70%乙醇洗脫， 收集洗脫液，置于恒重的蒸發(fā)皿中蒸干， 測(cè)定固形物量及殘?jiān)心Z苷、 馬錢(qián)苷、 芍藥苷含有量， 計(jì)算收率， 公式為收率= （C1×V1／C2×V2） ×100%， 其中C1為洗脫液中莫諾苷／馬錢(qián)苷／芍藥苷含有量， V1為洗脫液體積， C2為水提濃縮液中莫諾苷／馬錢(qián)苷／芍藥苷含有量， V2為上樣液體積， 結(jié)果見(jiàn)表2。 由表可知， 最佳樹(shù)脂徑高比為1 ∶4。

表2 樹(shù)脂徑高比考察結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of resin diameter-height ratio investigation （n=3）

2.2.5 吸附體積流量考察 取3 份濕樹(shù)脂， 每份15 g， 分別裝入3 根相同型號(hào)的層析柱 （內(nèi)徑1.5 cm， 高20 cm） 中， 徑高比1 ∶4， 各取45 mL藥液上樣， 純化水洗滌至流出液無(wú)色， 70%乙醇洗脫， 收集洗脫液， 置于恒重蒸發(fā)皿中蒸干， 測(cè)定固形物量及殘?jiān)心Z苷、 馬錢(qián)苷、 芍藥苷含有量，按“2.2.4” 項(xiàng)下公式計(jì)算收率， 結(jié)果見(jiàn)表3。 由表可知， 最佳吸附體積流量為2 BV／h。

表3 吸附體積流量考察結(jié)果Tab.3 Results of adsorption volume flow rate investigation

2.2.6 洗脫體積流量考察 取3 份濕樹(shù)脂， 每份15 g， 分別裝入3 根相同型號(hào)的層析柱 （內(nèi)徑1.5 cm， 高20 cm） 中， 徑高比1 ∶4， 各取45 mL藥液上樣， 純化水洗滌至流出液無(wú)色， 70%乙醇洗脫， 洗脫體積流量1、 2、 3 BV／h， 收集洗脫液，置于恒重蒸發(fā)皿中蒸干， 測(cè)定固形物量及殘?jiān)心Z苷、 馬錢(qián)苷、 芍藥苷含有量， 按“2.2.4” 項(xiàng)下公式計(jì)算收率， 結(jié)果見(jiàn)表4。 由表可知， 最佳洗脫體積流量為2 BV／h。

2.2.7 洗脫劑用量考察 取3 份濕樹(shù)脂， 每份約15 g， 分別裝入3 根相同型號(hào)的層析柱（內(nèi)徑1.5 cm， 高20 cm） 中， 徑高比1 ∶4， 各取75 mL藥液上樣， 純化水洗滌至流出液無(wú)色， 3、 4、 5 BV 70%乙醇洗脫， 收集洗脫液， 置于恒重蒸發(fā)皿中蒸干， 測(cè)定固形物量及殘?jiān)心Z苷、 馬錢(qián)苷、 芍藥苷含有量， 按“2.2.4” 項(xiàng)下公式計(jì)算收率， 結(jié)果見(jiàn)表5。 由表可知， 最佳洗脫劑用量為5 BV。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按優(yōu)化后的大孔吸附樹(shù)脂純化條件進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)， 結(jié)果見(jiàn)表6。 由表可知， 3批純化物中固形物得率及莫諾苷、 馬錢(qián)苷、 芍藥苷含有量RSD 均小于3%， 收率與工藝研究結(jié)果一致， 表明該工藝穩(wěn)定可行。

表4 洗脫體積流量考察結(jié)果Tab.4 Results of elution volume flow rate investigation

表5 洗脫劑用量考察結(jié)果Tab.5 Results of eluent consumption investigation

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.6 Results of verification tests （n=3）

3 討論

中藥血清藥物化學(xué)研究表明， 六味地黃制劑經(jīng)口服吸收入血、 在血清中含有量相對(duì)較高的藥效成分主要為莫諾苷、 馬錢(qián)苷、 芍藥苷[2-3］， 故選擇三者作為檢測(cè)指標(biāo)。 本實(shí)驗(yàn)所采用的因素對(duì)大孔吸附樹(shù)脂分離純化效果均有較大影響[4-7］， 其中藥液-樹(shù)脂用量比例考察項(xiàng)下的藥液上樣量是依據(jù)泄漏曲線測(cè)定結(jié)果而設(shè)定。

另外， 本實(shí)驗(yàn)取濕D101 型大孔吸附樹(shù)脂反復(fù)上樣、 洗脫、 再生， 發(fā)現(xiàn)同一份樹(shù)脂再生后反復(fù)使用3 次， 莫諾苷、 芍藥苷吸附量與首次洗脫液相比下降30%時(shí)， 可確定為樹(shù)脂使用周期。

綜上所述， 優(yōu)化后的六味地黃膠囊大孔吸附樹(shù)脂純化工藝合理可行， 主要藥效成分收率穩(wěn)定， 可用于該制劑的生產(chǎn)。