潘璐佳， 萬海同， 陳俊奎， 諸佳珍， 何 昱

（浙江中醫(yī)藥大學， 浙江 杭州 310053）

腦血管疾病是當今危害中老年健康最嚴重的疾病之一， 其中87% 為缺血性。 近年來隨著我國人口老齡化加劇， 每年大約有300 萬人死于該疾病，極大危害了人類生命安全， 也給家庭和社會帶來了沉重負擔[1-2］。

神經(jīng)遞質(zhì)是在化學突觸傳遞中擔當信使的特定化學物質(zhì)[3］， 由神經(jīng)末梢分泌， 能作用于所支配神經(jīng)元或效應(yīng)細胞膜上的受體， 從而完成信息傳遞功能。 中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在2 類作為神經(jīng)遞質(zhì)的游離氨基酸， 即抑制性氨基酸， 如γ-氨基丁酸（GABA）、 甘氨酸（Gly） 等， 以及興奮性氨基酸， 如天門冬氨酸（Asp）、 谷氨酸（Glu） 等[4］， 對維持神經(jīng)系統(tǒng)的平衡起著關(guān)鍵的作用[5］， 當發(fā)生腦缺血時， 兩者平衡會遭到破壞， 進一步加重神經(jīng)細胞損傷， 故調(diào)節(jié)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)平衡已成為防治腦缺血的重要途徑之一[6］。

谷紅注射液是一種中西藥復方制劑， 臨床上常用于治療腦供血不足、 腦血栓、 腦栓塞等疾病， 療效確切[7］。 前期課題組已證實谷紅注射液中含有量最高的主要成分為乙酰谷酰胺和羥基紅花黃色素A， 兩者也是該制劑發(fā)揮藥效作用的代表性成分，其中前者是谷氨酰胺乙酰化衍生物， 其代謝途徑與谷氨酰胺類似， 能通過血腦屏障并最終分解為GABA 和Glu[8-9］， 具有促進氨基酸轉(zhuǎn)運、 改善神經(jīng)細胞代謝、 提高細胞活力、 改善腦功能的作用[10］；后者是紅花中水溶性成分的代表物質(zhì)， 具有顯著的抗凝血、 抗氧自由基、 抗興奮毒性神經(jīng)元死亡等心腦血管藥理作用[11］。 雖然目前研究已證明這2 種成分均具有神經(jīng)保護作用[12-13］， 但尚無關(guān)于谷紅注射液中兩者對腦缺血大鼠海馬區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)釋放協(xié)同作用的報道。 因此， 本實驗將通過微透析采樣技術(shù)結(jié)合高效液相-電化學檢測 （HPLCECD） 法， 探討谷紅注射液中乙酰谷酰胺和羥基紅花黃色素A 對腦缺血大鼠海馬區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)釋放的協(xié)同作用， 為后續(xù)該制劑抗腦缺血損傷作用機制的深入探討提供借鑒。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀， 配置Waters 2465 電化學檢測器（美國Waters 公司）；腦立體定位儀（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；MD1001 微透析裝置（美國BAS 公司）； 腦微透析套 管 （ MAB2／6／9.14 ）、 腦 微 透 析 探 針（MAB6.14.4， 截留分子量15 kDa， 膜長4 mm）（瑞典Microbiotech／SE AB 公司）； XS205DU 電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； Cascada Bio MK2 超純水儀（美國Pall 公司）。

1.2 試藥 谷紅注射液（批號20140706， 國藥準字H22026582， 通化谷紅制藥有限公司， HPLC法[14］測定其中乙酰谷酰胺、 羥基紅花黃色素A 含有量分別為30、 0.4 mg／mL）。 乙酰谷酰胺（批號D05A6H3， 中國食品藥品檢定研究院）； 羥基紅花黃色素A （批號Z01010BA13， 上海源葉生物科技有限公司）； Asp （批號KN1123CA13）、 Glu （批號 SLBC5771V）、 Gly （ 批 號 SM0315GA14 ）、GABA （批號BCBH1414V） 對照品、 鄰苯二甲醛（批號JM0326YA14） （美國Sigma 公司）。 甲醇、乙腈為色譜純； 其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 動物 雄性SD 大鼠， 體質(zhì)量280 ～320 g， 由上海斯萊克實驗動物有限公司提供， 動物生產(chǎn)許可證號SCXK （滬） 2012-0002。

1.4 溶液

1.4.1 人工腦脊液及鄰苯二甲醛衍生溶液 參照文獻[15］ 方法制備， 現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4.2 對照品溶液 精密稱取Asp、 Glu、 Gly、GABA 對照品適量， 人工腦脊液超聲溶解， 即得（質(zhì)量濃度為1 mg／mL）， 4 ℃下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流動相A 為12 g 磷酸二氫鈉、 0.177 4 g 氯化鈉、 0.014 g 乙二胺四乙酸， 溶于1 000 mL 超純水中， 調(diào)節(jié)pH 至5.17，流動相B 為甲醇， 梯度洗脫（0 ～12 min， 96%A；12～14 min， 96% ～84% A； 14 ～29 min， 84% A；29～30 min， 84% ～96%A）； 體積流量0.6 mL／min；柱溫35 ℃； 電化學檢測電壓0.8 V， 檢測溫度35 ℃。 10 μL 樣品中加入10 μL 衍生劑， 渦旋混勻后進樣測定。

2.2 方法學考察

2.2.1 專屬性試驗 在“2.1” 項色譜條件下對微透析樣品進行檢測， 考察方法專屬性。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密吸取4 種氨基酸對照品溶液， 人工腦脊液倍比稀釋， 得到10、 25、 50、100、 250、 500、 1 000 ng／mL 系列標準溶液， 取10 μL， 與10 μL 衍生劑混勻， 靜置1 min 后在“2.1” 項色譜條件下進樣測定， 以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標（X）， 峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸。

2.2.3 精密度試驗 精密吸取1 000 ng／mL 對照品溶液， 在“2.1” 項色譜條件下當天測定5 次，計算日內(nèi)差異； 再隔天（第1、 3、 5、 7 天） 連續(xù)測定， 每天5 次， 計算日間差異。

2.2.4 加樣回收率試驗 精密吸取含有量已知的腦透析液5 份， 每份20 μL， 加入適量對照品溶液， 渦旋混勻， 取10 μL， 加入10 μL 衍生劑輕輕混勻， 靜置1 min 后在“2.1” 項色譜條件下進樣測定， 計算回收率。

2.3 分組 大鼠隨機分為模型組、 乙酰谷酰胺組（300 mg／kg）、 羥基紅花黃色素A 組（4 mg／kg）、谷紅注射液組（10 mL／kg）， 每組6 只， 給藥劑量均根據(jù)臨床用量， 并結(jié)合人和大鼠體表面積換算所得。

2.4 微透析手術(shù) 大鼠稱定質(zhì)量后， 腹腔注射10%水合氯醛（350 mg／kg） 麻醉， 固定于腦立體定位儀上， 暴露頂部， 去除骨膜， 用沾有生理鹽水的棉球擦拭頭骨面至骨面干凈暴露。 根據(jù)坐標定位于海 馬 區(qū) （AP ＋4.8 mm， ML ＋5 mm， DV-3 mm）， 植入套管， 牙科水泥固定， 室溫條件下恢復3～5 d， 精神狀態(tài)良好者可用于實驗。

2.5 模型建立及微透析樣品采集 麻醉已植入套管的大鼠， 植入腦部探針， 以1.5 μL／min 體積流量灌流人工腦脊液平衡2 h， 平衡后接3 份空白透析液作為自身對照。 Longa 法[16］建立改良型大腦中動脈局灶性栓塞模型， 鈍性分離大鼠頸總動脈、 頸內(nèi)動脈、 頸外動脈， 結(jié)扎頸總動脈、 頸外動脈近心端， 暫時夾閉頸內(nèi)動脈， 眼科剪在頸外動脈與頸內(nèi)動脈的分叉處作“V” 字型斜行切口， 插入線栓，松開動脈夾， 將線栓緩緩推入頸內(nèi)動脈， 有微小阻力時即止， 之后棉線固定線栓， 缺血1 h 后拔出線栓， 再灌注同時尾靜脈給藥， 給藥結(jié)束后收集樣品， 每20 min 1 次， 至300 min 時結(jié)束， 所得樣品轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存待測。 實驗結(jié)束后取出探針， 處死大鼠， 斷頭取腦， 驗證取樣部位。

2.6 探針回收率測定 將探針置入100 ng／mL 對照品溶液中， 以1.5 μL／min 體積流量灌流人工腦脊液， 收集體外透析液， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定， 計算探針回收率。

2.7 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以表示， 組間比較采用單因素方差分析。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 專屬性試驗 圖1 顯示， 4 種氨基酸的色譜峰與其他色譜峰能完全分離， 峰型良好， 無雜峰干擾， 表明分析條件可行。

3.2 線性關(guān)系考察 回歸方程分別為Asp Y=786.07X＋74.234 （r=0.998 9）、 Glu Y=732.88X-74.273 （r=0.999 5）、 Gly Y=3 309.3X ＋33.653（r=0.999 5）、 GABA Y=2 499.3X ＋81.009 （r=0.999 8）， 均在10 ～1 000 ng／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 精密度試驗 Asp、 Glu、 Gly、 GABA 日內(nèi)精密度RSD 分別為2.11%、 3.04%、 4.97%、 5.52%，日間精密度RSD 分別為2.96%、 3.27%、 5.78%、6.61%， 均小于10%， 表明該方法精密度良好。

3.4 加樣回收率試驗 Asp、 Glu、 Gly、 GABA 加樣回收率分別為 （99.85±2.01）%、 （101.25 ±2.26）%、 （102.15±3.15）%、 （98.63±3.46）%，均在95% ～105%范圍內(nèi)， 表明該方法回收率良好，符合實驗要求。

圖1 各成分HPLC-ECD 色譜圖Fig.1 HPLC-ECD chromatograms of various constituents

3.5 探針回收率 Asp、 Glu、 Gly、 GABA 探針回收率分別為31.5%、 36.4%、 33.2%、 35.8%。

3.6 腦缺血后氨基酸含有量變化 圖2 顯示， 腦缺血后4 種氨基酸含有量變化明顯， 各組大鼠腦海馬區(qū)其含有量均呈現(xiàn)升高趨勢。

3.7 對腦缺血大鼠海馬區(qū)4 種氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的影響 圖2 顯示， 給藥組在同一時間點Asp 含有量顯著低于模型組（P＜0.01）， 以谷紅注射液組更明顯（P＜0.01）； 各組海馬區(qū)Glu 含有量呈先升后降趨勢， 給藥組顯著低于模型組（P＜0.01）， 以乙酰谷酰胺組最高； Gly 含有量呈先升后降趨勢， 與模型組比較， 給藥組在不同時間點均可顯著抑制其過度釋放（P＜0.01）， 乙酰谷酰胺組在同一時間點其含有量顯著高于谷紅注射液組（P＜0.01）， 而羥基紅花黃色素A 組顯著降低（P＜0.01）； 與模型組比較， 給藥組在同一時間點均可顯著抑制GABA過度表達（P＜0.01）， 與羥基紅花黃色素A 組比較， 谷紅注射液組在同一時間點其含有量顯著升高（P＜0.01）， 而乙酰谷酰胺組與谷紅注射液組之間無顯著性差異（P＞0.05）。

3.8 對腦缺血大鼠海馬區(qū)Glu／GABA 比值的影響 圖3 顯示， 與模型組比較， 給藥組在不同時間點Glu／GABA 比值有所降低， 以谷紅注射液組在120 min時更明顯（P＜0.01）。

圖2 各組Asp （A）、 Glu （B）、 Gly （C）、 GABA（D） 含有量Fig.2 Asp （A）， Glu （B）， Gly （C） and GABA （D）contents in various groups

圖3 各組Glu／GABA 比值Fig.3 Glu／GABA ratios in various groups

4 討論

傳統(tǒng)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)分析大多采用斷頭取腦方式， 檢測神經(jīng)遞質(zhì)在腦組織勻漿中的含有量， 但其準確性和可靠性往往會被提取純化中的眾多因素所干擾[17］。 近年來， 微透析技術(shù)作為一種動態(tài)連續(xù)的取樣方法， 在動物神經(jīng)遞質(zhì)研究中的應(yīng)用已越來越受研究者青睞[18］， 該技術(shù)以透析原理為基礎(chǔ)，能在組織或細胞外液進行活體取樣， 而且不會對動物的正常生命活動造成影響， 同時還可連續(xù)監(jiān)測動物腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)變化[19］。 由于微透析探針半透膜只允許小分子物質(zhì)透過[20］， 蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)會被截留， 而且所得透析液可直接進液相檢測， 可避免了預處理過程中所帶來的誤差， 故本實驗采用該方法作為大鼠海馬區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的采樣方式。

腦缺血再灌注會造成神經(jīng)元變性壞死， 其重要原因之一是神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂， 作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)， 氨基酸在神經(jīng)元之間的信息傳遞中發(fā)揮重要作用[21］。 興奮性、 抑制性氨基酸含有量變化與腦損傷程度密切相關(guān)， 目前大多數(shù)學者認為， 腦缺血后以Glu、 Asp 為代表的興奮性氨基酸含有量顯著升高是缺血后興奮毒性的表現(xiàn)， 會對缺血后神經(jīng)造成一定程度損傷； 抑制性氨基酸（如Gly、 GABA 等） 含有量變化則是機體維持自我平衡的一種體現(xiàn)， 以此來對抗興奮性氨基酸過度釋放[22］。 Glu／GABA 比值可反映腦內(nèi)興奮-抑制性氨基酸的平衡狀態(tài)， 正常情況下較穩(wěn)定， 而發(fā)生缺血后會迅速升高[23］， 在生理情況下， GABA 受體激活可抑制興奮性毒性， 但其過度激活會對神經(jīng)細胞產(chǎn)生毒性作用， 這是腦缺血、 癲癇等疾病造成損傷的重要機制之一[24］。 因此， 拮抗興奮性氨基酸毒性， 包括抑制其過度釋放和受體活性、 促進其再攝取， 都成為腦缺血再灌注損傷治療藥物的重要靶點[25］。

谷紅注射液中乙酰谷酰胺和羥基紅花黃色素A具有一定神經(jīng)保護作用， 而藥物之間聯(lián)合使用具有整合的藥效學優(yōu)勢， 能在多個方面發(fā)揮協(xié)同增效的作用[26］， 故本實驗分別以單用及兩者合用對腦缺血大鼠海馬區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)釋放的協(xié)同作用進行考察， 發(fā)現(xiàn)腦缺血時大鼠腦海馬區(qū)4 種氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)含有量均顯著升高， 而給藥組能降低Asp、Glu 含有量及Glu／GABA 比值， 其中谷紅注射液組Glu 含有量低于乙酰谷酰胺組但高于羥基紅花黃色素A 組， GABA 含有量高于羥基紅花黃色素A 組，并且能明顯降低Glu／GABA 比值， 表明乙酰谷酰胺和羥基紅花黃色素A 對降低Glu 含有量、 提高GABA 含有量、 維持腦缺血大鼠海馬區(qū)興奮-抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)之間的平衡具有一定協(xié)同作用。

綜上所述， 谷紅注射液中乙酰谷酰胺和羥基紅花黃色素A 對降低興奮性氨基酸（Glu、 Asp） 含有量、 升高抑制性氨基酸（Gly、 GABA） 含有量、調(diào)節(jié)兩者之間動態(tài)平衡具有一定的協(xié)同作用， 從而起到抗腦缺血再灌注損傷的作用。