酸棗仁中斯皮諾素對睡眠剝奪大鼠下丘腦MCH、 Orexin-A 表達(dá)的影響

廖丹瓊， 儲利勝， 張建平， 方 燕， 李 琳， 周 青

（1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)臨床實(shí)踐教學(xué)中心， 浙江 杭州 310053； 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 浙江 杭州 310053； 3. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室， 浙江 杭州 310053）

睡眠疾病可嚴(yán)重影響生活質(zhì)量， 降低工作效率， 隨著生活節(jié)奏加快及生活方式改變， 其發(fā)病率不斷升高， 據(jù)報道， 嚴(yán)重失眠癥的發(fā)生率約為9.38%， 全球27%左右的患者受其困擾[1］。 目前， 臨床治療失眠癥的藥物主要是化學(xué)合成類鎮(zhèn)靜催眠藥， 但長期使用會產(chǎn)生不良反應(yīng)和依賴性[2］。

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill. var.spinosa （Bunge） Hu ex H. F. Chow 的干燥成熟種子， 性味甘、 酸、 平， 歸肝、 膽、 心經(jīng)， 具有養(yǎng)心補(bǔ)肝、 寧心安神、斂汗、 生津等功效， 是公認(rèn)的有效安神藥， 所含黃酮類成分斯皮諾素是發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的主要活性物質(zhì)[3］， 研究表明[4］， 給予大鼠低于睡眠劑量的戊巴比妥后， 斯皮諾素可顯著誘發(fā)睡眠， 并呈劑量依賴性地增強(qiáng)戊巴比妥誘導(dǎo)睡眠， 縮短睡眠潛伏期， 延長睡眠時間， 但其作用機(jī)制尚不清楚。 因此， 本實(shí)驗(yàn)采用改良多平臺睡眠剝奪法建立失眠模型， 觀察酸棗仁有效活性成分斯皮諾素對大鼠下丘腦黑色素濃集激素（MCH） 和食欲素-A （Orexin-A） 表達(dá)的影響， 初步探討該成分改善睡眠的可能作用途徑， 為失眠癥臨床治療提供高效、 安全的治療方案。

1 材料

1.1 動物 健康雄性SD 大鼠120 只， 體質(zhì)量200～250 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供， 動物生產(chǎn)許可證號SCXK （滬） 2017-0005。

1.2 試藥 斯皮諾素（成都克洛瑪生物科技有限公司， 批號72063-39-9， 含有量99%）； 地西泮（北京益民藥業(yè)有限公司， 國藥準(zhǔn)字H11020897， 2.5 mg／片）； 一抗MCH 山羊（貨號SC-14509）、 一抗Orexin-A 山羊 （貨號SC-8070）（美國Santa cruz Biotechnology 公司）； 二抗Alexa fluor 488驢抗山羊 （貨號705-545-147）、 驢血清 （貨號017-000-121） （北京吉比埃生物技術(shù)有限公司）； 大鼠MCH ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司， 貨號JL21041）； 大鼠Orexin-A ELISA 試劑盒（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，貨號YM-SZ1838）； RNA 提取試劑（Trizol 試劑盒） （美國Invitrogen 公司， 貨號15596018）； β-actin （碧云天生物技術(shù)研究所， 貨號H015）； RT-PCR 試劑盒（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司， 貨號DPRT-20）。

1.3 儀器 純水器（2000D 型， 北京長風(fēng)儀器儀表公司）；倒置相差顯微鏡（TE2000-S 型， 日本Nikon 公司）； 冰凍切片機(jī)（德國Leica 公司）； 實(shí)時定量PCR 儀（美國Stratagene 公司）； Multiskan Ascent 酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）。

2 方法

2.1 造模 采用改良多平臺睡眠剝奪法[5］。 將大鼠置于設(shè)有水槽平臺的睡眠記錄箱內(nèi)， 平臺周邊注滿水， 大鼠在平臺上可自行攝食飲水， 并可在平臺間活動， 當(dāng)它們進(jìn)入睡眠狀態(tài)時， 由于全身肌肉張力降低后頭部觸水而驚醒， 共進(jìn)行睡眠剝奪72 h。

2.2 分組 60 只大鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組、 模型組、 地西泮組、 斯皮諾素組， 每組30 只。 對照組大鼠于模型組相同時間點(diǎn)放入正常環(huán)境的睡眠箱（未設(shè)置水槽平臺） 內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)， 給予生理鹽水； 模型組大鼠造模后給予生理鹽水； 地西泮組大鼠造模后給予地西泮（0.8 mg／kg），1 次／d； 斯皮諾素組大鼠造模后給予斯皮諾素（15 mg／kg）， 給藥組均按10 mL／kg 體積于晚上19： 00 灌胃給藥， 對照組、 模型組于同時間點(diǎn)給予等體積生理鹽水，連續(xù)2 d。

2.3 大鼠下丘腦MCH 陽性反應(yīng)表達(dá)檢測 末次給藥后4 h， 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉， 立即斷頭處死， 取全腦， 腦組織經(jīng)固定、 蔗糖脫水、 OCT 包埋后切片， 厚度30 μm， 置于PBS 緩沖液中， 4 ℃下保存。 然后， 切片浸入PBS 緩沖液中漂洗， 10%驢血清、 0.3%Triton-X-100 封閉液處理30 min， 加入一抗混合液[含5%驢血清、 0.3%Triton-X-100、 山羊抗MCH （1 ∶2 000） 或Orexin-A （1 ∶2 500）的PBS 緩沖液］， 4 ℃下孵育過夜， 漂洗， 用含5%驢血清、0.3%Triton-X-100、 Alexa Fluor488 驢抗山羊IgG 熒光二抗（1 ∶1 000） 的PBS 緩沖液避光孵育2 h， 漂洗， 裱片， 封片， 熒光顯微鏡下觀察。 再應(yīng)用多功能真彩病理圖像系統(tǒng)，分析各組MCH、 Orexin-A 陽性表達(dá)的光密度、 面密度、 陽性細(xì)胞數(shù)。

2.4 大鼠下丘腦MCH、 Orexin-A mRNA 表達(dá)檢測 末次給藥后4 h， 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉， 立即斷頭處死， 取全腦， 冰臺上剝離下丘腦組織， Trizol 法提取總RNA， 以RNA 為模板將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA； PCR 擴(kuò)增按照相應(yīng)試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行， 反應(yīng)體系為20 μL， 冰上依次加入逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 1 μL、 引物1 μL、 TaqMan GEx MASTER Mix 10 μL， 加雙蒸水補(bǔ)至20 μL。 以β-actin為內(nèi) 參， 正 向5′-CGAGCTGTCTTCCCATCCA-3′， 反 向5′-TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG-3′， 擴(kuò)增基因片段320 bp；MCH 正向5′-ATGAAGCTTTCCGTTGGTA-3′， 反 向5′-CTACACTTCCCAGCAAGGTC-3′， 擴(kuò)增基因片段175 bp； Orexin-A 正 向 5′-ATTCGGTCTGCCTGTCCC-3′， 反 向 5′-ACCGCAACCGCCTTAGCT-3′， 擴(kuò)增基因片段215 bp， 擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min， 95 ℃反應(yīng)30 s， 60 ℃反應(yīng)30 s， 共40個循環(huán)。 然后， 擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠中電泳， 在凝膠圖像掃描系統(tǒng)中檢測其吸光度， 分別計算MCH、 Orexin-A吸光度與β-actin 吸光度的比值， 以此表示最終結(jié)果。

2.5 大鼠下丘腦MCH、 Orexin-A 水平 將下丘腦組織置于生理鹽水中煮5 min， 充分勻漿， 勻漿液置于EP 管中，室 溫 下 放 置 2 h， 加 入 NaOH 處 理， 4 ℃下 離 心（3 000 r／min） 10 min， 吸取上清液置于EP 管中備用， 按照ELISA 試劑盒說明書操作步驟檢測MCH、 Orexin-A 水平。 將0.1 mL 稀釋待測樣品加于已包被反應(yīng)孔中， 37 ℃下溫育1 h， 30 倍蒸餾水稀釋濃縮， 每孔加入洗滌液， 靜置30 s 后棄去， 重復(fù)3 次， 拍干， 再加入0.1 mL 酶標(biāo)抗體， 37 ℃下孵育0.5～1 h， 洗滌， 每孔依次加入顯色劑A、B 各50 μL， 輕輕振蕩混勻， 37 ℃下避光顯色15 min， 再加入終止液50 μL終止反應(yīng)， 空白孔調(diào)零， 450 nm 波長處測定吸光度。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理， 數(shù)據(jù)用s） 表示， 組間比較采用t 檢驗(yàn)； 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 斯皮諾素對MCH 陽性表達(dá)的影響 圖1 顯示， 在大鼠下丘腦外側(cè)區(qū)， 4 組均可觀察到MCH 陽性表達(dá)， 主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜， 其中對照組、 地西泮組、 斯皮諾素組較明顯， 而模型組呈散在分布， 表達(dá)較少。 表1 顯示， 與對照組比較， 模型組大鼠下丘腦MCH 陽性表達(dá)光密度、 面密度、 細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.01）； 與模型組比較， 斯皮諾素組三者顯著增加（P＜0.01）。

圖1 斯皮諾素對MCH 陽性表達(dá)的影響

表1 斯皮諾素對MCH 陽性表達(dá)的影響（s， n=10）

表1 斯皮諾素對MCH 陽性表達(dá)的影響（s， n=10）

注：與對照組比較，??P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別 光密度／% 面密度／% 陽性細(xì)胞數(shù)／個對照組 203.52±25.04 277.92±30.36 43.56±5.58模型組 65.41±11.12?? 105.40±15.99?? 22.15±5.43??地西泮組 122.10±15.33## 165.14±19.05## 33.09±5.63##斯皮諾素組 121.43±15.87## 164.03±20.13## 33.03±5.04##

3.2 斯皮諾素對Orexin-A 陽性表達(dá)的影響 圖2 顯示， 在大鼠下丘腦外側(cè)區(qū)， 4 組均可觀察到Orexin-A 陽性表達(dá)，主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜， 其中模型組呈密集型分布， 表達(dá)增加， 而對照組、 地西泮組、 斯皮諾素組呈散在分布，表達(dá)減少。 表2 顯示， 與對照組比較， 模型組Orexin-A 陽性表達(dá)的光密度、 面密度及細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較， 斯皮諾素組三者顯著減少（P＜0.01）。

圖2 斯皮諾素對Orexin-A 陽性表達(dá)的影響

3.3 斯皮諾素對MCH、 Orexin-A mRNA 表達(dá)的影響 表3顯示， 與對照組比較， 模型組MCH mRNA 表達(dá)顯著降低，Orexin-A mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較，斯皮諾素組前者mRNA 表達(dá)顯著升高， 后者mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。

表2 斯皮諾素對Orexin-A 陽性表達(dá)的影響s， n=10）

表2 斯皮諾素對Orexin-A 陽性表達(dá)的影響s， n=10）

注：與對照組比較，??P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

對照組 404.51±43.09 517.82±53.44 68.61±7.25模型組 613.77±62.33?? 721.89±73.62?? 89.43±9.23??地西泮組 510.57±53.41## 601.55±62.12## 75.04±7.99##斯皮諾素組 508.92±52.65## 599.53±60.68## 73.51±7.85##

表3 斯皮諾素對MCH、 Orexin-A mRNA 表達(dá)的影響0）

表3 斯皮諾素對MCH、 Orexin-A mRNA 表達(dá)的影響0）

注：與對照組比較，??P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

對照組 — 0.92±0.12 0.56±0.06模型組 — 0.44±0.08?? 0.91±0.10??地西泮組 0.8 0.72±0.09## 0.82±0.09##斯皮諾素組 15 0.71±0.08## 0.80±0.09##

3.4 斯皮諾素對MCH、 Orexin-A 水平的影響 表4 顯示，與對照組比較， 模型組MCH 水平顯著降低， Orexin-A 水平顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較， 斯皮諾素組前者水平顯著升高， 后者水平顯著降低（P＜0.01）。

表4 斯皮諾素對MCH、 Orexin-A 水平的影響， n=10）

表4 斯皮諾素對MCH、 Orexin-A 水平的影響， n=10）

注：與對照組比較，??P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別 劑量／（mg·kg-1） MCH ／（pg·mL-1）Orexin-A／（pg·mL-1）對照組 — 30.31±4.40 22.83±2.43模型組 — 18.55±3.44?? 34.66±3.90??地西泮組 0.8 24.03±4.03## 27.71±2.96##斯皮諾素組 15 23.88±3.36## 27.46±2.99##

4 討論

文獻(xiàn)報道， 大鼠預(yù)先（注射戊巴比妥24 h 前） 給予對氯苯丙氨酸后， 可明顯縮短戊巴比妥誘導(dǎo)的睡眠時間， 延長睡眠潛伏期， 而斯皮諾素能減弱上述失眠效應(yīng)， 減少睡眠潛伏期， 延長睡眠時間[4］。 李佳虹等[3］利用受體配體結(jié)合技術(shù)的原理， 結(jié)合HPLC、 LC-MS／MS 技術(shù)研究酸棗仁中鎮(zhèn)靜催眠活性成分， 發(fā)現(xiàn)斯皮諾素可與地西泮競爭結(jié)合腦組織中苯二氮艸卓受體， 可能發(fā)揮了類似的鎮(zhèn)靜催眠作用。由此推測， 斯皮諾素對睡眠剝奪所致失眠發(fā)揮了改善作用，但具體作用機(jī)制尚不明確。

MCH 神經(jīng)元主要位于下丘腦外側(cè)區(qū)， 少量散在分布于未定帶區(qū)域， 其所發(fā)出的軸突廣泛分布于大腦各個區(qū)域，如弓狀核、 背內(nèi)側(cè)核、 室旁核、 腹內(nèi)側(cè)核， 以及下丘腦以外腦區(qū)， 如嗅區(qū)、 海馬、 基底核和中隔、 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等， 可能通過軸突分布作用于上述的腦區(qū)或核團(tuán)， 直接或間接傳遞信號， 從而發(fā)揮功能調(diào)節(jié)作用[6］。 Blanco-Centurion 等[7］采取光遺傳技術(shù)激活下丘腦外側(cè)區(qū)MCH 神經(jīng)元， 可顯著增加白天自由活動大鼠的非動眼、 動眼睡眠時間； Vetrivelan等[8］采取上述方法在小鼠實(shí)驗(yàn)研究中獲得相似結(jié)果； 王娟等[9］研究表明， 10、 20 mg／kg 斯皮諾素均分別劑量依賴地增加慢波睡眠2.5、 3.1 倍， 減少覺醒量35.9%、 54.6%，但5 mg／kg 時不影響動物的睡眠-覺醒量。 本實(shí)驗(yàn)參照既往研究中斯皮諾素用量， 并結(jié)合課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 將其終質(zhì)量濃度設(shè)定為15 mg／kg， 然后檢測該成分對睡眠剝奪大鼠下丘腦MCH 神經(jīng)元陽性表達(dá)的影響， 發(fā)現(xiàn)斯皮諾素對改良多平臺睡眠剝奪法所致MCH 神經(jīng)元低表達(dá)具有改善效果。

Orexin 神經(jīng)元主要位于下丘腦側(cè)下及穹窿周圍區(qū)， 其所發(fā)出興奮性投射可到除小腦之外的中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他腦區(qū)， 尤其以高密度纖維投射至下丘腦以及腦干單胺能神經(jīng)元， 參與睡眠-覺醒的調(diào)節(jié)[10］， 其Fos 表達(dá)與覺醒呈明顯正相關(guān)， 而與睡眠呈顯著負(fù)相關(guān)， 激活后可促進(jìn)和維持覺醒[11］。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 斯皮諾素對改良多平臺睡眠剝奪法所致Orexin-A 神經(jīng)元高表達(dá)具有抑制效果。

MCH 是含有48 個氨基酸的神經(jīng)肽， 哺乳動物中它主要定位于下丘腦外側(cè)區(qū)和未定帶區(qū)， 一些激活睡眠的神經(jīng)元能表達(dá)MCH 物質(zhì)， 可增加慢波睡眠向快波睡眠轉(zhuǎn)變， 延長快波睡眠持續(xù)時間[12］， 同時也是機(jī)體能量內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)睡眠的重要調(diào)節(jié)因子[13］。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 斯皮諾素對改良多平臺睡眠剝奪法所致MCH 表達(dá)下降有改善作用。

Orexin-A 是由下丘腦Orexin 神經(jīng)元合成的小分子神經(jīng)神經(jīng)肽， 含33 個氨基酸， 序列在哺乳動物中相同， 它可增加覺醒及抑制睡眠， 是覺醒的重要啟動子[14］， Thannickal等[15］報道， 發(fā)作性睡病患者下丘腦Orexin-A 神經(jīng)元總體缺失了33%， 其mRNA、 蛋白表達(dá)也明顯降低。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，斯皮諾素對改良多平臺睡眠剝奪法所致Orexin-A 表達(dá)增加有抑制作用。

Kitka 等[16］認(rèn)為， Orexin 神經(jīng)元能軸突投向參與睡眠調(diào)控的腦區(qū)， 對覺醒起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用； MCH 神經(jīng)元可抑制其周圍及下丘腦的Orexin 神經(jīng)元， 從而促進(jìn)睡眠發(fā)生。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 推測斯皮諾素可能是通過上調(diào)下丘腦MCH 神經(jīng)元及其遞質(zhì)表達(dá)， 再抑制Orexin-A 表達(dá)， 從而對睡眠剝奪大鼠起到改善睡眠的效果。

綜上所述， 酸棗仁中斯皮諾素（15 mg／kg） 對改良多平臺睡眠剝奪法所致大鼠下丘腦MCH 低表達(dá)、 Orexin-A 高表達(dá)有逆轉(zhuǎn)作用， 提示該成分改善睡眠疾病的可能作用途徑， 有望為失眠癥的中藥治療開辟新途徑。