梁瓊仙，胡 波，張海紅，譚曉軍廣東省開平市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 開平 59300；暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院//廣州華僑醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 廣州 50000

腎細(xì)胞癌是眾多惡性腫瘤中的一種，男性腎癌患者患病率約為女性患者的2倍，屬于泌尿生殖系統(tǒng)中的高發(fā)惡性腫瘤[1-2]。近年來，腎癌的檢出率逐年增加[3-4]。目前針對(duì)腎癌的治療方案主要為外科手術(shù)治療，但是術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是阻礙腎癌治療進(jìn)展的絆腳石，甚至20%的初診腎癌患者已為腫瘤晚期，錯(cuò)失手術(shù)治療的最佳良機(jī)[5]?；?、放療為惡性腫瘤的重要治療方案，與外科手術(shù)切除療法并駕齊驅(qū)，但腎癌對(duì)放療及系統(tǒng)療法（基于IL-2及IFN-γ的激素療法、化學(xué)療法及免疫療法）不敏感甚至耐藥，大大增加治療難度[2,6]。BET超家族包括BRD1、BRD2、BRD4及BRDT 4種蛋白質(zhì)，具有相似的空間結(jié)構(gòu)，可通過結(jié)合染色體上乙?；馁嚢彼峤閷?dǎo)染色體重排或調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)BET超家族蛋白在腎癌細(xì)胞中表達(dá)量高，促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移，是治療腎癌的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[9]。CPI203是一種BET超家族的特異性小分子抑制劑，前期研究發(fā)現(xiàn)CPI203可在體內(nèi)外抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖，其中包括淋巴瘤、急性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、皮膚鱗癌及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等[10-14]。CPI203小分子抑制劑可通過調(diào)控多種癌基因表達(dá)水平進(jìn)而影響惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)及侵襲。至今，暫未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于CPI203對(duì)腎癌細(xì)胞增殖影響的研究。本實(shí)驗(yàn)通過探索CPI203對(duì)腎細(xì)胞癌的殺傷作用，并針對(duì)其影響機(jī)制進(jìn)一步深究，為探尋腎癌新藥物治療夯實(shí)一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

ACHN細(xì)胞（ATCC），小分子抑制劑CPI203（Selleckchem），PBS緩沖液、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、普通胰酶等試劑（BI），熒光定量PCR引物（上海生工生物工程公司合成提供），CCK-8檢測(cè)試劑盒（Dojindo），逆轉(zhuǎn)錄及TBGreen試劑盒（Takara），免疫印跡實(shí)驗(yàn)抗體（ProteinTech）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

腎癌ACHN細(xì)胞以普通培養(yǎng)基（含10%FBS的DMEM）于37 ℃、5% CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，嚴(yán)密注意細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞增殖至密度達(dá)培養(yǎng)瓶80%左右時(shí)，傳代培養(yǎng)。后續(xù)所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均建立在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 小分子抑制劑CPI203藥物溶液配制

CPI203用細(xì)胞級(jí)別的DMSO充分溶解，先配制成100 μmol/L濃度的母液并保存于-80 ℃冰箱中。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前用完全培養(yǎng)基將藥物母液稀釋成實(shí)驗(yàn)需要的工作液濃度。

1.4 腎癌ACHN細(xì)胞存活率檢測(cè)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ACHN細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，以每孔100 μL的細(xì)胞懸液接種于96孔板中，將培養(yǎng)板置于細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)過夜。根據(jù)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃需求，將培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)基更換為CPI203藥物溶液，濃度分別為0、0.1、0.5、1 μmol/L及5 μmol/L，設(shè)立空白組及對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)立4個(gè)復(fù)孔。CPI203藥物作用于腎癌ACHN細(xì)胞24、48 h后，96孔板中每個(gè)孔按照CCK8試劑盒說明書指示加入10 μL CCK8溶液，將96孔板放入細(xì)胞孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)培養(yǎng)板吸光度A450nm并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ACHN細(xì)胞備用，將腎癌細(xì)胞懸液密度調(diào)整為1×106/mL，以1 mL/孔的細(xì)胞懸液接種于6孔板中，放回普通細(xì)胞孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)培養(yǎng)板的90%～100%時(shí)，用高壓滅菌過的200 μL中槍頭迅速地在細(xì)胞中劃痕，然后將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為CPI203藥物濃度為0、0.1、0.5、1 μmol/L及5 μmol/L的培養(yǎng)基。分別于藥物作用0、48 h后于倒置顯微鏡下拍照，觀察細(xì)胞遷移及侵襲能力。

1.6 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ACHN細(xì)胞備用，將腎癌細(xì)胞懸液密度調(diào)整為1×106/mL，以1 mL/孔的細(xì)胞懸液接種于6孔板中，將培養(yǎng)板放回孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為小分子抑制劑CPI203藥物濃度為0、0.1、0.5、1 μmol/L及5 μmol/L的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板放回細(xì)胞孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，充分洗滌后加入75%乙醇固定液固定，放置于4 ℃冰箱過夜。PBS充分洗滌后加入500 μL PI重懸細(xì)胞，4 ℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。

1.7 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ACHN細(xì)胞備用，將腎癌細(xì)胞懸液密度調(diào)整為1×106/mL，以1 mL/孔的細(xì)胞懸液接種于6孔板中，將培養(yǎng)板放回孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為小分子抑制劑CPI203藥物濃度為0、0.1、0.5、1 μmol/L及5 μmol/L的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板放回細(xì)胞孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用PBS充分清洗后加入100 μL bindingbuffer重懸細(xì)胞，然后分別加入APC和PI各5 μL，常溫下避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.8 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ACHN細(xì)胞以500/孔接種于6孔板中，細(xì)胞繼續(xù)于孵箱中培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為小分子抑制劑CPI203藥物濃度為0、0.1、0.5、1 μmol/L及5 μmol/L的培養(yǎng)基，將細(xì)胞放回孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)10 d后用PBS充分洗滌，細(xì)胞固定液固定1 h后充分清洗，倒置顯微鏡下計(jì)算克隆形成數(shù)目。

1.9 免疫印跡法檢測(cè)MYC、GSK3β、ERK、AKT、CyclinD1和NOXA蛋白水平

收集不同CPI203藥物濃度處理的腎癌ACHN細(xì)胞并充分洗滌，加入適量強(qiáng)效細(xì)胞裂解液，4 ℃條件下裂解20 min，提取全細(xì)胞蛋白并利用BCA法測(cè)定蛋白濃度。提前配制好適宜濃度的SDS-PAGE膠，每個(gè)泳道加入40 μg蛋白，80 V恒壓電泳約30 min后轉(zhuǎn)換為120 V恒壓電泳約1 h；恒流200 mA濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜；將PVDF膜置于5% BSA溶液中封閉2 h；分別將PVDF膜置于4 ℃冰箱中中孵育相應(yīng)一抗溶液，過夜；0.1%吐溫的TBS-T洗滌一抗4次，10 min/次；室溫下孵育二抗1 h；TBS-T漂洗二抗3次，6 min/次；將PVDF膜稍微瀝干后加入ECL發(fā)光液，放置于WB成像系統(tǒng)中顯影成像。

1.10 qRT-PCR

用TRIzol裂解細(xì)胞并按照試劑盒說明書指示提取細(xì)胞總RNA，嚴(yán)格按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及TBGreen說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。qRT-PCR引物序列見表1。內(nèi)參基因選用GAPDH，利用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。

1.11 統(tǒng)計(jì)方法

對(duì)計(jì)數(shù)資料及計(jì)量資料均采用雙側(cè)檢驗(yàn)分析，采用SPSS20.0軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，參數(shù)檢驗(yàn)及非參數(shù)檢驗(yàn)分別采取t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 CPI203抑制腎癌ACHN細(xì)胞增殖

不同濃度CPI203藥物作用于ACHN細(xì)胞48 h后，腎癌細(xì)胞增殖活性受到不同程度抑制（表2）。0.1～5 μmol/L濃度的CPI203作用于ACHN細(xì)胞24 h后細(xì)胞增殖活性從87.29%降至52.61%，相同濃度的CPI203藥物作用于腎癌ACHN細(xì)胞的時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞增殖活性下降（P＜0.05，表2）。

表2 CCK8法檢測(cè)CPI203抑制ACHN細(xì)胞增殖效果（%，Mean±SD）

2.2 CPI203抑制腎癌ACHN細(xì)胞侵襲及遷移能力

ACHN細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著CPI203藥物濃度的增大，細(xì)胞遷移距離明顯變?。≒＜0.05，圖1）。

圖1 ACHN細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

2.3 CPI203藥物抑制腎癌ACHN細(xì)胞生長(zhǎng)周期并促進(jìn)其凋亡

不同濃度小分子抑制劑CPI203作用于腎癌ACHN細(xì)胞24 h后其細(xì)胞周期及凋亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小分子抑制劑CPI203濃度越大，ACHN細(xì)胞G0/G1期比例增加，G2/M和S期占比均比對(duì)照組細(xì)胞小，細(xì)胞凋亡率也隨著藥物濃度增大而升高（P＜0.05，圖2）。

2.4 熒光定量PCR

CPI203作用于腎癌ACHN細(xì)胞后減弱MYC基因、NOXA基因、AKT基因、ERK基因、GSK3β基因及CyclinD1基因的表達(dá)量（P＜0.05，圖3）。

2.5 CPI203抑制腎癌ACHN細(xì)胞克隆形成能力

未加小分子抑制劑CPI203的ACHN細(xì)胞形成明顯的細(xì)胞克隆集落，隨著藥物濃度的增大，腎癌ACHN細(xì)胞克隆集落形成能力逐漸減弱（P＜0.05，圖4）。

2.6 Western blotting結(jié)果

CPI203作用于腎癌ACHN細(xì)胞后降低MYC蛋白、NOXA蛋白、AKT蛋白、ERK蛋白、GSK3β蛋白及CyclinD1蛋白的表達(dá)量（P＜0.05，圖5）。

圖2 不同濃度CPI203藥物對(duì)腎癌ACHN細(xì)胞周期（A）及凋亡（B）的影響*P＜0.05

圖3 小分子抑制劑CPI203作用于腎癌ACHN細(xì)胞后相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖4 不同濃度CPI203藥物對(duì)腎癌ACHN細(xì)胞克隆形成能力的影響

圖5 小分子抑制劑CPI203作用于腎癌ACHN細(xì)胞后相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

腎癌細(xì)胞對(duì)化療和放療敏感性弱，并且患者病情容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)難治，眾多科學(xué)家為了克服此困難一直致力于探索治療腎癌的新藥物[15-17]。文獻(xiàn)報(bào)道CPI203具有抑制胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤增殖，促進(jìn)其癌細(xì)胞凋亡并將腫瘤細(xì)胞抑制于細(xì)胞周期G1期，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用[15]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑CPI203具有抑制腎癌ACHN細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力，并且其抑制效果與藥物作用時(shí)間呈正相關(guān)性。CPI203小分子抑制劑具有抑制腎癌ACHN細(xì)胞侵襲、遷移的能力，表明該小分子抑制劑在體內(nèi)具有抑制腎癌腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的能力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明隨著CPI203藥物濃度的增加，腎癌ACHN細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例增大，表明腫瘤細(xì)胞的凋亡率與CPI203藥物呈濃度依賴性。細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1是一種重要的細(xì)胞周期素，嚴(yán)格地調(diào)控著細(xì)胞G1期的合成，主要作用于G1/S調(diào)定點(diǎn)并調(diào)控著細(xì)胞G1期向S期的進(jìn)展。CyclinD1過多將縮短G1期，細(xì)胞將減弱對(duì)外源性有絲分裂的依賴并進(jìn)入細(xì)胞分裂[18]。CyclinD1下降將把細(xì)胞周期抑制于G1期，有利于腫瘤的治療。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小分子抑制劑CPI203可抑制腎癌ACHN細(xì)胞CyclinD1的表達(dá)，細(xì)胞S期及G2/M期比例降低，G0/G1期比例升高，表明CPI203可阻滯腎癌ACHN細(xì)胞周期進(jìn)展，影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、生存。有研究發(fā)現(xiàn)CPI203可通過降低MYC、NOXA、AKT及ERK等眾多基因的表達(dá)從而抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞及淋巴瘤細(xì)胞的增殖[19]。本研究發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑CPI203通過抑制腎癌ACHN細(xì)胞GSK3β、CyclinD1、MYC、NOXA、AKT及ERK基因的轉(zhuǎn)錄活性，減少其mRNA的表達(dá)量，同時(shí)降低這些基因的翻譯活性，進(jìn)一步抑制GSK3β、CyclinD1、MYC、NOXA、AKT及ERK蛋白質(zhì)的生成及功能。

綜上所述，CPI203能夠殺傷腎癌ACHN細(xì)胞，抑制腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)周期進(jìn)展，其潛在涉及的機(jī)制可能通過影響MYC、NOXA、AKT、ERK、GSK3β、CyclinD1等基因的表達(dá)有關(guān)。所以，CPI203是治療腎癌的潛在新藥物，為腎癌治療方案的選擇開辟出新道路。