孟鎮(zhèn)鍇，李曉旭，2，瞿文生，吳純啟，鐘 武，李云峰，王全軍

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，國家北京藥物安全評價研究中心，北京 100850；2.聊城大學(xué)藥學(xué)院，山東 聊城 252000）

肝臟是人體最大的代謝轉(zhuǎn)化器官，擔負多種重要生理功能，對人類健康至關(guān)重要。藥物誘導(dǎo)性肝損傷（drug induced liver injury，DILI）是導(dǎo)致藥物研發(fā)失敗和退市的最常見原因［1］，其預(yù)測難度大，危害性強，影響深遠。有研究顯示，我國人群DILI年發(fā)生率為每10萬人中23.8人，遠高于西方國家［2］。隨著“安全、有效、質(zhì)量可控”的制藥原則逐步深入人心，藥物安全性問題備受關(guān)注，DILI的研究及預(yù)測更受到毒理學(xué)界的高度重視。細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶廣泛存在于肝微粒體中，是最為重要的藥物代謝Ⅰ相酶系，其功能與DILI的發(fā)生密切相關(guān)，在藥物肝毒性評價研究中意義重大。得益于現(xiàn)代化工和制藥技術(shù)的進步，人們合成開發(fā)新化合物的種類和數(shù)量越來越多，速度越來越快，對體外化合物肝毒性篩選檢測模型提出了更高要求。尋找并構(gòu)建更加敏感、高效的體外肝細胞模型以滿足大量化合物更高的檢測篩選需求，一直以來是毒理學(xué)領(lǐng)域重要的研究內(nèi)容。

常規(guī)的體外肝細胞模型較多采用2D 培養(yǎng)，但存在細胞間聯(lián)系少、功能表達不充分、培養(yǎng)時間短和性狀保持難等問題，參考價值有限。近年研究表明，體外3D 培養(yǎng)狀態(tài)下的肝細胞聚球體模型可很好地模擬細胞間物質(zhì)交換與信息傳遞，蛋白表達和肝功能表現(xiàn)更加突出［3-5］，可長期培養(yǎng)并實現(xiàn)重復(fù)給藥，反復(fù)染毒，使藥物毒性暴露更加充分，檢測敏感度更高［6］。

原代人肝細胞（primary human hepatocytes，PHH）作為體外藥物肝毒性評價的金標準在藥物篩選中最具參考價值，但其來源緊缺，體外增殖能力差，性狀維持難，存在個體差異，限制了其普及和應(yīng)用［7］。HepG2細胞來源于人肝癌組織，科研應(yīng)用時間久，但參考價值有限；HepaRG 細胞為人肝祖細胞，來源于慢性丙肝患者肝組織，體外可不斷增殖，具有肝樣-膽管樣細胞雙向分化性，肝細胞功能表達良好且來源廣泛，極具應(yīng)用優(yōu)勢［6］。有研究顯示，對2D 培養(yǎng)狀態(tài)下的PHH，HepaRG和HepG2細胞進行比較，HepaRG 細胞CYP450 酶等多種功能蛋白表達顯著高于HepG2細胞，與PHH較為接近［8］。亦有文獻報道，3D 培養(yǎng)狀態(tài)下的HepaRG 和HepG2細胞聚球體，其多種功能蛋白的表達水平明顯高于自身2D 模型，對藥物的肝毒性更加敏感［4，9-10］。然而，針對此2種細胞3D聚球體模型的對比研究報道較少。本研究應(yīng)用HepaRG和HepG2細胞體外3D 聚球體模型，比較二者在生長形態(tài)、功能蛋白表達和對藥物肝毒性敏感性方面的差異，以期為體外肝細胞模型的選擇提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥品、試劑和主要儀器

HepaRG細胞和HepG2細胞均購自美國Millipore細胞庫。低吸附96孔板購自美國Corning公司；無酚紅Williams'E培養(yǎng)基（簡稱完全培養(yǎng)基，含胎牛血清10%，L-谷氨酰胺4 mmol·L-1，青霉素100 kU·L-1，鏈霉素100 mg·L-1）（批號2000888），胎牛血清（批號1795588）和L-谷氨酰胺（批號1951049）均購自美國Gibco公司；Trizol總RNA提取劑（貨號DP405-02）購自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號RR047B）購自日本TaKaRa公司；小鼠抗人CYP1A2單克隆抗體（貨號ab22717），兔抗人CYP2B6多克隆抗體（貨號ab69652），兔抗人CYP2C9單克隆抗體（貨號ab150364），兔抗人CYP2C19 單克隆抗體（貨號ab185213），兔抗人CYP2E1 多克隆抗體（貨號ab28146），兔抗人CYP3A4多克隆抗體（貨號ab155029），兔抗人白蛋白多克隆抗體（貨號ab106582）和辣根過氧化物酶（HRP）標記兔抗雞IgY（貨號ab6753）均購自美國Abcam公司；CY3標記山羊抗小鼠IgG（貨號gb21301）和山羊抗兔IgG（二抗）（貨號gb21303）購自武漢谷歌生物科技公司；硫胺素（thiamine，貨號25332），非阿尿苷（fialuridine，貨號15867），對乙酰氨基酚（acetaminophen，貨號10024），苯溴馬?。╞enzbromarone，貨號19768），異煙肼（isoniazid，貨號20378），奈法唑酮（nefazodone，貨號10012642）和環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，貨號13849）均購自美國Cayman公司；CCK-8試劑盒（貨號NG639）購自日本同仁公司。

IC1000 型電子細胞計數(shù)儀購自上海睿鈺生物科技公司；3-18K型高速冷凍離心機購自美國Sigma公司；VICTOR3-1420 型多功能酶標儀購自美國Perkin Elmer 公司；ABI7500型熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；Tanon1600型凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；ECLIPSE C1 型正置熒光顯微鏡購自日本尼康公司。

1.2 HepaRG和HepG2細胞聚球體的培養(yǎng)和形態(tài)觀察

復(fù)蘇HepaRG和HepG2細胞，常規(guī)培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并隔天換液。細胞處于對數(shù)生長期時，以每孔100 個細胞的密度將2 種細胞分別接種于低吸附96 孔板中，每孔加完全培養(yǎng)基100 μL，接種后100×g離心5 min促進細胞向中心區(qū)域聚集，靜置2 min后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中，采取不添加二甲亞砜和糖皮質(zhì)激素等誘導(dǎo)劑的方式進行培養(yǎng)，隔天用完全培養(yǎng)基半換液。于接種后第3，7，14和21天進行觀察，在40倍光學(xué)顯微鏡下拍攝HepaRG和HepG2細胞聚球體形態(tài)，并采用photoshop軟件測量其直徑。

1.3 實時熒光PCR法檢測HepaRG和HepG2細胞聚球體CYP450酶和白蛋白mRNA表達水平

收集接種后第7，14和21天的HepaRG 和HepG2細胞聚球體，用PBS 清洗3 次，加入Trizol試劑提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA逆轉(zhuǎn)錄。引物由北京Invitrogen公司合成，序列見表1，內(nèi)參為18SrRNA。實時熒光PCR反應(yīng)程序：95 ℃，30 s；40 個循環(huán)收集熒光（95℃，10 s；60℃，50 s）；建立PCR 產(chǎn)物溶解曲線，擴增結(jié)束后進行如下設(shè)置（95℃，10 s；60℃30 s；95℃15 s），最后從60℃緩慢加熱至99℃。采用2-△△Ct法計算各樣品目的基因mRNA 表達水平，并以接種后第7天HepG2 細胞聚球體樣品中各目的基因mRNA 表達量作為基礎(chǔ)對照值，比較其他樣品目的基因mRNA的相對表達倍數(shù)。

Tab.1 Primer sequences for quantitative real-time PCR（qRT-PCR）

1.4 免疫熒光法檢測HepaRG和HepG2細胞聚球體CYP450酶蛋白表達水平

接種后第10天，收集足量聚球體樣品，4%多聚甲醛固定20 min 后清洗，制作石蠟切片，并脫蠟至水。以10%牛血清白蛋白室溫封閉30 min，加入一抗（用PBS緩沖液1∶100稀釋），放入濕盒，4℃孵育過夜。置脫色搖床上用PBS 晃動洗滌3 次，每次5 min，加入二抗（以TBST緩沖液1∶300稀釋）避光室溫孵育1 h，置脫色搖床上用PBS 晃動洗滌3 次后，以4‘，6-二脒基-2-苯基吲哚染核10 min，PBS清洗3次后用抗熒光淬滅劑封片。于熒光顯微鏡下觀察各蛋白熒光顯色并拍照，用Image J 軟件對熒光信號的平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）進行檢測和統(tǒng)計分析。

1.5 Western蛋白印跡法檢測HepaRG和HepG2細胞聚球體白蛋白蛋白表達水平

接種后第10 天，收集足量聚球體樣本，加入裂解液，冰上裂解20 min 并振蕩，離心收集上清。按4∶1 比例加入上樣緩沖液，沸水浴變性15 min，-20℃保存。配制SDS-PAGE的12%分離膠和5%濃縮膠，上樣并電泳。半干法PVDF 轉(zhuǎn)膜，加5%脫脂牛奶室溫下脫色搖床封閉1 h。加入一抗（1∶1000）4℃孵育過夜，置于脫色搖床上TBST 晃動洗滌3 次，每次5 min。加入二抗（1∶3000）室溫下孵育30 min并清洗3次。于暗室內(nèi)進行曝光、顯影和定影處理后掃描圖像，用Image J 軟件進行積分吸光度分析。

1.6 CCK-8法檢測單次或重復(fù)給藥HepaRG和HepG2聚球體細胞存活率

包括陰性對照藥物硫氨素等7種藥物均以完全培養(yǎng)基配制，其中硫胺素、非阿尿苷、對乙酰氨基酚、苯溴馬隆、異煙肼和奈法唑酮的終濃度為0.01，0.1，1，10，20和40 mmol·L-1；環(huán)磷酰胺的終濃度為0.01，0.1，1，5，10和20 mmol·L-1，分別以單次和重復(fù)給藥的方式對2種細胞聚球體進行細胞毒性實驗。

單次給藥：接種后第10 天，將原培養(yǎng)液更換為含不同濃度藥物的完全培養(yǎng)基，每孔100 μL，置于37℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱孵育24 h。而后吸去藥液，以不含藥的完全培養(yǎng)基清洗換液3 次，徹底去除殘留藥液。每孔加入CCK-8 試劑10 μL，繼續(xù)孵育4 h 后用多功能酶標儀在450 nm 波長下檢測吸光度（A450nm）值。

重復(fù)給藥：接種后第10，12 和14 天，分別重復(fù)單次給藥過程（共重復(fù)給藥3次），末次清洗換液去除藥物后，每孔加入CCK-8 試劑10 μL，孵育4 h 后用多功能酶標儀在450 nm波長下檢測A450nm值。

細胞存活抑制率（%）=（對照孔A450nm-實驗孔A450nm）/對照孔A450nm×100%。用GraphPad 7 軟件繪制不同給藥方式下各藥物對2種細胞聚球體的細胞存活抑制率曲線，并計算IC50值，以評價2種細胞聚球體對藥物體外肝毒性的敏感性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，使用SPSS19.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析。2 種細胞聚球體平均直徑測量結(jié)果和實時熒光PCR 檢測結(jié)果數(shù)據(jù)采用兩因素重復(fù)測量方差分析進行組間比較，免疫熒光和Western蛋白印跡實驗結(jié)果數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗進行兩組間比較，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HepaRG和HepG2細胞聚球體生長規(guī)律和形態(tài)變化

聚球體鏡下形態(tài)見圖1A，平均直徑變化見圖1B。隨著培養(yǎng)時間的延長，2 種細胞聚球體平均直徑均逐步增大。接種后第3 天，HepaRG和HepG2細胞均可穩(wěn)定聚合成球形結(jié)構(gòu)，二者平均直徑無明顯差異。第7和14天時，二者均能保持較為規(guī)則致密的球形結(jié)構(gòu)，HepG2細胞聚球體體積增長幅度較明顯，其平均直徑均顯著大于HepaRG細胞聚球體（P＜0.01）。第21 天時，HepG2細胞聚球體體積小幅增長，細胞間黏附作用下降，球體形態(tài)疏松膨大，有明顯崩解碎裂傾向；而HepaRG 細胞聚球體有部分組織碎屑，但整體形態(tài)保持較為緊致，平均直徑顯著＜HepG2細胞聚球體（P＜0.01）。

Fig.1 Morphology（A）and average diameters（B）of HepaRG and HepG2 spheroids.HepaRG and HepG2 cells were seeded at 100 cells per well and all spheroids were monitored on the 3rd day（D3），D7，D14and D21 after cell inoculation.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with HepG2 group at the same time.

2.2 HepaRG和HepG2細胞聚球體CYP450酶mRNA表達水平

實時熒光PCR檢測結(jié)果（圖2）表明，2種細胞聚球體除第14天CYP2B6mRNA 表達不具統(tǒng)計學(xué)意義外，在3 個檢測時間點中HepaRG 細胞聚球體CYP1A2，CYP2B6，CYP2C9，CYP2C19，CYP2E1和CYP3A4mRNA 表達水平均明顯高于同期HepG2 細胞聚球體（P＜0.05，P＜0.01）；HepaRG 細胞聚球體CYP1A2和CYP2C9mRNA 表達水平在第7 天達峰值，與HepG2 細胞聚球體差異顯著（P＜0.01），分別為基礎(chǔ)對照值（第7天的HepG2細胞聚球體mRNA表達量）的261.7和277.1倍；CYP2B6，CYP2C19和CYP2E1mRNA表達在第7和14天表達水平顯著高于同期HepG2 細胞聚球體（P＜0.01），表達峰值分別為基礎(chǔ)對照值的55.7，9.9 和44.3倍；CYP3A4mRNA表達于第14 天達峰值，高于HepG2 細胞聚球體（P＜0.01），為基礎(chǔ)對照值的280.7倍。

Fig.2 Relative expressions of CYP1A2（A），CYP2B6（B），CYP2C9（C），CYP2C19（D），CYP2E1（E）and CYP3A4（F）mRNA in HepaRG and HepG2 spheroids by qRT-PCR. CYP mRNA expression level was expressed as the relative expression fold based on the mRNA expression（2-ΔΔCt）of HepG2 cell spheroids on D7.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with HepG2 group at the same time.

2.3 HepaRG和HepG2細胞聚球體CYP450酶蛋白表達水平

熒光染色結(jié)果（圖3和表2）表明，培養(yǎng)第10 天HepaRG細胞聚球體CYP1A2，CYP2B6，CYP2C9，CYP2C19，CYP2E1 和CYP3A4 蛋白表達水平均高于同期HepG2 細胞聚球體，分別為后者的2.1，1.6，1.9，1.6，1.6和2.3倍（P＜0.05，P＜0.01）。

2.4 HepaRG和HepG2細胞聚球體白蛋白mRNA和蛋白表達水平

實時熒光PCR 結(jié)果（圖4A）表明，接種后第7天時，HepaRG細胞聚球體白蛋白mRNA表達明顯上調(diào)；第14天達峰值，為基礎(chǔ)對照值的3.9倍，高于同期HepG2 細胞聚球體表達（P＜0.01）；第21 天時，2 種聚球體白蛋白mRNA 表達無明顯差別。Western 蛋白印跡法結(jié)果（圖4B）表明，接種后第10 天，HepaRG 聚球體白蛋白蛋白表達顯著高于HepG2聚球體，約為后者的1.9倍（P＜0.01）。

Tab.2 Protein expression of CYP450s in HepaRG and HepG2 spheroids by immunofluorescence staining

2.5 HepaRG和HepG2細胞聚球體對藥物肝毒性的敏感性

在受試濃度范圍內(nèi)單次給藥，7 種藥物中除苯溴馬隆和奈法唑酮外，其余5 種對HepaRG 和HepG2細胞聚球體細胞存活的抑制作用均未達到半數(shù)抑制水平。同樣濃度范圍下重復(fù)給藥3 次，在HepaRG細胞聚球體，6 種陽性對照藥對細胞存活均有抑制作用，其IC50值見表3；在HepG2細胞聚球體，對乙酰氨基酚和環(huán)磷酰胺對細胞存活的抑制作用均未達到半數(shù)抑制水平。

Fig.3 Protein expression of CYP450s in HepaRG and HepG2 spheroids by immunofluorescence staining.HepaRG and HepG2 spheroids were stained with 4′，6-diamidino-2-phenylindole and secondary antibodies and detected on D10.

Fig.4 Albumin mRNA and protein expressions in HepaRG and HepG2 spheroids by qRT-PCR（A）and Western blotting（B）.HepaRG and HepG2 spheroids were detected on D7，D14，and D21 by qRT-PCR and on D10 by Western blotting，respectively.B2 was the semi-quantitative result of B1.IA：integral absorbance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with HepG2 group of the same time.

Fig.5 Hepatotoxicity of thiamine（A），fialuridine（B），acetaminophen（C），benzbromarone（D），cyclophosphamide（E），isoniazid（F）and nefazodone（G）with single and repeated administration in HepaRG and HepG2 spheroids by CCK-8 assay.HepaRG and HepG2 spheroids were incubated with different concentrations of each drug for 24 h once（single administration）or 3 times at 24 h intervals（repeated administration）.Inhibitory rate（%）=（cell control group A450 nm-experiment group A450 nm）/cell control group A450 nm×100%.±s，n=3.

Tab.3 lC50 values of drugs in HepaRG and HepG2 spheroids

3 討論

HepaRG 細胞具有肝樣-膽管樣細胞雙向分化性，國外研究傾向于在培養(yǎng)初期（2 周內(nèi)）添加二甲基亞砜、奧美拉唑和糖皮質(zhì)激素進行誘導(dǎo)［10-11］，以促進細胞快速分化成熟。然而誘導(dǎo)劑的反復(fù)添加存在如下問題：①2 種模型培養(yǎng)條件不統(tǒng)一，結(jié)果對比可信度下降；②不同批次樣本間差異度增大，質(zhì)控難度提高；③建模的成本增加，操作工作量上升。出于上述考慮，本課題組在模型的構(gòu)建上采取了不添加誘導(dǎo)劑的方式。結(jié)果顯示，在無誘導(dǎo)劑添加的條件下接第14天，HepaRG細胞聚球體多種功能蛋白均有高水平表達，并明顯高于同期HepG2細胞聚球體。表明不添加誘導(dǎo)劑的HepaRG 細胞聚球體構(gòu)建方法相比于誘導(dǎo)法更加經(jīng)濟、簡便、實用，具有一定普適性，且在功能上優(yōu)于HepG2 細胞聚球體。

文獻報道，為保證模型內(nèi)部供能供養(yǎng)均勻且充足，聚球體參考直徑在200～300 μm 較為合適［11］。本研究以此范圍為細胞聚球體質(zhì)量控制的標準。結(jié)果顯示，在接種后第3～14天，HepG2細胞聚球體快速生長、體積持續(xù)增大，超出參考直徑范圍較為明顯；而HepaRG 細胞聚球體直徑持續(xù)穩(wěn)定在約300 μm，形態(tài)緊致，相比于HepG2細胞聚球體具有一定的形態(tài)優(yōu)勢。接種后第21 天，HepaRG和HepG2細胞聚球體直徑均≥400 μm，HepG2 細胞聚球體細胞間黏附作用明顯下降，而HepaRG細胞聚球體亦存在少量崩散現(xiàn)象，表明二者均存在能量供應(yīng)障礙。以上結(jié)果提示，為防止體積過大形成過多壞死區(qū)域而影響聚球體建模效果，以接種后7～14 d進行后續(xù)實驗為宜。

文獻報道，對CYP1A2，CYP2B6，CYP2C9，CYP2C19，CYP2E1和CYP3A4的檢測可覆蓋80%以上臨床藥代相關(guān)Ⅰ相酶，具有一定代表性和參考價值，而白蛋白生成能力的高低亦是評價肝細胞模型優(yōu)劣的重要指標［6，8］。Yokoyama等［8］研究表示，2D培養(yǎng)狀態(tài)下，HepaRG細胞的多種CYP450酶mRNA表達均明顯高于HepG2細胞。本研究結(jié)果表明，3D培養(yǎng)狀態(tài)下，HepaRG細胞聚球體亦保持了CYP450 酶的基因?qū)用娓弑磉_的優(yōu)勢。蛋白表達檢測結(jié)果與實時熒光PCR 結(jié)果與文獻報道趨勢一致［3］。值得指出的是，由實時熒光PCR結(jié)果可知，HepaRG 細胞聚球體功能蛋白基因的高表達主要集中在接種后第7 和14 天，第21 天時明顯下降。推測與聚球體體積過大導(dǎo)致內(nèi)部細胞能量供應(yīng)不足有關(guān)。為兼顧聚球體形態(tài)保持和功能蛋白表達，以保證實驗效果，選擇接種后第10 天的聚球型進行后續(xù)的藥物毒性評價。

細胞毒性實驗中，本課題組參考臨床藥物DILI評級［1］和美國國立衛(wèi)生研究院LiverTox 網(wǎng)站信息［12］選擇了6種陽性對照藥（其中環(huán)磷酰胺的DILI評級為肝毒性弱相關(guān)，其余5種為肝毒性強相關(guān)）和1 種陰性對照藥，具有很好的藥物代表性［13-21］。實驗結(jié)果顯示，陰性對照藥硫胺素未檢測出明顯細胞毒性，其余6 種陽性藥物均對細胞存活有不同程度的抑制。單次給藥條件下，除苯溴馬隆和奈法唑酮外，其余藥物對HepaRG和HepG2細胞聚球體細胞存活的抑制作用均未達到半數(shù)抑制水平。重復(fù)給藥條件下，6 種陽性藥物對2 種細胞聚球體抑制效果明顯增強，除對乙酰氨基酚和環(huán)磷酰胺對HepG2 細胞聚球體外，均達到半數(shù)抑制水平。通過對比濃度-細胞抑制率曲線和IC50值可知，重復(fù)給藥下HepaRG細胞聚球體對藥物毒性比HepG2細胞聚球體更為敏感，6種陽性藥物IC50值在0.3～8 mmol·L-1，較HepG2 細胞聚球體更低。提示HepaRG 細胞聚球體以重復(fù)給藥的方式應(yīng)用于體外藥物肝毒性的檢測篩選可以達到較為理想的效果。

在模型進一步應(yīng)用方面，高通量高內(nèi)涵檢測技術(shù)近年來在化合物的檢測篩選上應(yīng)用逐步成熟，可通過不同熒光探針的標記，對肝聚球體模型的細胞核形態(tài)、線粒體膜電位變化、細胞骨架損傷程度、膽鹽轉(zhuǎn)運狀態(tài)和脂質(zhì)堆積變性等情況進行綜合分析，可更好地研究藥物肝毒性分子機制［22-23］，這是本課題下一步重點研究的課題。

綜上所述，本研究應(yīng)用體外HepaRG和HepG2細胞聚球體模型，探討了二者在生長規(guī)律、形態(tài)保持及CYP450酶和白蛋白表達方面的差異，并通過6種藥物的細胞毒性實驗對比其體外對藥物肝毒性敏感度的差異。結(jié)果顯示，對比HepG2 細胞聚球體，HepaRG 細胞聚球體體積控制更小，形態(tài)保持更加穩(wěn)定，CYP450酶和白蛋白基因和蛋白表達均明顯高于HepG2細胞聚球體，并對藥物的體外肝毒性反應(yīng)更為敏感，更符合體外3D 肝細胞模型構(gòu)建標準，作為藥物評價篩選模型具有一定優(yōu)勢，是更加理想的體外3D肝細胞模型。