新型豬藍(lán)耳病基因工程活疫苗(PC株)的研究及應(yīng)用

李文生，孫志勇，范 娟，宋慶慶

（金宇生物技術(shù)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS），又稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）引起的一種高度傳染性疾病，其主要臨床特征表現(xiàn)為母豬繁殖障礙和仔豬、育肥豬的呼吸困難。自1987年在美國發(fā)現(xiàn)以來，該病已在全世界范圍內(nèi)流行。在美國，每年因PRRS造成的損失高達(dá)5.6億～6.6億美元[1-2]。我國自1996年證實(shí)了PRRS的存在以來，特別是發(fā)生于2006年春的“無名高熱”（即高致病性豬藍(lán)耳?。?，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

1 PRRSV的基本結(jié)構(gòu)

PRRSV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，根據(jù)其基因組和抗原性的差異，可分為歐洲型（基因1型）和美洲型（基因2型）。雖然歐洲型和美洲型的基因序列的同源性在63%左右[3]，但二者具有幾乎相同的基因組合方式和致病機(jī)理。PRRSV基因組包含至少10個(gè)開放閱讀框（Open Reading Frames，ORFs），分別是 ORF1a，ORF1b和ORF2～ORF7，每個(gè)ORF編碼的蛋白也各不相同（見表1和表2）[4]。

2 PRRSV中各蛋白的功能及在免疫學(xué)方面的作用

由于PRRSV的基因組相對復(fù)雜，其編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白（Nonstructural protein，Nsp）和結(jié)構(gòu)蛋白數(shù)量較多，每一種蛋白質(zhì)在病毒感染、入侵細(xì)胞、病毒復(fù)制、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、宿主免疫等方面各自發(fā)揮著不同的作用，下表是關(guān)于豬藍(lán)耳病病毒蛋白結(jié)構(gòu)及功能（表1和表2）[5-16]。

從以上信息可知，豬藍(lán)耳病病毒無論是非結(jié)構(gòu)蛋白或結(jié)構(gòu)蛋白均可能存在免疫功能。而多數(shù)研究表明，非結(jié)構(gòu)蛋白重要的作用是參與病毒復(fù)制、病毒侵入機(jī)制及病毒致病力等，即病毒毒力和致病力等問題可能主要取決于非結(jié)構(gòu)蛋白，因此對非結(jié)構(gòu)蛋白的研究近年來得到廣泛關(guān)注。

3 我國豬藍(lán)耳病疫苗現(xiàn)狀

3.1 疫苗種類

目前國內(nèi)用于豬藍(lán)耳病預(yù)防接種的商品化疫苗主要有三大類，分別是減毒活疫苗、滅活苗和基因工程嵌合疫苗，具體疫苗類型及毒株詳見表3。

3.2 傳統(tǒng)豬藍(lán)耳病疫苗臨床應(yīng)用的優(yōu)劣

在養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中，豬藍(lán)耳病疫苗被關(guān)注的焦點(diǎn)主要是傳統(tǒng)經(jīng)典毒株和變異毒株之間是否具有很好的交叉保護(hù)力、變異毒株是否安全和穩(wěn)定等問題。養(yǎng)殖生產(chǎn)者都迫切希望能對不同毒株的豬藍(lán)耳病疫苗進(jìn)行排名以區(qū)分優(yōu)劣，甚至在豬場內(nèi)進(jìn)行PRRSV測序，期望找到與豬場內(nèi)PRRSV基因序列同源性最高的疫苗毒株。

3.2.1 滅活疫苗

豬藍(lán)耳病滅活苗具有高度安全的特點(diǎn)，相比于減毒活疫苗，可用于任何階段豬群而不會出現(xiàn)臨床發(fā)病的問題。但滅活苗也有其不足，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：1）免疫力不強(qiáng)，豬藍(lán)耳病滅活苗能產(chǎn)生體液免疫，但幾乎不產(chǎn)生細(xì)胞免疫，細(xì)胞免疫對豬只免疫保護(hù)起著重要作用；2）由于豬藍(lán)耳病具有抗體依賴增強(qiáng)效應(yīng)（ADE），且滅活苗僅有體液免疫作用，因此在抗體衰減過程中容易出現(xiàn)臨床反彈的現(xiàn)象，因此要求豬只被高密度免疫；3）豬藍(lán)耳病滅活苗對疫苗品質(zhì)要求非常高，尤其對抗原含量要求高，因此高倍濃縮的疫苗才有一定效果，但疫苗成本居高不下。

表1 PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白主要功能

表2 PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白主要功能

表3 國內(nèi)豬藍(lán)耳病商品化疫苗匯總

3.2.2 經(jīng)典毒株減毒活疫苗

經(jīng)典減毒活疫苗的優(yōu)點(diǎn)是具有較好的安全性和較強(qiáng)的毒株穩(wěn)定性，科學(xué)使用基本不造成明顯的臨床表現(xiàn)。但由于豬藍(lán)耳病病毒的高度變異，導(dǎo)致20多年前分離的毒株其基因同源性與當(dāng)前流行毒株的同源性相比較低，高變區(qū)同源性只有80%多。因此造成其免疫匹配度差，交叉免疫保護(hù)效果不佳。

3.2.3 傳統(tǒng)高致病毒株減毒活疫苗

高致病毒株是最近10來年分離到的毒株，與當(dāng)前流行田間株具有較高的同源性和不錯(cuò)的交叉免疫保護(hù)效果（NADC like株除外）。但相比于滅活疫苗和經(jīng)典毒株減毒活疫苗，傳統(tǒng)高致病株減毒活疫苗存在安全性問題，長時(shí)間使用可能造成母豬流產(chǎn)、返情及呼吸道癥狀等。

3.3 新型基因工程嵌合疫苗（PC株）的特點(diǎn)及臨床應(yīng)用效果

3.3.1 豬藍(lán)耳病新型基因工程嵌合疫苗（PC株）基本構(gòu)架

基因工程嵌合疫苗是近年才研發(fā)出的一種新型豬藍(lán)耳病活疫苗，目前市面上僅一種毒株，即PC株。它是利用反向遺傳技術(shù)，將豬藍(lán)耳病病毒經(jīng)典毒株（SP株）的ORF1a和ORF1b，以及豬藍(lán)耳病病毒高致病性毒株（GD株）的ORF2～ORF7重組成嵌合病毒疫苗株（如圖1）。

3.3.2 豬藍(lán)耳病新型基因工程嵌合疫苗（PC株）的特點(diǎn)

由于基因工程嵌合疫苗（PC株）結(jié)合了豬藍(lán)耳病病毒經(jīng)典毒株和高致病性毒株的部分基因，因此該疫苗具有以下幾個(gè)其他種類疫苗不可比擬的優(yōu)點(diǎn)：1）交叉保護(hù)。利用基因工程改造的疫苗，免疫原性好，既能預(yù)防經(jīng)典豬藍(lán)耳病毒株，又能預(yù)防高致病變異豬藍(lán)耳病毒株，解決了實(shí)際生產(chǎn)過程中豬藍(lán)耳病疫苗選擇難的問題。2）安全性高。相比于傳統(tǒng)減毒弱毒活疫苗，它的安全性更高，注射后豬只無體溫反應(yīng)，排毒時(shí)間短，妊娠母豬、仔豬均可使用。3）穩(wěn)定性強(qiáng)。該毒株遺傳穩(wěn)定，不變異，不易與其他PRRSV毒株發(fā)生田間重組。4）易于鑒別。由于疫苗毒株在基因改造過程中加入了特殊的標(biāo)記序列，可與其他疫苗株區(qū)分，還可識別野毒株。既能用于鑒別診斷，又利于豬群藍(lán)耳病的凈化。

3.3.3 基因工程嵌合疫苗（PC株）的臨床應(yīng)用

3.3.3.1 攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)

圖1 豬藍(lán)耳病疫苗（PC株）基因結(jié)構(gòu)示意圖

作為一種全新的基因工程嵌合疫苗，豬藍(lán)耳病疫苗（PC株）能給豬群提供堅(jiān)強(qiáng)的保護(hù)力。試驗(yàn)仔豬于4周齡分別免疫不同公司的豬藍(lán)耳病疫苗后，在62日齡進(jìn)行攻毒試驗(yàn)（毒株：JXA1）。結(jié)果顯示：攻毒后，所有試驗(yàn)組豬只的體溫都經(jīng)歷了先升高后下降的變化趨勢，但豬藍(lán)耳病嵌合疫苗（PC株）組豬只的體溫在攻毒后第9天時(shí)即基本恢復(fù)到正常水平，而其他實(shí)驗(yàn)組豬只的體溫恢復(fù)時(shí)間明顯延后（見圖2）。

豬在感染豬藍(lán)耳病病毒后的一段時(shí)間內(nèi)都會向外界環(huán)境中排毒，豬對病毒的抵抗力越強(qiáng)，其排毒時(shí)間就越短。攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有實(shí)驗(yàn)組的豬只在攻毒后第3天都出現(xiàn)了明顯的排毒現(xiàn)象，但在攻毒后第7天，豬藍(lán)耳病嵌合疫苗（PC株）組的排毒比例明顯下降，第15天時(shí)便不再排毒；而免疫了其他種類豬藍(lán)耳病疫苗組的豬只排毒比例會出現(xiàn)反彈（見圖3）。以上結(jié)果說明，豬藍(lán)耳病疫苗（PC株）能明顯縮短豬只的排毒時(shí)間，降低排毒豬比例，為豬只提供堅(jiān)強(qiáng)的保護(hù)力。

不同種類疫苗的免疫保護(hù)力也不盡相同。免疫了豬藍(lán)耳病疫苗（PC株）的仔豬，在攻毒后18 d都沒有出現(xiàn)死亡的個(gè)體，且健康狀況良好。免疫了豬藍(lán)耳病疫苗（經(jīng)典株）的仔豬存活率為80%，說明它對仔豬只提供了部分保護(hù)力。而攻毒對照組在攻毒后18 d的仔豬存活率僅為40%，明顯低于3個(gè)疫苗免疫組（見圖 4）。

3.3.3.2 疫苗安全性對比實(shí)驗(yàn)

通過比較不同毒株的豬藍(lán)耳病疫苗試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給21日齡健康仔豬免疫豬藍(lán)耳病疫苗（JXA1-R株）1頭份，在免疫后第14天進(jìn)行剖檢，可以見到仔豬肺臟發(fā)生了病變（見圖5）、腹股溝淋巴結(jié)出血，呈大理石樣（見圖7）。而相同試驗(yàn)條件下，免疫了豬藍(lán)耳病疫苗（PC株）的仔豬，在免疫后第14天的剖檢結(jié)果顯示均沒有出現(xiàn)明顯病變（見圖6和圖8），表明豬藍(lán)耳病疫苗（PC株）具有很高的安全性，不會對免疫豬只的臟器、免疫器官等造成損害。

4 結(jié)論

通過各種臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，新型嵌合疫苗（PC株）不僅能提供更好的免疫保護(hù)效果，同時(shí)疫苗本身也更加安全，是解決當(dāng)前豬藍(lán)耳病防控難的好選擇。當(dāng)然，任何一種疫苗都需要經(jīng)過大量和長時(shí)間臨床應(yīng)用的考驗(yàn)，方能證明其毒株穩(wěn)定性和安全性的問題，因此筆者將長期追蹤該疫苗毒株在臨床長期傳代后對豬群的致病性及毒株變異情況。

圖2 不同疫苗免疫的仔豬攻毒后體溫變化

圖3 不同疫苗免疫的仔豬攻毒后排毒時(shí)間

圖4 不同疫苗免疫的仔豬攻毒后存活率

圖5 JXA1-R株疫苗免疫仔豬后肺臟病變

圖6 PC株疫苗免疫仔豬后肺部正常

圖7 JXA1-R株疫苗免疫仔豬后淋巴結(jié)病變

圖8 PC株疫苗免疫仔豬后扁桃體與淋巴結(jié)

豬藍(lán)耳病基因工程嵌合疫苗（PC株）結(jié)合了市面上豬藍(lán)耳病弱毒活疫苗和滅活疫苗的優(yōu)點(diǎn)，規(guī)避了二者的缺點(diǎn)，不僅能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，而且能夠激發(fā)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。相信在未來，無論養(yǎng)殖場的豬藍(lán)耳病感染情況如何，建立完善的生物安全防控體系，做好豬藍(lán)耳病免疫工作，只要堅(jiān)持不懈，一定會降低豬藍(lán)耳病的臨床感染率和發(fā)病率，并逐步達(dá)到凈化的目的。