梁穎娜 黃宇婷 李立新

傳統(tǒng)流行病學研究認為兒童肥胖是成年后發(fā)生心血管疾病(CVD)、糖尿病和某些癌癥等的危險因素，且這些疾病的風險隨著兒童BMI的升高而升高[3]。但由于其固有的混雜或偏倚，是否能夠真正反映出生體重與兒童肥胖之間存在因果關(guān)聯(lián)仍不明確，營養(yǎng)與飲食、體力活動等偏倚在傳統(tǒng)的觀察性研究設(shè)計中往往難以控制，且不能被實驗研究所證實。

孟德爾隨機化(MR) 研究通過引入計量經(jīng)濟學中工具變量的概念，MR研究利用遺傳變異作為社會或行為因素的替代指標，對給定的暴露和結(jié)局做出因果關(guān)系的判斷。MR研究過程基于以下假設(shè)(圖1)：①基因工具變量單核苷酸多態(tài)性(SNP)與暴露因素相關(guān)，此過程一般以GWAS研究為依據(jù)，選擇合適的SNP作為工具變量；②基因工具變量的形成可看作隨機分配的過程，與混雜因素相關(guān)獨立；③工具變量只能過通過暴露因素作用于結(jié)局。在MR研究中，基因與結(jié)局的效應(yīng)關(guān)系不會受到出生后社會環(huán)境和行為因素等常見的混雜因素和反向因果關(guān)聯(lián)的影響或歪曲，對于暴露因素的因果推斷具有獨特的優(yōu)點。全基因組關(guān)聯(lián)分析 (GWAS)的成熟發(fā)展，為MR研究的開展奠定了基礎(chǔ)，亦為研究復雜疾病的發(fā)生發(fā)展機制打開了新的大門[8]。

1 方法

1.1 研究設(shè)計 本研究采用MR研究方法，以基因工具變量探討出生體重與兒童肥胖的因果關(guān)聯(lián)。以早期生長遺傳學聯(lián)盟(EGG)公開發(fā)表的基因數(shù)據(jù)為參考依據(jù)，篩選出與出生體重的關(guān)聯(lián)有統(tǒng)計學意義的SNP作為工具變量[10-11]，借助篩選出的SNP, 通過不同的MR方法來判斷出生體重與兒童肥胖的因果關(guān)聯(lián)[12-14]。

圖1 孟德爾隨機化應(yīng)用模型示意圖

1.2 GWAS相關(guān)數(shù)據(jù)的來源和獲取 EGG能夠提供全基因組薈萃分析的摘要數(shù)據(jù)，包括相關(guān)染色體、基因組位置、效應(yīng)等位基因及基因頻率、標準誤和P值等，超過200萬種已經(jīng)通過質(zhì)量控制的數(shù)據(jù)信息。本研究使用的GWAS結(jié)局變量的數(shù)據(jù)來自2012年Bradfield等[10]發(fā)表的關(guān)于新生兒肥胖與成人肥胖之間的遺傳性分析，新生兒體重的相關(guān)數(shù)據(jù)來自2016年Horikoshi等[11]發(fā)表的關(guān)于新生兒體重的文獻。數(shù)據(jù)獲取時間為2018年10月20日。

在數(shù)據(jù)獲取和分析過程中，借助MR-base平臺，得以在不直接獲取數(shù)據(jù)的前提下進行MR研究。MR-base平臺(http://www.mrbase.org)是由布里斯托大學醫(yī)學研究理事會(MRC)下屬綜合流行病學部門開發(fā)的關(guān)于MR數(shù)據(jù)庫和分析的計算機程序和在線平臺[15]。MR-base平臺可以使MR研究過程實現(xiàn)自動化，減少人為錯誤的風險，使得研究結(jié)果更為可靠。

1.3 篩選出生體重相關(guān)的SNP 參考文獻[16]，設(shè)置篩選參數(shù)為P<5×10-8、連鎖不平衡r2<0.1，篩選出與出生體重達到基因組顯著性相關(guān)的SNP,將其作為工具變量代替臨床風險暴露因素出生體重。

1.4 兒童肥胖的定義 參考文獻[17]，兒童肥胖定義為0～18歲按不同性別年齡別BMI≥P95[17]。

1.5 數(shù)據(jù)分析 ①通過將SNP-出生體重關(guān)聯(lián)與SNP-兒童肥胖關(guān)聯(lián)回歸，計算SNP比率估計的IVW均值[12]。②使用加權(quán)中值方法估計影響效應(yīng)，計算出所有被選擇的SNP的比率估計的加權(quán)經(jīng)驗分布函數(shù)[13]。加權(quán)中值方法允許效應(yīng)較強的SNP對因果估計作出更多的貢獻，在較少SNP成為有效的工具時也能減少因果效應(yīng)估計的偏倚。③進行MR-Egger分析[14]。該方法假設(shè)水平多變性與SNP暴露效應(yīng)無關(guān)(即Inside假設(shè))，允許在所有SNP的回歸和不平衡的水平多變性中有1個非零的截距。MR-Egger回歸是SNP-兒童肥胖風險與SNP-出生體重效應(yīng)估計的加權(quán)線性回歸。MR-Egger能夠在所有SNP都是無效的工具時提供有效的因果效果評估。所有結(jié)果以O(shè)R及其95%CI表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。為了實現(xiàn)統(tǒng)計分析結(jié)果的可視化，直觀展示每個SNP的統(tǒng)計效應(yīng)，利用MR-base平臺數(shù)據(jù)分析功能繪制SNP相關(guān)的出生體重與兒童肥胖風險的森林圖及散點圖。

2 結(jié)果

2.1 出生體重相關(guān)的SNP篩選結(jié)果 本研究中新生兒體重的相關(guān)數(shù)據(jù)來自文獻[11]，包含有26 836名新生兒體重數(shù)據(jù)[11]。以P<5×10-8、連鎖不平衡r2<0.1為篩選參數(shù)共篩選到33個SNP,分別為rs2131354、rs13266210、rs10818797、rs2306547、rs72833480、rs17034876、rs12543725、rs2497304、rs35261542、rs6016377、rs134594、rs900399、rs1415701、rs11720108、rs740746、rs2946179、rs1819436、rs854037、rs753381、rs72480273、rs113086489、rs10872678、rs1351394、rs10935733、rs4144829、rs7575873、rs798498、rs3780573、rs1411424、rs2473248、rs7998537、rs11765649和rs7964361。

2.2 出生體重對兒童肥胖的影響效應(yīng) 共納入5 530例肥胖兒童和8 318名正常兒童。IVW分析：OR=1.79,95%CI：1.29～2.47，P=4.24×10-4；加權(quán)中值法：OR=1.30,95%CI：0.81～2.08，P=0.27)；MR-Egger法：OR=1.73,95%CI：0.58～5.20，P=0.36)。

森林圖(圖2)顯示，IVW方法分析時兒童肥胖的遺傳易感性與出生體重水平有關(guān)。rs7964361、rs11765649、rs3780573和rs1351394的分析均表明出生體重與兒童肥胖的關(guān)聯(lián)有統(tǒng)計學意義。

與出生體重相關(guān)的SNP及其兒童肥胖風險的散點圖見圖3，根據(jù)直線斜率判斷，IVW法、MR-Egger法和加權(quán)中值法的因果關(guān)聯(lián)估計相近。

圖2 SNPs與出生體重及新生兒肥胖風險的森林圖

注 黑點代表出生體重中標準差(SD)增加的兒童肥胖對數(shù)OR，OR是使用每個SNP作為單獨工具變量產(chǎn)生的。紅點顯示不同的MR方法對所有SNP組合的因果估計。水平線段為95%CI

圖3 SNPs與出生體重及新生兒肥胖風險的關(guān)聯(lián)及合并效應(yīng)

注 X軸(SD單位)代表SNP對出生體重的影響，Y軸(log OR)表示SNP對兒童肥胖的影響。每個黑點代表單獨的SNP，線段表示95%CI。3條直線的斜率對應(yīng)于3種MR方法的因果估計，淺藍線為IVW法，深藍線為MR-Egger法，綠線為加權(quán)中值法

3 討論

本研究以出生體重相關(guān)的SNP為工具變量，代替臨床風險暴露因素出生體重，通過MR方法分析了出生體重及兒童肥胖發(fā)生風險的關(guān)系，共篩選到33個與出生體重相關(guān)的SNP，其中4個SNP表明出生體重與兒童肥胖有顯著的因果關(guān)聯(lián)。出生體重高的人群發(fā)生兒童肥胖的風險較高，每增加1個升高出生體重含量的等位基因，兒童肥胖的發(fā)生風險增加79%(OR=1.79)。

以往有多項傳統(tǒng)流行病學研究報道了出生體重和兒童肥胖之間的關(guān)系，多數(shù)都顯示出生體重與兒童肥胖風險之間存在顯著的正相關(guān)。丹麥1項基于人群的隊列研究表明，出生體重≥4.0 kg與3.0～3.5 kg相比，6～13歲時兒童發(fā)生肥胖的風險增加[18]。1項中國的隊列研究發(fā)現(xiàn)，出生體重>3 500 g較3 000～3 249 g，3～6歲時超重的比例升高[19]。含26個國家、66項研究的Meta分析表明，與正常出生體重(2 500～4 000 g)相比，高出生體重(>4 000 g)與兒童超重的可能性正相關(guān)(OR=1.66; 95%CI：1.55～1.77)[20]。另1項來自中國的研究調(diào)查了出生體重與3～6歲兒童肥胖風險之間的關(guān)系，當出生體重≥3 000 g時，兒童期超重和肥胖的OR值顯著增加[21]。然而，上述研究的結(jié)果能否真正反映出生體重與兒童肥胖之間存在因果關(guān)聯(lián)，仍不明確，流行病學研究中固有的偏倚也可能導致這種結(jié)果。

近年來，隨著MR研究的發(fā)展，對于兒童肥胖的危險因素有了進一步認識。Richmond等[22]通過研究4 296名11歲兒童的BMI、活動水平和相關(guān)基因型數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)兒童肥胖與身體鍛煉存在雙向的因果關(guān)系, 肥胖的增加導致兒童體力活動的減少，較低的體力活動也導致肥胖的增加；Eric等[9]整合4 000多個父母及其后代組成的隊列的相關(guān)遺傳數(shù)據(jù)，通過MR分析進行因果推斷，發(fā)現(xiàn)孕婦高血糖可能是后代兒童肥胖的重要危險因素；Censin等[23]通過EEG數(shù)據(jù)庫篩選了與兒童肥胖相關(guān)的SNP，并探究其與1型糖尿病的關(guān)聯(lián)。但目前尚無有關(guān)出生體重與兒童肥胖的MR研究的文獻發(fā)表。

本研究分別使用IVW法、加權(quán)中值法和MR-Egger法分析了出生體重與兒童肥胖的關(guān)聯(lián)。IVW法分析顯示，出生體重與兒童肥胖具有較強的相關(guān)性(OR=1.79,95%CI：1.29～2.47，P<0.001)，但其他兩種方法分析均發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這3種方法均為MR研究的常用方法，每種方法在因果效應(yīng)估計的一致性和檢驗效能各有優(yōu)劣及無法驗證的假設(shè)條件[24]，發(fā)現(xiàn)因果效應(yīng)的效能亦有所差別。IVW法發(fā)現(xiàn)因果效應(yīng)的效能高于加權(quán)中值法和MR-Egger分析，但由于IVW法所依賴的假設(shè)條件較強，致使其進行因果效應(yīng)估計的I類錯誤率及得到因果效應(yīng)的估計值的偏倚都有所增加。MR-Egger法受Inside假設(shè)的影響較大，當滿足其假設(shè)時，因果效應(yīng)估計的I類錯誤率和基因多效性效應(yīng)的偏倚都能得到很好的控制；一旦違背Inside假設(shè)，其檢驗效能受到很大的影響[25]。加權(quán)中值法相比其他兩種方法并無太大的特色，但在違背Inside假設(shè)時，如果無效的工具變量不是太多，其表現(xiàn)優(yōu)于其他兩種方法[13]。這3種統(tǒng)計學方法各有優(yōu)劣，且由于GWAS相關(guān)數(shù)據(jù)的限制，部分假設(shè)條件無法驗證(如Inside假設(shè))。因此，本研究得到的因果關(guān)聯(lián)還需要進一步的證據(jù)支撐。

與其他研究相比，本研究的優(yōu)勢在于：①MR設(shè)計可以防止傳統(tǒng)觀察性研究中因為固有的混雜因素導致的反向因果關(guān)系；②研究樣本較大，統(tǒng)計效應(yīng)增加，效果估計相對更準確；本研究的局限性：①使用來自EGG研究的公共數(shù)據(jù)，納入的研究人群主要來自歐美國家，研究結(jié)論是否適用于中國人群，有待普遍性驗證；②無法直接獲得患兒所在研究隊列的數(shù)據(jù)，因此無法進行相關(guān)的亞組分析研究；③新生兒體重與兒童肥胖之間潛在的生物學機制仍未完全明確，通過MR方法僅能對其因果關(guān)系做出初步判斷。