核轉(zhuǎn)運蛋白基因2在265例上尿路尿路上皮癌中的表達及其與預后的關系

魏正茂，范龍龍，李維清 ，歐龍華，王 燕，李學松，周利群，史本濤

(1.北京大學深圳醫(yī)院泌尿外科，廣東深圳 518036；2.中山大學第八附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東深圳 518033；3.深圳大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東深圳 518035；4.深圳北京大學香港科技大學醫(yī)學中心，廣東深圳 518036；5.北京大學第一醫(yī)院泌尿外科,北京大學泌尿外科研究所,北京 100034)

上尿路尿路上皮癌(the upper tract urothelial carcinoma，UTUC)指發(fā)生于腎盂及輸尿管的尿路上皮惡性腫瘤，約占全部尿路上皮癌5%～10%，而且90%以上UTUC源自于移行上皮，是臨床上相對少見但潛在致死率較高的惡性腫瘤[1-2]。根治性腎盂輸尿管切除術(radical nephroureterectomy，RNU)是治療UTUC的手術金標準，然而術后仍有部分患者病情繼續(xù)進展，出現(xiàn)復發(fā)，最終導致治療失敗。因此，UTUC的早期診斷和整個尿路的長期密切隨訪尤為重要，尋找一個更能準確反映UTUC生物學特性及疾病預后的分子標記物對UTUC患者預后的判斷及術后治療方式的選擇具有重要的臨床應用價值。

核轉(zhuǎn)運蛋白基因2(karyopherin a2，KPNA2)是一種具有核定位信號區(qū)域的接頭蛋白，作為核孔靶向復合物的組成部分，與核定位信號結(jié)合運輸?shù)鞍踪|(zhì)進入核內(nèi)發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)效應基因的表達，與細胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關[3]。我們的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KPNA2能夠促進膀胱癌細胞的增殖和侵襲，且KPNA2異常高表達與膀胱癌患者的不良預后有關[4-5]。然而，KPNA2在上尿路尿路上皮癌中的表達水平及其具體的作用尚未清楚。因此，本研究通過檢測KPNA2在上尿路尿路上皮癌組織中的表達水平，探討其與UTUC患者臨床病理參數(shù)及預后之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料152例上尿路尿路上皮癌組織及其對應的癌旁正常上尿路上皮組織石蠟切片，均取自2002年1月至2010年12月期間在北京大學第一醫(yī)院泌尿外科行根治性患側(cè)腎、輸尿管全長、膀胱袖狀切除手術所得標本。根據(jù)實驗設計，參照國內(nèi)學者胥維勇等[6]的方法，在北京大學第一醫(yī)院病理科制作完成19個組織微陣列蠟塊，共計380個位點(每個蠟塊取2個位點)。包含120例上尿路尿路上皮癌組織的商品化組織芯片(產(chǎn)品編碼：HRaU-Uro120Sur-01)，購于上海芯超生物科技有限公司。

在全部272例上尿路尿路上皮癌患者中，腎盂癌167例，輸尿管癌105例。年齡分布為 29～86歲，平均(64.59±12.37)歲。隨訪時間12～108個月，平均36個月。所有患者臨床資料完整，術前均未接受任何化療或者放療，術后病理證實均是上尿路移行細胞癌。腫瘤分期依據(jù)2010年國際抗癌協(xié)會TNM 分期標準(第7版)，腫瘤分級采用1973年WHO標準。本研究得到了醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準通過(批準號：2014-113)。

1.2 主要試劑和儀器KPNA2兔抗人多克隆抗體(ab84440)購自英國Abcam公司。即用型SP系列免疫組織化學檢測試劑盒(SP-9001)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。10%正常山羊血清、一抗稀釋液、中性樹膠、蘇木素染液、EDTA抗原修復液、10%甲醛和1%鹽酸乙醇購自北京中杉金橋生物技術有限公司。組織芯片制作儀、石蠟切片機購自德國Leica公司。

1.3 實驗方法嚴格按照免疫組化二步法操作說明進行實驗：將組織芯片采用二甲苯脫蠟，梯度乙醇逐級水化。3%H2O2室溫孵育10～15 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。pH值8.0的EDTA抗原修復液高溫加熱修復抗原。加1∶1 600稀釋的KPNA2抗體4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗3次，10 min/次。加入帶有生物素標記的二抗(1∶5000)，37 ℃孵育40 min。加入鏈霉素抗生物蛋白一過氧化物酶溶液，37 ℃孵育35 min，再次PBS洗3次，10 min/次。加入二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)試劑，顯微鏡下觀察并及時終止反應。蘇木素復染，1%鹽酸乙醇分化，溫水返藍。常規(guī)乙醇梯度脫水、透明、中性膠封片。置于光學顯微鏡下分析染色結(jié)果。以PBS代替一抗作陰性對照，以試劑盒陽性片作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判定所有病理染色標本均由2名病理醫(yī)師盲法閱片，每張組織切片隨機選取10個高倍視野并計數(shù)(×400)。判斷標準：KPNA2陽性染色表現(xiàn)為細胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。依據(jù)染色的強度和陽性百分比評定分數(shù)。

染色強度(I)評分：0分指無色，1分指淡黃色，2分指棕黃色，3分指棕褐色。陽性細胞所占的百分比計算分數(shù)(P)：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分,>50%為3分。采用積分法，即總的評分按照P×I計算，乘積≥4分為高表達，<4分為低表達。

2 結(jié) 果

2.1 KPNA2蛋白在上尿路尿路上皮癌和癌旁組織中的表達在152例上尿路尿路上皮癌及其對應的癌旁組織的組織芯片免疫組化結(jié)果中，有6例癌組織切片脫片，最終得到146例上尿路尿路上皮癌和配對癌旁組織的免疫組化結(jié)果。在120例UTUC商品化的組織芯片免疫組化結(jié)果中，有1例癌組織脫片，最終得到119例上尿路尿路上皮癌組織的免疫組化結(jié)果?？傆嫬@得265例上尿路尿路上皮癌組織的免疫組化結(jié)果和146例癌旁組織的免疫組化結(jié)果。

免疫組化結(jié)果顯示，KPNA2蛋白染色主要定位于細胞核，陽性細胞呈棕黃色或棕褐色顆粒(圖1A、1B)。在265例癌組織標本中，高表達數(shù)為197例；在146例癌旁組織標本中，高表達數(shù)為36例。KPNA2蛋白在上尿路尿路上皮癌組織中的高表達率(74.34%)明顯高于其對應的癌旁組織中的高表達率(24.66%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

表1 UTUC和癌旁組織中KPNA2蛋白的表達水平比較

圖1 KPNA2蛋白在UTUC和正常上尿路上皮組織中的表達(×200)

A:UTUC組織；B：正常上尿路上皮組織。

2.2 KPNA2蛋白表達與UTUC患者臨床病理參數(shù)之間的關系通過對KPNA2蛋白的表達水平與患者的臨床病理參數(shù)進一步研究分析發(fā)現(xiàn)：UTUC患者癌組織中KPNA2蛋白表達水平與患者T分期(P=0.000)、G分級(P=0.033)和術后有無膀胱復發(fā)(P=0.004)有關，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而與患者的年齡(P=0.265)、性別(P=0.312)、腫瘤大小(P=0.582)和腫瘤邊側(cè)(P=0.386)無關，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。

表2 KPNA2蛋白表達與UTUC患者臨床病理參數(shù)之間的關系

2.3KPNA2蛋白表達與UTUC患者生存率之間的關系 共隨訪265例患者，其中失訪1例，在264例UTUC患者中，KPNA2高表達患者5年總體生存率為64.80%(127/196),明顯低于KPNA2低表達患者5年總體生存率80.88%(55/68),統(tǒng)計分析證實,KPNA2的表達水平與患者的預后有統(tǒng)計學意義(P=0.014,圖2)。

圖2 KPNA2蛋白表達水平與UTUC患者生存率之間的關系

3 討 論

KPNA2(karyopherin a2)基因位于人染色體17q24.2，全長約14 459 bp，其編碼產(chǎn)物是含529個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為62 ku。KPNA2蛋白是karyopherin a/importin a輸入蛋白家族一員[7-8]，作為生物大分子物質(zhì)核質(zhì)轉(zhuǎn)運過程中一種重要的核轉(zhuǎn)運受體蛋白，在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中高表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，而且與患者的不良預后有關[9-14]。目前，國內(nèi)外文獻中尚無關于KPNA2在上尿路尿路上皮癌的研究報告，因此，探討KPNA2在UTUC中的表達水平、臨床意義及其對腫瘤細胞生物學行為的影響，可為UTUC發(fā)病機理的闡述、早期診斷、以及預后評估提供新思路。

本研究使用組織芯片和免疫組織化學方法檢測265例UTUC組織和146例癌旁正常尿路上皮組織中KPNA2的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KPNA2蛋白主要定位在細胞核中，與其他惡性腫瘤中的表達情況相似[9-10]。KPNA2蛋白高表達率在UTUC組織標本中為74.34%，在癌旁組織標本中為24.66%,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示KPNA2的異常表達可能與UTUC發(fā)生、發(fā)展有關。

根據(jù)實驗結(jié)果接下來分析了KPNA2蛋白表達與UTUC臨床病理特征之間的關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KPNA2在UTUC組織中的表達與患者的T分期、G分級和術后膀胱復發(fā)有關，與患者的年齡(P=0.265)、性別(P=0.312)、腫瘤大小(P=0.582)和腫瘤邊側(cè)(P=0.386)無關。KPNA2的表達強度隨著T分期的增高和組織分化程度的變化呈現(xiàn)逐漸高表達趨勢,提示KPNA2在UTUC腫瘤進展、晚期浸潤和轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果與KPNA2在其他腫瘤中的研究結(jié)果相似,2007年DANKOF等[15]對浸潤性乳腺癌、癌旁正常組織和乳腺導管原位癌癌組織進行免疫組化實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KPNA2的表達與腫瘤的分級、分期及淋巴管浸潤呈正相關，提示KPNA2與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有重要關系。2012年SAKAI[16]運用免疫組織化學方法研究了116例食管癌患者的KPNA2的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KPNA2的高表達與腫瘤的低分化、靜脈侵犯、腫瘤分期正相關。

2012年HE等[17]發(fā)現(xiàn)在卵巢生殖細胞腫瘤中，KPNA2的表達水平明顯升高，與腫瘤的病理類型和復發(fā)率正相關，與5年總體生存率和無疾病進展存活率有關，是一個獨立的預測因素。2011年丹麥學者JENSEN等[18]研究了KPNA2基因在肌肉非浸潤性膀胱癌和肌肉浸潤性膀胱癌中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Ta、T1期腫瘤中，KPNA2的高表達預示較高的疾病進展的風險，在肌肉浸潤性膀胱癌患者中，高表達的KPNA2往往提示患者行根治性手術后有較差的預后。本研究運用Kaplan-Meier法和對數(shù)秩檢驗(Log-ranktest)進行生存分析，發(fā)現(xiàn)KPNA2低表達組5年總體生存率(88.2%)明顯高于KPNA2高表達組(77.3%，P=0.005)，推測KPNA2的表達水平同樣可預測UTUC患者預后。目前關于KPNA2與腫瘤關系的研究多數(shù)是有關臨床病理特征或預后關系的研究，涉及KPNA2促進腫瘤進展的機制研究較少。2016年TSAI等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-26b通過KPNA2/c-jun途徑可抑制胃癌細胞遷移和侵襲，提出miR-26b過表達或KPNA2/c-jun抑制可能具有抑制胃癌轉(zhuǎn)移的治療潛力。

綜上所述，KPNA2在UTUC組織中高表達，與UTUC患者的T分期、G分級和術后膀胱復發(fā)有關，而且影響患者的5年生存率。提示KPNA2可作為UTUC患者早期診斷和預后評估的潛在生物標志物。