朱娟， 陳鑫蘋， 胡俊杰， 徐衛(wèi)華， 李曉娟， 馬志超， 張繼業(yè)， 周紅桃, 符生苗

1海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院(海南?？?570228)； 2海南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心、海南省細(xì)胞與分子遺傳轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(海南海口 570311)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是由鼻咽上皮細(xì)胞引起的頭頸部最常見的惡性腫瘤，它也是東亞和東南亞最常見的癌癥之一[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)NPC的發(fā)生與其遺傳因素、環(huán)境因素及EB病毒感染有關(guān)[2-5]。但具體的發(fā)病機(jī)制研究尚不透徹?，F(xiàn)代分子生物學(xué)研究認(rèn)為，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展都與其相關(guān)的某些抑癌基因的失活，原癌基因的激活等密切相關(guān)。Survivin是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的IAPs蛋白，屬于凋亡抑制因子，凋亡抑制作用最強(qiáng)。在NPC組織中，研究者們發(fā)現(xiàn)Survivin基因的mRNA和蛋白質(zhì)均為高表達(dá)。它主要通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡及細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程等來(lái)調(diào)控細(xì)胞的凋亡，并且與NPC患者的預(yù)后密切相關(guān)[6-7]。PI3K/AKT 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一條重要通路。激活的PI3K 經(jīng)多種途徑引起AKT 突變而使細(xì)胞失去正常的生理功能，抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8]。在NPC細(xì)胞中，信號(hào)通路PI3K/AKT多被過(guò)度激活。PTEN基因位于10q23.3染色體上，是一種重要的抑癌基因。它主要參與調(diào)控DNA修復(fù)、細(xì)胞周期進(jìn)程(包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、衰老、凋亡)及基因突變等相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。抑癌基因 PTEN 對(duì) PI3K/AKT 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)作用，當(dāng)PTEN 發(fā)生突變或缺失，使其喪失對(duì)AKT 的調(diào)節(jié)能力時(shí)，細(xì)胞增殖會(huì)失去控制，極易向癌變的方向發(fā)展[9]。在NPC細(xì)胞中，PTEN是多個(gè)細(xì)胞因子的直接靶點(diǎn)，通過(guò)細(xì)胞因子自身的表達(dá)，來(lái)調(diào)控PTEN在NPC細(xì)胞中對(duì)信號(hào)通路PI3K/AKT的抑制作用，從而導(dǎo)致NPC的發(fā)生與發(fā)展[10-12]?；谇捌谠贜PC細(xì)胞中對(duì)Survivin研究的基礎(chǔ)，2017年12月至2018年10月本文通過(guò)調(diào)節(jié)NPC CNE-2細(xì)胞內(nèi)Survivin的表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路PTEN/PI3K/AKT各因子的mRNA及蛋白水平的變化情況，并且對(duì)NPC CNE-2細(xì)胞增殖及凋亡的影響，了解NPC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中Survivin是否對(duì)信號(hào)通路PTEN/PI3K/AKT有直接調(diào)控作用，為進(jìn)一步對(duì)NPC早期診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)提供新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 NPC CNE-2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 試劑 胎牛血清(天津?yàn)笕A科生物)；MEM 培養(yǎng)基(gibco)；riboFECT CP 轉(zhuǎn)染試劑盒(銳博生物)；EASYspin Plus 組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒(艾德萊生物)；RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit,ECL-PLUS/Kit和Real-Time PCR反應(yīng)試劑盒(Thermo)；超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒和UNIQ-500無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒(上海生工)；RIPA裂解液和BCA Protein Assay Kit (碧云天)；NP-40裂解液 (上海鼎國(guó)生物)。

1.3 siRNA 序列的合成 根據(jù)Survivin gene ID：332 和siRNA 的設(shè)計(jì)原則，由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成siRNA序列：Survivin siRNA Forward：5′-GCAAAGGAAACCAACAAUAUU-3′，Reverse：5′-UAUUGUUGGUUUCCUUUGCUU-3′。

1.4 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成提供。目的基因：BIRC5 (NM_001168)，物種：Human，載體名稱：GV230，元件順序：CMV-MCS-EGFP-SV40-Neomycin，克隆位點(diǎn)：XhoI/KpnI。

1.5 感受態(tài)細(xì)胞的制備 將大腸桿菌菌種利用平板劃線法活化后，挑取單一菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，37℃搖床振蕩培養(yǎng)12 h后按照說(shuō)明書要求制備感受態(tài)細(xì)胞。

1.6 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及提取 將構(gòu)建好的含有目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞后，先在不含抗生素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行37℃緩慢振蕩培養(yǎng)60 min，取適量菌液涂布至與目的質(zhì)?？剐韵鄳?yīng)的LB平板上進(jìn)行篩選，37℃倒置培養(yǎng)14 h。從LB平板上挑取單個(gè)菌落接種于含有抗生素的液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)14 h。按照UNIQ-500無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的抽提。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng) CNE-2 細(xì)胞用含 10%胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)基，置于 37℃，5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和傳代。

1.8 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分兩大組7小組，第一組包括空白對(duì)照組，抑制陰性對(duì)照組，Survivin抑制組3個(gè)小組。CNE-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 d，消化，制細(xì)胞懸液后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度約為 5×105細(xì)胞 /mL，并接種于 6 孔板中。次日 CNE-2 細(xì)胞融合度達(dá)到 60%～80%時(shí)，按 ribo FECTTM CP 轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。第二組包括空白對(duì)照組，過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組，脂質(zhì)體組(Lipofectamine 2000)，Survivin過(guò)表達(dá)組(Lipofectamine 2000+質(zhì)粒)4個(gè)小組。轉(zhuǎn)染前1 d，消化，制備細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105細(xì)胞/mL并接種于6 孔板中。次日細(xì)胞融合度達(dá)到60%～80%時(shí)，按Lipofectamine 2000使用說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.9 CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性 實(shí)驗(yàn)分兩大組7小組，每一小組均準(zhǔn)備6塊6孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染。第一組(空白對(duì)照組，抑制陰性對(duì)照組，Survivin抑制組)轉(zhuǎn)染步驟同上第一組。第二組(空白對(duì)照組，脂質(zhì)體組，過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組，Survivin過(guò)表達(dá)組)轉(zhuǎn)染步驟同上第二組。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞培養(yǎng)到12、24、36、48、60、72 h時(shí)分別對(duì)其中一個(gè)6孔板進(jìn)行消化，制備細(xì)胞懸液，接種于96孔板中。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)(37℃，5%CO2),12 h時(shí)每孔加入10 μL CCK溶液再孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值。

1.10 RT-PCR檢測(cè)Survivin、PI3K、PTEN、AKT利用EASYspin Plus 組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒提取

細(xì)胞總RNA，按RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。采用PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中Survivin、PI3K、PTEN、AKT各組 mRNA的表達(dá)。

1.11 Western blot 分析 提取物經(jīng)PBS洗滌兩次后，適量預(yù)冷的2×Lysis Buffer裂解，細(xì)胞刮刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移入EP管中，冰上裂解10～15 min后超聲破碎細(xì)胞，4℃ 12 000×g離心15 min，取上清用BCA法測(cè)定蛋白濃度。調(diào)整每個(gè)樣品蛋白濃度為2 μg/μL進(jìn)行sps-page 電泳。電泳結(jié)束后在4℃ 300 mA恒流條件下電轉(zhuǎn)150 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進(jìn)行抗體雜交，經(jīng)一抗、二抗孵育后X光顯影進(jìn)行分析。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD方法進(jìn)行兩兩比較，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建完成 將目的基因轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞后，進(jìn)行菌落PCR鑒定重組克隆(圖1)，將鑒定出的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子接種于適量含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～16 h，取適量菌液進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果與目的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。比對(duì)結(jié)果說(shuō)明：測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致。見圖2。

1：陰性對(duì)照組(ddH2O)；2：陰性對(duì)照組(空載自連對(duì)照組)；3：陽(yáng)性對(duì)照組(GAPDH)；4：Marker自上而下依次為5 kb，3 kb，2 kb，1.5 kb，1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp；5～12:1～8號(hào)轉(zhuǎn)化子

圖1PCR鑒定重組克隆鑒定

2.2 CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性 抑制組細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯下降，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯上升，陰性對(duì)照組，脂質(zhì)體組與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖2 質(zhì)粒構(gòu)建測(cè)序圖

CON：空白對(duì)照組;NC-KD：抑制組陰性對(duì)照;KD：抑制組;NC-OE：過(guò)表達(dá)組陰性對(duì)照 OE：過(guò)表達(dá)組

圖3細(xì)胞各時(shí)間段的活性曲線

2.3 CNE-2細(xì)胞中Survivin、PI3K、PTEN、AKT 各mRNA的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，Survivin抑制組的mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P<0.05)、PI3K(P<0.05)、AKT(P<0.05)， 與PTEN mRNA 的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)；Survivin過(guò)表達(dá)組mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增高(P<0.05)、AKT(P<0.05)，與PI3K和PTEN各mRNA的相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05)。Survivin抑制組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較Survivin mRNA 表達(dá)抑制率為(41.9±6.9)%(P<0.01)，PI3K mRNA 表達(dá)抑制率為(43.3±7.2)%(P<0.01)，AKT mRNA 表達(dá)抑制率為(38.7±4.1)%(P<0.01)，PTEN mRNA表達(dá)抑制率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Survivin過(guò)表達(dá)組Survivin mRNA 過(guò)表達(dá)率為(203.8±17.1)%(P<0.01)，AKT mRNA 過(guò)表達(dá)率為(239.0±34.2)%(P<0.01)，PTEN mRNA和PI3K mRNA表達(dá)抑制率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組Survivin、PTEN、PI3K、AKT mRNA 相對(duì)表達(dá)量見表1～3。

組別Survivin mRNA空白對(duì)照組1.129±0.206陰性對(duì)照組1.103±0.166Survivin抑制組0.419±0.069?

*與空白對(duì)照組比較P<0.01

組別Survivin mRNA空白對(duì)照組1.086±0.073陰性對(duì)照組1.081±0.214空載體轉(zhuǎn)染組0.953±0.274Survivin過(guò)表達(dá)組2.038±0.171?

*與空白對(duì)照組比較P<0.01

2.4 CNE-2 細(xì)胞中 Survivin、PI3K、PTEN、AKT、p-AKT各蛋白表達(dá)情況 Western blot 與灰度分析，用NC校正后的相對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Survivin抑制組的Survivin、PTEN、p-AKT蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照與陰性對(duì)照無(wú)明顯差異,Survivin、PI3K、AKT蛋白水平較空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組明顯下降；Survivin過(guò)表達(dá)組，PTEN、PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組無(wú)明顯差異，Survivin、AKT蛋白水平較空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組，明顯上升。各組Survivin、PTEN、PI3K、AKT、p-AKT Western bolt結(jié)果灰度分析見表4、圖4～7。

組別PTEN mRNAPI3K mRNAAKT mRNA空白對(duì)照組1.005±0.0350.950±0.0750.930±0.061陰性對(duì)照組(抑制組)1.058±0.0450.873±0.0841.192±0.192Survivin抑制組1.139±0.1520.433±0.072?0.387±0.041?陰性對(duì)照(過(guò)表達(dá)組)1.017±0.0991.232±0.1791.038±0.280Survivin過(guò)表達(dá)組0.947±0.2030.975±0.0312.390±0.342?

*與空白對(duì)照組比較P<0.01

表4 用NC校正的各組相對(duì)定量結(jié)果

CON：空白對(duì)照組;NC-KD：抑制組陰性對(duì)照;KD：抑制組;NC-OE：過(guò)表達(dá)組陰性對(duì)照;OE：過(guò)表達(dá)組

3 討論

NPC是最常見的頭頸部惡性腫瘤，其發(fā)病率位居頭頸部腫瘤之首，死亡率也居于前列[13]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，2012年全球范圍內(nèi)NPC新發(fā)病例數(shù)為8.7萬(wàn)人，占當(dāng)年所有癌癥新診斷病例數(shù)的 0.6%，估計(jì)死亡人數(shù)達(dá) 5.1萬(wàn)人，占當(dāng)年所有癌癥死亡人數(shù)的 0.6%[14]。根據(jù)我國(guó)流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，2013年中國(guó)NPC新發(fā)病例及死亡病例分別為42 100人、21 320人，分別占當(dāng)年癌癥新發(fā)人數(shù)及死亡人數(shù)的1.14%及 0.96%，初發(fā)病率及死亡率分別為 3.09/10 萬(wàn)及 1.57/10 萬(wàn)[15]。NPC還具有種族差異和地域分布差異，其主要發(fā)生于東亞、東南亞及北非國(guó)家，我國(guó)主要分布在廣東、廣西、海南、湖南和福建五省。Huang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，NPC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中遺傳因素占61.3%，共同環(huán)境因素占13.9%，非共同環(huán)境因素為24.8%，NPC散發(fā)的概率為82.8%。遺傳因素致使NPC發(fā)生占了很重要的位置。這項(xiàng)研究也說(shuō)明，NPC的發(fā)生、發(fā)展是多因素參與的一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程。近年NPC相關(guān)基因的研究成為了新的熱點(diǎn)，這也為NPC的早期診斷及治療尋找新的靶點(diǎn)及方法。

CON：空白對(duì)照組; NC-KD：抑制組陰性對(duì)照; KD：抑制組; NC-OE：過(guò)表達(dá)組陰性對(duì)照; OE：過(guò)表達(dá)組

圖4Survivin、PTEN、PI3K、AKT、p-AKT Western bolt結(jié)果

CON：空白對(duì)照組;NC-KD：抑制組陰性對(duì)照;KD：抑制組;NC-OE：過(guò)表達(dá)組陰性對(duì)照;OE：過(guò)表達(dá)組

圖5用NC矯正Survivin相對(duì)定量結(jié)果

CON：空白對(duì)照組;NC-KD：抑制組陰性對(duì)照;KD：抑制組;NC-OE：過(guò)表達(dá)組陰性對(duì)照;OE：過(guò)表達(dá)組

圖6用NC矯正PTEN相對(duì)定量結(jié)果

CON：空白對(duì)照組;NC-KD：抑制組陰性對(duì)照;KD：抑制組;NC-OE：過(guò)表達(dá)組陰性對(duì)照;OE：過(guò)表達(dá)組

圖7用NC矯正PI3K相對(duì)定量結(jié)果

CON：空白對(duì)照組;NC-KD：抑制組陰性對(duì)照;KD：抑制組;NC-OE：過(guò)表達(dá)組陰性對(duì)照;OE：過(guò)表達(dá)組

圖8用NC矯正AKT相對(duì)定量結(jié)果

CON：空白對(duì)照組;NC-KD：抑制組陰性對(duì)照;KD：抑制組;NC-OE：過(guò)表達(dá)組陰性對(duì)照;OE：過(guò)表達(dá)組

圖9用NC矯正p-AKT相對(duì)定量結(jié)果

Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的成員之一，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最有效的抗凋亡因子[17]。Survivin分子在人胚胎組織和惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，除胸腺和生殖腺外，在人類正常分化成熟的組織中監(jiān)測(cè)不到Survivin的表達(dá)。它參與抑制細(xì)胞的凋亡、調(diào)控細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤血管生成等生理過(guò)程，并在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)[18]。已有文獻(xiàn)證實(shí)NPC患者的Survivin基因其mRNA和蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)均過(guò)表達(dá)[19]。Fu等[20]在此基礎(chǔ)上通過(guò)RNA干擾技術(shù)對(duì)NPC細(xì)胞CNE-2中的Survivin進(jìn)行干擾后，Survivin在CNE-2細(xì)胞中mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)下降，同時(shí)也有效的抑制了CNE-2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。陳淑萍等[21]用聯(lián)合基因Survivin、CDK1 的shRNAs 靶向干擾NPC CNE-2細(xì)胞，證實(shí)聯(lián)合基因shRNAs 對(duì)Survivin 的表達(dá)抑制作用比單基因shRNAs 更強(qiáng)。這一系列的研究證實(shí)了Survivin 在NPC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的促進(jìn)作用，為NPC的早期診斷及預(yù)后的監(jiān)測(cè)提供了新的靶點(diǎn)。

PI3K是真核細(xì)胞膜的組成部分，是一種能夠催化磷脂酰肌醇脂類物質(zhì)的激酶。它是由一個(gè)催化亞基 P110 和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基 P85 組成的二聚體激酶。它的蛋白家族對(duì)多種細(xì)胞調(diào)控都發(fā)揮著不可替代的作用[22]。PI3K在細(xì)胞內(nèi)外溝通起橋梁的作用，AKT則是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的絲/蘇氨酸蛋白激酶，它是PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白。在PI3K/AKT信號(hào)通路中，AKT屬于中間調(diào)控環(huán)節(jié)，激活和調(diào)節(jié)許多下游分子目標(biāo)。AKT能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡而促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生[23]。在NPC細(xì)胞中，PI3K/AKT信號(hào)通路通常是被過(guò)度激活的[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用新型的 PI3K/mTOR 雙重抑制劑處理NPC細(xì)胞及裸鼠移植模型，發(fā)現(xiàn)抑制劑不僅在體內(nèi)外抑制NPC細(xì)胞增殖及PI3K/AKT/mTOR 下游信號(hào)通路，而且能夠引起NPC細(xì)胞 G1期阻滯，同時(shí)，抑制劑還可以在體內(nèi)外誘導(dǎo)NPC細(xì)胞凋亡[25]。提示PI3K/AKT信號(hào)通路是NPC治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。PTEN是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，在眾多惡性腫瘤中突變及丟失頻率很高，PTEN具備促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的雙重作用。它是PI3K/AKT 信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)器，能夠抑制PI3K/AKT的過(guò)度表達(dá)。其主要的作用是使PI3K底物去磷酸化，通過(guò)磷酸化將過(guò)量的PIP3 轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP2，抑制AKT 及其下游分子的有效活化，將細(xì)胞阻滯在G1期，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26]。Wu等[10]研究證實(shí)，PTEN在NPC細(xì)胞中是miR-222作用的直接靶點(diǎn)。Zhang等[11]研究證實(shí)，PTEN在NPC細(xì)胞中是miR-200c作用的直接靶點(diǎn)。上述研究表明，在NPC細(xì)胞中，PTEN是多數(shù)因子作用的直接靶點(diǎn)，直接影響了NPC細(xì)胞的增殖及凋亡。這些研究結(jié)果提示PTEN也可作為NPC診斷的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

鑒上研究表明，Survivin、 PTEN、 信號(hào)通路PI3K/AKT均在NPC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著非常重要的作用。在我們前期研究的基礎(chǔ)上，本研究利用RNA干擾技術(shù)和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，將設(shè)計(jì)的特異性siRNA序列和構(gòu)建成功的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒分別對(duì)NPC CNE-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，促使CNE-2細(xì)胞內(nèi)Survivin抑制及Survivin過(guò)表達(dá)，同時(shí)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Survivin、PTEN、PI3K、AKT的 mRNA表達(dá)和蛋白水平的變化情況，并觀察Survivin基因下調(diào)和上調(diào)分別對(duì)人NPC細(xì)胞CNE-2生長(zhǎng)的影響。我們利用CCK8法對(duì)不同組別的細(xì)胞活性進(jìn)行監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Survivin在CNE-2細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抑制時(shí)，CNE-2細(xì)胞活性明顯下降；Survivin在CNE-2細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)時(shí)，CNE-2細(xì)胞活性明顯上升。這一結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)染特異性siRNA Survivin在CNE-2細(xì)胞中被抑制時(shí)，能有效促進(jìn)NPC細(xì)胞凋亡，減緩腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)；Survivin在CNE-2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)，會(huì)促使正常細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展,形成無(wú)限增殖的腫瘤細(xì)胞。在人NPC CNE-2細(xì)胞中，Survivin被抑制的同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)PI3K,AKT mRNA在CNE-2細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量同時(shí)受到了抑制，但只有AKT蛋白表達(dá)水平明顯下降；Survivin在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的同時(shí)，AKT mRNA及蛋白水平在細(xì)胞中同時(shí)過(guò)量表達(dá)。這一結(jié)果說(shuō)明，在人NPC CNE-2細(xì)胞中Survivin的表達(dá)直接影響信號(hào)通路中AKT的變化，與其呈正相關(guān)，兩者變化可直接影響CNE-2細(xì)胞的增殖及凋亡，起正協(xié)同作用。因此，NPC的發(fā)生、發(fā)展是由多基因或多因子協(xié)同作用的結(jié)果，其直接的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。