孫曉梅，辛如潔，董召陽(yáng)，麻永磊，費(fèi)日雯，李雪婷

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，沈陽(yáng) 110866)

芍藥(Paeonialactiflora)是芍藥科芍藥屬的草本宿根花卉，作為中國(guó)優(yōu)良耐寒種質(zhì)資源被廣泛應(yīng)用于園林綠化中[1]。近年來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，芍藥屬的多個(gè)品種經(jīng)長(zhǎng)期的近親雜交和無(wú)性繁殖，出現(xiàn)了品種退化的現(xiàn)象[2]。在芍藥種子繁殖方面，常由于種子仍保持休眠狀態(tài)或休眠未被徹底解除而致使種子萌發(fā)率降低，對(duì)芍藥的栽培生產(chǎn)和新品種選育產(chǎn)生一定的影響[3]。目前，培育芍藥屬新優(yōu)種質(zhì)，已成為中國(guó)傳統(tǒng)花卉產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重要任務(wù)之一。

雜交是許多園林植物如丁香[4]、月季[5]、百合[6]、蘭花[7]等獲得新種質(zhì)的主要方式。國(guó)內(nèi)外芍藥屬的育種學(xué)家一直致力于用雜交技術(shù)繁育新品種，19世紀(jì)法國(guó)育種學(xué)家Victor Lemoine 雜交繁育出沿用至今的一批芍藥栽培品種，如‘Sarah Bernhardt’、‘Solange’[8]。但國(guó)內(nèi)在芍藥屬雜交育種方面仍處于探索初期，研究還未深入。肖佳佳[9]、韓麗曉[10]、劉建鑫等[11]初步研究芍藥屬部分品種的雜交親和性，宋春花[12]在細(xì)胞學(xué)層面對(duì)芍藥雜交組合的親和性進(jìn)行了探究。在長(zhǎng)期的演化進(jìn)程中，芍藥進(jìn)化出上、下胚軸雙重休眠模式，即秋季溫度下降時(shí)下胚軸伸長(zhǎng)并長(zhǎng)出胚根，在冬季低溫時(shí)打破上胚軸休眠，直至春季回暖時(shí)破土長(zhǎng)芽[13]。目前，對(duì)芍藥種子破眠技術(shù)的探究，主要集中在機(jī)械破皮、低溫處理、激素處理和溫水處理等方面[3]。

本研究選取17個(gè)不同芍藥品種，以‘粉玉奴’為母本，其余16個(gè)品種為父本，進(jìn)行組內(nèi)雜交。旨在探明其雜交親和性和結(jié)實(shí)性狀況，初步找出親和性較好的組合，為芍藥屬雜交育種的親本選配提供理論依據(jù)。通過(guò)不同處理打破下胚軸休眠的生根試驗(yàn)和不同處理打破上胚軸休眠的發(fā)芽試驗(yàn)，探究打破芍藥種子休眠技術(shù)，為芍藥實(shí)生苗和新品種的快速繁育及培育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試芍藥品種為 ‘粉玉奴’‘紅瑪瑙’‘大富貴’‘西施粉’‘紫蓮?fù)隆勖嫣一āy針繡紅袍’‘艷紫向陽(yáng)’‘烏龍?zhí)胶！t繡球’‘粉玉樓’‘少女妝’‘紅羽球’‘老來(lái)紅’‘藍(lán)田飄香’‘桃花石‘和‘楊妃出浴’共計(jì)17個(gè)品種，隔年種子(2015年采收)和當(dāng)年種子(2016年采收)。試驗(yàn)材料取自沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)芍藥資源圃。

1.2 方 法

1.2.1 芍藥品種間雜交親和性試驗(yàn) 分別在2015年和2016年集中于5月-6月期間，調(diào)查雜交親本的生長(zhǎng)狀態(tài)和開(kāi)花時(shí)間，選定花期較長(zhǎng)的‘粉玉奴’作為母本，其余16個(gè)品種作為父本進(jìn)行定向雜交。選擇蕾期的花朵進(jìn)行去雄授粉，標(biāo)明授粉日期和試驗(yàn)編號(hào)。種子成熟后，按不同雜交組合采收，統(tǒng)計(jì)各雜交組合的結(jié)子率作為雜交親和性的評(píng)判指標(biāo)。

1.2.2 芍藥雜交種子萌發(fā)生根試驗(yàn) 用0.5%的高錳酸鉀溶液對(duì)各雜交種子消毒40 min后，用蒸餾水進(jìn)行沖洗。隨后將清洗干凈的種子浸泡于45 ℃溫水中48 h，直到種子表皮出現(xiàn)軟化。將沙子浸泡于0.5%的高錳酸鉀溶液中殺菌處理1 h后沖凈，按濕沙和種子3∶1的體積比將兩者混勻后進(jìn)行室溫沙藏。觀察頻率在試驗(yàn)初期為每7 d統(tǒng)計(jì)1次，生根后每3 d統(tǒng)計(jì)1次，以60 d后統(tǒng)計(jì)的生根種子數(shù)量來(lái)計(jì)算種子的生根率。生根率=生根種子總數(shù)/供試種子總數(shù)×100%。以胚根長(zhǎng)到種子長(zhǎng)度的1/2作為生根種子的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 解除下胚軸休眠試驗(yàn) 將均勻飽滿的隔年種子和當(dāng)年種子進(jìn)行清洗消毒后，分別用質(zhì)量濃度100、300、500 mg/L 的GA3溶液和質(zhì)量濃度100、300、500 mg/L的IAA溶液浸泡芍藥種子24 h，以清水浸泡24 h作為對(duì)照。按濕沙和種子3∶1的體積比將兩者混勻后進(jìn)行室溫沙藏，期間注意將沙子的濕度維持在沙子最大持水量的50%左右。每種處理設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)選取50粒種子，60 d后統(tǒng)計(jì)生根率和霉?fàn)€率。

生根率=生根種子總數(shù)/試驗(yàn)種子總數(shù)×100%

霉?fàn)€率=霉?fàn)€種子總數(shù)/試驗(yàn)種子總數(shù)×100%

1.2.4 解除上胚軸休眠試驗(yàn) 對(duì)當(dāng)年新采收種子清洗消毒后進(jìn)行沙藏處理，待胚根長(zhǎng)達(dá)3～4 cm時(shí)取出，以4 ℃低溫沙藏0 d、10 d、20 d、30 d、40 d，和先用質(zhì)量濃度為300 mg/L 的GA3溶液浸泡芍藥生根種子4 h后再置于4 ℃低溫沙藏 0 d、10 d、20 d、30 d、40 d，以這2種方式進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。每種處理設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)選取30粒種子。觀察頻率在試驗(yàn)初期為每7 d統(tǒng)計(jì)1次，發(fā)芽后每3 d統(tǒng)計(jì)1次，在40 d后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率和霉?fàn)€率。

發(fā)芽率=發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

霉?fàn)€率計(jì)算公式同“1.2.3”。

2 結(jié)果與分析

2.1 芍藥品種間雜交組合的結(jié)子率比較

芍藥品種間的定向雜交組合共計(jì)16組，授粉1 569朵花，收獲5 663粒種子。由表1中結(jié)子情況可以看出，父本為‘紅羽球’的雜交組合結(jié)子率最高，為5.37粒/朵，兩者間雜交親和性最高；父本為‘粉面桃花’‘西施粉’和‘藍(lán)田飄香’的雜交組合，其結(jié)子率均在4粒/朵以上，親和性較高；父本為‘老來(lái)紅’的雜交組合結(jié)子率最低，為1.91 粒/朵，兩者間親和性最低。

表1 不同雜交組合結(jié)子情況Table 1 Seed ratio of different cross combinations

2.2 芍藥雜交種子生根狀況比較

用相同的處理方法將不同雜交組合獲得的 3 403粒種子進(jìn)行生根試驗(yàn)，其中生根種子數(shù)為 1 434粒，平均生根率為42.14%。由表2可以看出，父本為‘西施粉’的雜交組合種子生根率最高，為54.00%，說(shuō)明此雜交組合種子可育性最強(qiáng)；父本為‘藍(lán)田飄香’‘粉面桃花’‘艷紫向陽(yáng)’‘粉玉樓’‘大富貴’‘少女妝’和‘紅羽球’的雜交種子生根率較高，均在40.00%以上；父本為‘紅繡球’‘老來(lái)紅’‘紅瑪瑙’和‘烏龍?zhí)胶！碾s交種子生根率均在30.00%以下，尤以父本為‘烏龍?zhí)胶！碾s交種子生根率最低，僅為17.39%。

表2 雜交種子生根狀況Table 2 Condition of hybrid seeds rooting

注：每雜交組合種子沙藏300粒，不足300粒的，則全部沙藏。

Note:300 seeds of each hybrid combination are stored in sand and all of them are stored in sand in case of less than 300 seeds.

2.3 GA3處理對(duì)芍藥種子生根的影響

由表3可知，GA3處理的隔年種子和當(dāng)年種子的首次最快生根時(shí)間相較于對(duì)照組分別提前14 d和13 d；不同質(zhì)量濃度GA3處理的隔年種子和當(dāng)年種子的生根率均明顯優(yōu)于對(duì)照，尤以質(zhì)量濃度為100 mg/L GA3處理效果最佳，生根率分別為36.67%和65.33%；在種子霉?fàn)€率方面，只有質(zhì)量濃度為100 mg/L GA3處理的隔年種子的霉?fàn)€率比對(duì)照組有所降低，為18.67%，用質(zhì)量濃度為100 mg/L GA3處理的當(dāng)年種子霉?fàn)€率為9.33%。

2.4 IAA處理對(duì)芍藥種子生根的影響

從表4可知，IAA處理的隔年種子和當(dāng)年種子的首次最快生根時(shí)間相較于對(duì)照組均提前4 d；質(zhì)量濃度為100 mg/L IAA處理的隔年種子和當(dāng)年種子的生根率略高于對(duì)照組，分別為28.67%和50.00%；在種子霉?fàn)€率方面，IAA質(zhì)量濃度降低處理的隔年種子和當(dāng)年種子的霉?fàn)€率均未有對(duì)照組明顯，其中質(zhì)量濃度為100 mg/L IAA處理的當(dāng)年種子霉?fàn)€率較低，為8.00%。

2.5 不同低溫時(shí)間對(duì)芍藥種子發(fā)芽的影響

從表5可知，種子首次最快發(fā)芽時(shí)間與低溫持續(xù)時(shí)間成反比，低溫40 d處理的芍藥種子首次發(fā)芽比對(duì)照組提前37 d，且種子發(fā)芽率也提升到45.56%；低溫30 d處理芍藥種子首次發(fā)芽時(shí)間相對(duì)于對(duì)照組提前34 d，且種子發(fā)芽率最高，為57.78%；種子的霉?fàn)€率與低溫維持時(shí)間成正比，低溫40 d處理的種子霉?fàn)€率為13.33%，比低溫30 d略低一些，但總體仍表現(xiàn)為遞增的趨勢(shì)。通過(guò)以上分析可知，低溫可以有效解除芍藥種子上胚軸休眠，也可以縮短種子發(fā)芽時(shí)間，提高種子的發(fā)芽率，但霉?fàn)€率會(huì)有所升高。低溫30 d處理的芍藥種子霉?fàn)€率略高于對(duì)照，但發(fā)芽率最高，且發(fā)芽時(shí)間較短。因此，低溫30 d處理的芍藥種子發(fā)芽效果最佳。

表3 不同GA3質(zhì)量濃度處理對(duì)芍藥種子生根的影響Table 3 Influences on peony seed rooting by different GA3 mass concentrations

表4 不同IAA質(zhì)量濃度處理對(duì)芍藥種子生根的影響Table 4 Influences on peony seed rooting by different IAA mass concentrations

表5 低溫對(duì)芍藥種子發(fā)芽的影響Table 5 Influences on peony seed germination by low temperature

2.6 GA3與低溫對(duì)芍藥種子發(fā)芽的影響

由表6可知，300 mg/L GA3浸泡4 h與低溫處理相結(jié)合的方法能有效縮短首粒種子的發(fā)芽時(shí)間，并提高種子的發(fā)芽率。對(duì)照處理的發(fā)芽時(shí)間為26 d，發(fā)芽率為40.00%，低溫30 d+GA3處理的種子，首粒種子發(fā)芽時(shí)間為9 d，比對(duì)照提前 17 d，且發(fā)芽率最高，為76.67%；低溫40 d+GA3處理首粒種子發(fā)芽時(shí)間最短為7 d，比低溫0 d+GA3處理提前19 d，比低溫30 d+GA3處理提前2 d，但發(fā)芽率低于30 d+GA3處理，為 65.56%，霉?fàn)€率最高，為24.44%；其余2種處理的種子發(fā)芽時(shí)間均高于10 d，且發(fā)芽率低于30 d+GA3處理的種子。對(duì)比表5和表6發(fā)現(xiàn)，低溫+300 mg/L GA3浸泡4 h的各組處理中，首粒種子發(fā)芽均比單獨(dú)低溫處理所需時(shí)間短，且發(fā)芽率有所提高。綜上，GA3與低溫處理均能有效打破芍藥種子上胚軸休眠，且以低溫30 d+300 mg/L GA3處理效果最好。

表6 GA3與低溫對(duì)芍藥種子發(fā)芽的影響Table 6 Influences on peony seed germination by GA3 and low temperature treatments

3 討 論

父本花粉的育性和雜交親和性是影響種子結(jié)實(shí)率的重要因素[9]。本研究以‘粉玉奴’為母本與不同的芍藥品種進(jìn)行雜交，計(jì)算不同品種組合的結(jié)實(shí)率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的組合均結(jié)實(shí)，這與侯祥云[14]試驗(yàn)中“母本為‘粉玉奴’的2個(gè)雜交組合出現(xiàn)了雜交不親和現(xiàn)象”的結(jié)論不同，這與雜交時(shí)選擇的品種有關(guān)。本試驗(yàn)還根據(jù)結(jié)實(shí)率和生根率雙重指標(biāo)來(lái)共同評(píng)定各雜交組合的親和性，結(jié)果表明，父本為‘紅羽球’的結(jié)子率最高，為5.37粒/朵，生根率為41.61%，而父本為‘老來(lái)紅’的結(jié)子率最低，為1.91粒/朵，生根率為26.85%。所以，在近緣雜交中應(yīng)選擇與母本親和性較好的品種作為父本材料，才能收獲育性強(qiáng)的雜交種子。

芍藥屬植物種子休眠主要由種皮產(chǎn)生的機(jī)械阻礙[15-16]、內(nèi)含抑制物的作用[16-17]和種胚未發(fā)育成熟[17]等因素制約。芍藥屬植物種子有上、下胚軸雙重休眠的特性，本研究分別用不同質(zhì)量濃度的GA3、IAA和清水(對(duì)照組)對(duì)隔年種子和當(dāng)年種子進(jìn)行生根試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，GA3和IAA均可以有效解除芍藥種子下胚軸休眠，但以質(zhì)量濃度為100 mg/L GA3處理的生根效果最佳，這與袁燕波等[18]以不同質(zhì)量濃度GA3處理芍藥種子得出的結(jié)論一致。本研究還分別以4 ℃低溫處理和GA3與4 ℃低溫相結(jié)合處理的方式，對(duì)根長(zhǎng)3～4 cm的芍藥種子進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 ℃低溫可以有效解除芍藥種子上胚軸休眠，并且上胚軸休眠解除效果與低溫持續(xù)時(shí)間成正比，與林松明等[19]以牡丹種子為材料得出“低溫(4 ℃)處理能夠打破鳳丹種子上胚軸的休眠，而且低溫階段越久，上胚軸休眠解除效果越好”的結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，低溫30 d+300 mg/L GA3浸泡4 h處理對(duì)打破芍藥種子上胚軸休眠最為有利，且發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽率都優(yōu)于單獨(dú)4 ℃低溫處理。因此，以4 ℃低溫和GA3處理相結(jié)合的方式更有利于破除種子的休眠。