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      小鼠胚胎毒性試驗方法的建立及在評價中藥早期胚胎毒性中的應(yīng)用

      2019-06-10 00:57:41黃珍禎張超超樊海艇朱嫻丹湯家銘
      醫(yī)學(xué)信息 2019年9期
      關(guān)鍵詞:朱砂含藥囊胚

      黃珍禎 張超超 樊海艇 朱嫻丹 湯家銘

      摘要:目的? 建立一種快速、早期的中藥胚胎毒性的快速檢測技術(shù),用于中藥的早期胚胎毒性篩選。方法? ①血清制備:SD大鼠隨機分為陽性對照組4只,正常組4只,雄黃組、朱砂組各3只。陽性對照組給予環(huán)磷酰胺10 mg/kg,正常組用0.5%CMC-Na灌胃給藥,雄黃組和朱砂組分別將雄黃和朱砂(用0.5%CMC-Na稀釋)按1.0 ml/100 g灌胃給藥。末次給藥后1 h,無菌取血并取上清血清;②細胞采集:4~6周雌性C57小鼠,用妊娠孕馬血清(PMSG)腹腔注射,48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(hCG),合籠交配。第2天檢查陰栓,用M2培養(yǎng)液將2細胞胚胎從輸卵管中沖出,用M16培養(yǎng)液進行培養(yǎng);③毒性試驗:在胚胎2細胞階段加入正常組、陽性對照組、雄黃組及朱砂組不同稀釋比血清,觀察囊胚成活率。結(jié)果? 在1∶4、1∶16、1∶32的稀釋比下,正常組的囊胚率為60.00%、73.33%、93.33%,高于陽性對照組的46.67%、60.00%、66.67%;朱砂組血清各個稀釋比的囊胚率均未達到80%;除1∶512這個稀釋比外,雄黃組血清各個稀釋比2細胞胚胎的囊胚率均未達到80%。結(jié)論? ①朱砂和雄黃的大鼠含藥血清在一定濃度時,對小鼠2細胞胚胎的生長發(fā)育有一定的影響,呈現(xiàn)中藥的胚胎毒性;②小鼠胚胎2細胞用于中藥的早期胚胎毒性篩選方法是可行的。

      關(guān)鍵詞:血清;胚胎毒性;2細胞胚胎;囊胚率

      中圖分類號:R285.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼:A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI:10.3969/j.issn.1006-1959.2019.09.023

      文章編號:1006-1959(2019)09-0071-03

      Abstract:Objective? To establish a rapid and early rapid detection technique for the toxicity of traditional Chinese medicine embryos for the early embryotoxicity screening of traditional Chinese medicine.Method? ① Serum preparation: SD rats were randomly divided into 4 positive control groups, 4 normal groups, and 3 rats in the realgar group and cinnabar group. The positive control group was given cyclophosphamide 10 mg/kg, the normal group was administered with 0.5% CMC-Na, and the realgar and cinnabar groups were respectively diluted with realgar and cinnabar (diluted with 0.5% CMC-Na) at 1.0 ml/100 g. Stomach administration. One hour after the last administration, the blood was taken aseptically and the supernatant serum was taken;②Cell collection: 4 to 6 weeks of female C57 mice were injected intraperitoneally with pregnant pregnant horse serum (PMSG). After 48 hours, human chorionic gonadotropin (hCG) was injected intraperitoneally and the cage was mated. On the second day, the sputum was examined, and the 2 cell embryos were washed out from the fallopian tube with M2 medium, and cultured with M16 medium; ③Toxicity test: normal group, positive control group, realgar group and cinnabar group were added at the embryonic 2 cell stage. The blastocyst survival rate was observed with different dilution ratios of serum.Results? At the dilution ratio of 1∶4, 1∶16, 1∶32, the blastocyst rate of the normal group was 60.00%, 73.33%, and 93.33%, which was higher than that of the positive control group (46.67%, 60.00%, and 66.67%). The blastocyst rate of each dilution ratio of serum did not reach 80%;Except 1∶512 dilution ratio, the blastocyst rate of each dilution ratio of 2-cell embryos in the realgar group was less than 80%.Conclusion? ①The serum containing cinnabar and realgar in rats has certain effect on the growth and development of mouse 2 cell embryos at a certain concentration, showing the embryotoxicity of traditional Chinese medicine; ②mouse embryo 2 cells used for early embryotoxicity screening of traditional Chinese medicine The method is feasible.

      Key words:Serum;Embryo toxicity;2 cell embryo;Blastocyst rate

      胚胎毒性(embryo toxicity)是指外來化合物在無明顯母體毒性的劑量時,對胚胎或胎兒產(chǎn)生的損害。胚胎毒性表明該物質(zhì)可通過胎盤屏障影響胚胎或胎兒的發(fā)育。胚胎毒性包括胚胎死亡、畸形、生長遲緩和功能不全。小鼠胚胎體外培養(yǎng)是胚胎技術(shù)的一部分,它包括超數(shù)排卵、胚胎的采集、胚胎體外培養(yǎng)等技術(shù),常用于遺傳工程小鼠的制備。由于小鼠的早期胚胎對培養(yǎng)環(huán)境變化(包括營養(yǎng)液、藥物等)敏感,稍有改變?nèi)菀滓鹋咛グl(fā)育停止、畸變等,目前將小鼠胚胎用作檢測中藥胚胎毒性方面的研究少見報道。小鼠2細胞胚胎發(fā)育到囊胚需要72 h,在2細胞階段加入實驗中藥給藥大鼠的血清,如中藥(經(jīng)或未經(jīng)體內(nèi)代謝的)有毒成分對早期胚胎具有毒性,則會引起胚胎的發(fā)育停滯、畸形甚至死亡。本項實驗的目的在于建立一種快速、早期的中藥胚胎毒性的快速檢測技術(shù),可用于中藥的早期胚胎毒性篩選。

      1材料與方法

      1.1實驗動物? 清潔級雄性SD大鼠,14只,體重300~350 g;清潔級雄性ICR小鼠,體重33~37 g;清潔級雌性C57小鼠,4~6周齡,以上實驗動物均由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供[實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2008-0016]。動物購入后,飼養(yǎng)在清潔級動物實驗室內(nèi)[實驗動物使用許可證號:SYXK(滬)2009-0069],溫度控制在20~25℃,濕度控制在40%~70%。動物自由攝食、飲水,1周換1~2次墊料。

      1.2試劑和耗材? HCG,批號:100618;PMSG,批號:100912,均購自杭州動物藥品廠。M2操作液,批號:082012;M16培養(yǎng)液,批號:042012,均購自Sigma公司。0.22 μm濾芯、1.5 ml滅菌離心管等耗材均購自上海青陽生物科技發(fā)展有限公司。

      1.3方法

      1.3.1含藥血清的制備? 按照血清藥理學(xué)制備含藥血清的“通法”制備含藥血清。將SD大鼠分為陽性對照組4只,正常組4只,雄黃組、朱砂組各3只。陽性對照組給予環(huán)磷酰胺10 mg/kg,正常組用0.5%CMC-Na灌胃給藥,雄黃組、朱砂組分別將雄黃和朱砂(用0.5%CMC-Na稀釋)按1.0 ml/100g灌胃給藥。末次給藥后1 h,3%戊巴比妥鈉麻醉,用無菌注射器腹主動脈采血,在超凈工作臺上注入到無菌離心管內(nèi)。置室溫待血液凝固后,3000 rpm離心15 min。取上清血清,混合后置新的無菌離心管內(nèi)進行分裝,保存于-70℃冰箱內(nèi)。根據(jù)情況測定含藥血清中砷和汞的含量。

      1.3.2小鼠超數(shù)排卵、2細胞胚胎的采集? 4~6周雌性C57小鼠,下午2~4時用妊娠孕馬血清(PMSG)腹腔注射,48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(HCG),將雌鼠分別放入清潔級雄性ICR小鼠籠內(nèi)進行交配。第2天上午8~9時檢查陰栓,有陰栓的雌鼠處死后取輸卵管,用M2培養(yǎng)液將2細胞胚胎從輸卵管中沖出,培養(yǎng)液清洗,M16培養(yǎng)液培養(yǎng)。

      1.3.3小鼠早期胚胎發(fā)育毒性試驗方法的建立? 在胚胎2細胞階段分別加入不同組別不同稀釋比血清,觀察囊胚成活率。①正常2細胞胚胎發(fā)育到囊胚的技術(shù)的建立,囊胚發(fā)育率需達到90%以上;②將大鼠正常組血清和陽性對照血清做比較,1:4稀釋正常組血清,囊胚發(fā)育率可達到80%以上,陽性血清囊胚發(fā)育率要達到80%則稀釋血清至少在1:16以上;③將雄黃組與朱砂組含藥血清進行比較,觀察在不同稀釋比下,雄黃組和朱砂組囊胚發(fā)育率情況,判斷是否具有胚胎毒性。

      2結(jié)果

      2.1大鼠正常組血清和陽性對照組囊胚率比較? 在1∶4、1∶16、1∶32的稀釋比下,正常組的囊胚率高于陽性對照組,說明陽性藥物的含藥血清對二細胞胚胎的生長發(fā)育有影響,可能是含藥血清中的有毒成分對早期胚胎具有毒性,引起胚胎的發(fā)育停滯、畸形甚至死亡,見表1,見表2。

      2.2朱砂含藥血清組囊胚率的試驗結(jié)果? 朱砂組各個稀釋比的囊胚率不高,均未達到80%,在1∶2稀釋比時,囊胚率只有33.33%,說明朱砂的含藥血清對二細胞胚胎的生長發(fā)育有一定的影響。隨著含藥血清濃度的降低,囊胚率并沒有隨之升高,不具有一定的線性關(guān)系,見表3。

      2.3雄黃含藥血清組囊胚率的試驗結(jié)果? 在雄黃含藥血清各稀釋比下,除1∶512外,二細胞胚胎的囊胚率均未達到80%,說明雄黃的含藥血清對二細胞胚胎的生長發(fā)育也有一定的影響,但隨著含藥血清濃度的降低,囊胚率隨之升高,對細胞的影響也隨之降低,見表4。

      3討論

      生殖健康與安全妊娠直接關(guān)系到優(yōu)生優(yōu)育以及國家和民族未來的興衰。20世紀60年代初震驚全球的 “反應(yīng)停事件” 導(dǎo)致近萬名新生兒出現(xiàn)海豹肢畸形的沉痛教訓(xùn),喚起了人類對藥物致畸作用的高度警惕。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 國內(nèi)外學(xué)者對妊娠安全性的研究越來越深入,最主要的研究目標是外源性物質(zhì)的胚胎毒性。準確、便捷的胚胎毒性檢測方法將為科研工作者提供良好的工具。

      中醫(yī)藥要現(xiàn)代化和國際化,必須要用現(xiàn)代實驗技術(shù)來研究其毒性及其毒性成分,以保障人們用藥的安全。在幾千年的傳承過程中,中醫(yī)藥對婦女妊娠期用藥特別注意,總結(jié)出將妊娠禁忌藥分為禁用與慎用兩大類。禁用中藥多系劇毒藥,或藥性作用峻猛之品,及墮胎作用較強的藥,如水銀、砒霜、雄黃、輕粉、斑蝥、馬錢子、蟾酥、川烏、草烏、藜蘆、膽礬、瓜蒂、巴豆、甘遂、大戟、芫花、牽牛子、商陸、麝香、干漆、水蛭、虻蟲、三棱、莪術(shù)等;慎用中藥則主要是活血祛瘀藥、行氣藥、攻下藥、溫里藥中的部分藥,如牛膝、川芎、紅花、桃仁、姜黃、牡丹皮、枳實、枳殼、大黃、番瀉葉、蘆薈、芒硝、附子、肉桂等。現(xiàn)代生殖毒理學(xué)研究也證實一些中藥如檳榔、蘆薈、杜仲、山慈菇、雄黃、半夏、紅花、大黃、狼毒、大薊、熟地黃、羌活、茵陳蒿、川桂皮、牡丹皮、苦參、連翹、桔梗等,具有生殖或胚胎發(fā)育毒性。同時,因為體內(nèi)胚胎毒性試驗需要使用大量實驗動物、費用較高、試驗周期長、難以迅速對大量物質(zhì)進行毒性評價,不能滿足減少(Reduction)、替代(Replacement)和優(yōu)化(Refinement)的3R原則需要。而體外試驗具有簡便、經(jīng)濟、試驗周期短、試驗條件可控、劑量-反應(yīng)關(guān)系易測和排除母體干擾等優(yōu)點,已廣泛應(yīng)用于胚胎毒性的篩選和致畸機制的研究。

      說本次實驗主要是嘗試將小鼠2細胞胚胎用作檢測中藥的胚胎毒性。由于小鼠的早期胚胎對培養(yǎng)環(huán)境變化敏感,稍有改變?nèi)菀滓鹋咛グl(fā)育停止、畸變等。在胚胎發(fā)育的2細胞階段加入實驗中藥給藥大鼠的血清,如中藥(經(jīng)或未經(jīng)體內(nèi)代謝的)有毒成分對早期胚胎具有毒性,則會引起胚胎的發(fā)育停滯、畸形甚至死亡。此實驗中,正常血清組隨著血清濃度的降低,囊胚率隨之升高,而陽性組含藥血清對胚胎發(fā)育有明顯的抑制作用,雄黃、朱砂的含藥血清對胚胎發(fā)育也有一定的抑制作用,但其中的比例關(guān)系尚不明確,也未呈現(xiàn)出明顯的線性關(guān)系。有可能是實驗人員的操作技術(shù)尚未熟練,在具體的操作過程中,由于胚胎的敏感性,有些不注意的小因素都可能會對胚胎造成影響。如果此方法能成功建立,便能應(yīng)用于中藥的早期胚胎毒性的篩選,對于中藥的胚胎毒性研究有著重要意義。

      參考文獻:

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      [8]劉曉坤,張駿鴻,魏強,等.不同起始時間超數(shù)排卵處理的昆白小鼠排卵、受精和胚胎發(fā)育時程研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2014,22(9):1097-1105.

      收稿日期:2019-1-9;修回日期:2019-2-20

      編輯/成森

      基金項目:上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實驗中心新技術(shù)新方法項目資助

      作者簡介:黃珍禎(1988.9-),女,上海人,本科,助理實驗師,主要從事實驗動物飼養(yǎng)與管理工作

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