鄭亦舟 王杰 李倩倩 李春華 陳鷹 趙渝

摘 要： 從中國山東威海海域以及新西蘭部分海域等全球裙帶菜（Undaria Pinnatifida）主要產(chǎn)地采收裙帶菜樣品，對樣品中的粗多糖和重金屬含量分別進行測定，分析和比較了不同產(chǎn)地裙帶菜中常規(guī)理化成分含量的差異.此外，對提取的粗多糖進行了衰減全反射（ATR）紅外光譜檢測，測得硫酸根特征基團，明確了該粗多糖中主要成分為硫酸脂多糖，且硫酸根基團的含量與巖藻多糖的功效有一定的關(guān)系.并測定了樣品中硫酸根基團的含量，為進一步探討裙帶菜中巖藻多糖的構(gòu)效關(guān)系，選擇合適的裙帶菜樣品采收地區(qū)提供參考.

關(guān)鍵詞： 裙帶菜; 巖藻多糖; 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）; 原子吸收光譜儀（AAS）; 衰減全反射（ATR）紅外光譜

中圖分類號： TS 254.9文獻標(biāo)志碼： A文章編號： 1000-5137（2019）02-0217-06

0 引 言

裙帶菜（Undaria pinnatifida）屬于褐藻門（Phaeophyta），褐藻綱（Phaeosporeae），海帶目（Laminariales），翅藻科（Alariaceae），裙帶菜屬（Undaria）.我國宋代古藉中稱莙荙菜，音變?yōu)槿箮Р?裙帶菜具有很高的經(jīng)濟及藥用價值，不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，還含有褐藻酸、甘露醇、褐藻糖膠、高不飽和脂肪酸、巖藻黃素、有機碘、甾醇類化合物和膳食纖維等多種具有獨特生理功能的活性成分[1]，具有降血脂、降血壓、調(diào)節(jié)免疫、抗突變和抗腫瘤等多種生理活性功能[2].

本文作者在全世界范圍內(nèi)選取以裙帶菜作為常見食品的兩個地區(qū)——中國山東威海以及新西蘭部分沿海海域，采收樣品，并對兩個產(chǎn)地之間裙帶菜中粗多糖、重金屬含量進行了比較.對提取到的粗多糖進行了衰減全反射（ATR）紅外光譜檢測，測得硫酸根特征基團，明確了該粗多糖中主要成分為硫酸脂多糖，且硫酸根基團的含量與巖藻多糖的功效有一定的關(guān)系.并進一步測定了樣品中硫酸根基團的含量.

1 材料與方法

1.1 材 料

將在山東威海采摘的裙帶菜（一號樣品）和在新西蘭沿海部分海域新鮮采摘的裙帶菜（二號樣品）孢子體與葉分離，用凈水沖洗，去除泥沙等雜質(zhì).采用冷凍干燥、烘箱烘干、曬干等方法得到干燥的樣品.將樣品放入粉碎機中粉碎成粉末狀.

1.2 粗多糖含量測定

取苯酚9 mL，置于100 mL容量瓶內(nèi)，加重蒸餾水配制5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）苯酚溶液，搖勻，轉(zhuǎn)移至棕色瓶內(nèi)避光保存.

稱取已干燥至恒重的D-葡萄糖100 mg，置于100 mL容量瓶中，加重蒸餾水，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的葡萄糖溶液;取10 mL上述溶液，置于100 mL容量瓶中，加重蒸餾水，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液.

依次分別吸取0，100，200，400，600，800，1000 μL的上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于7個10 mL容量瓶中，加重蒸餾水至2 mL，再加入1 mL的5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）苯酚，快速滴加5 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴加熱15 min，迅速冷卻，再加2 mL水，以空白試劑作為對照，在490 nm波長下測定樣品吸光度（OD）值（記為OD490），以O(shè)D490值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線[3].

將待測樣品用重蒸餾水溶解，依次加入1 mL的5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）苯酚，5 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴加熱15 min，迅速冷卻，再加入2 mL水，在490 mm波長下測定得到樣品OD490值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線可得樣品的粗多糖含量.

1.3 電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法全元素檢測

實驗所用儀器為ICP-MS儀element2 （賽默飛世爾科技股份有限公司），質(zhì)量分辨率為（0.8±0.1） u;微量移液器（大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司），量程為5～500 μL.

所使用的容器的材質(zhì)為全氟丙基全氟乙烯基醚與聚四氟乙烯的共聚物（PFA），使用前均先用超純水沖洗3次，再裝入約容器容積2/3的超純水，振蕩3次，再沖洗3次，然后以1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）硝酸浸泡12 h以上，倒去硝酸并加入超純水重復(fù)以上沖洗、振蕩操作，倒去超純水，置于干燥箱內(nèi)干燥，以消除容器中殘留元素及有機物質(zhì)的干擾.實驗中所用標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品都用1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）硝酸配制，既可以延長溶液的保存時間，又不會干擾測定結(jié)果.

由自動進樣器（包括蠕動泵、霧化器、霧室）依次吸取經(jīng)處理的樣品，用ICP-MS儀進行高精度同位素分析，全自動調(diào)試.

分別取0，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00 mL多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于6個潔凈的100 mL的PFA容量瓶中，用2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）硝酸溶液定容，混勻，得到各金屬元素質(zhì)量濃度分別為0，1.0，2.0，5.0，10.0和20.0 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液.待儀器穩(wěn)定后測定工作曲線.采用最小二乘法建立儀器響應(yīng)值對標(biāo)準(zhǔn)濃度值的線性方程，線性方程相關(guān)系數(shù)應(yīng)不小于0.99.

將對照溶液、標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液、樣品依次進行測定操作，采用工作曲線法測定樣品中重金屬含量.重復(fù)測量精密度小于20%，各元素回收率滿足75%～125%.

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

其中，a為曲線截距，b為曲線斜率，Yi為元素i響應(yīng)值的平均值.測量至少重復(fù)2次，直至2次平行測定的相對偏差不大于10%，取其平均值為最終各元素含量的測量值.

1.4 ATR紅外光譜測試

取干燥的裙帶菜樣品2 mg，均勻地平鋪在ATR紅外光譜儀進樣盤中央，在4000～400 cm-1范圍內(nèi)進行掃描[4]，重復(fù)3次，得到該樣品的紅外光譜數(shù)據(jù).

1.5 測定硫酸根的含量

準(zhǔn)確稱取1.25 g明膠溶于50 mL水中，加熱溶解，定容至250 mL，準(zhǔn)確量取200 mL，加入2 g氯化鋇，溶解后靜置4 h，在4000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心10 min，去沉淀，配制成氯化鋇明膠溶液[5]，于4 ℃下保存.

將硫酸鉀在105 ℃下干燥2 h，稱取108.83 mg的無水硫酸鉀，置于100 mL容量瓶中，加物質(zhì)的量濃度為1 mol·L-1的鹽酸至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.6 mg·mL-1的硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液.

依次分別吸取0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mL的0.6 mg·mL-1硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1 mol·L-1鹽酸定容至0.2 mL后，分別加入3.8 mL的3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三氯乙酸和1 mL氯化鋇明膠溶液，搖勻，在室溫下放置15 min，以空白試劑作為對照，在360 nm波長下測定OD值，以其為OD值縱坐標(biāo)，硫酸根質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線.

取硫酸化衍生物4.5 mg加入4.5 mL的物質(zhì)的量濃度為1 mol·L-1鹽酸，100 ℃下水解2.5 h，冷卻至室溫后，取0.2 mL，加入3.8 mL三氯乙酸和1 mL氯化鋇明膠，搖勻，在室溫下放置15 min，在360 nm波長下測定OD360值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線測得硫酸根含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 粗多糖含量測定結(jié)果

提取液中的鈣離子會與褐藻酸鈉發(fā)生反應(yīng)，形成難溶的褐藻酸鈣，覆蓋在樣品表面，使下面的樣品無法被提取，因此實驗采用苯酚硫酸法測量裙帶菜中的粗多糖含量，測得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示.圖2為最終測得從各樣品不同部位提取出的粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù).

總體而言，各地區(qū)樣品不同部位的粗多糖含量差異不大，新西蘭部分海域提取樣品中的粗多糖含量略高于中國山東威海地區(qū)的樣品含量，其孢子部分的粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達到62.03%.

2.2 重金屬含量測定結(jié)果

采用ICP-MS儀[6-7]對各地區(qū)采集的裙帶菜樣品不同部位的主要重金屬成分進行含量檢測，結(jié)果如表1所示.由表 1可知，裙帶菜中不同重金屬的含量差別較大，其中砷含量最高，在新西蘭地區(qū)裙帶菜樣品孢子中砷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達57726.62 μg·kg-1.總體而言，無論是孢子部分還是葉子部分，除鉛元素外，中國山東威海地區(qū)裙帶菜樣品中的主要重金屬含量都略高于新西蘭地區(qū)裙帶菜的樣品含量.將裙帶菜樣品中主要重金屬含量與《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》（GB 2762—2012）[8]中所規(guī)定的重金屬限量作比較，發(fā)現(xiàn)樣品中主要重金屬污染物鎘、汞、砷均超過限量.在食用裙帶菜產(chǎn)品前，建議先用水浸泡復(fù)原和水洗，這樣既能使裙帶菜的水分含量在一定程度上復(fù)原，又能較為簡單地減少重金屬污染物含量.對于包裝裙帶菜制品，出廠時均須經(jīng)過重金屬、微生物等指標(biāo)檢驗，不應(yīng)有重金屬超標(biāo)問題.

2.3 ATR紅外光譜測試結(jié)果

對于所提取的粗多糖進行ATR紅外光譜測定分析[9]，所得結(jié)果如表2和圖3所示.

2.4 硫酸根含量測定結(jié)果

由表2及圖3可知，硫酸根為巖藻多糖的特征基團之一，且其含量與巖藻多糖的功效有一定的關(guān)系[11-12].因此本實驗進一步用氯化鋇-明膠法測定了粗巖藻多糖中硫酸根質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示.

按照圖4的標(biāo)準(zhǔn)曲線對4個樣品中硫酸根的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進行了測試，結(jié)果如表3所示.

由表3可知，樣品中的硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在14%～16%范圍內(nèi)，說明除了多糖以外，還存在較多的硫酸根，與ATR紅外測試結(jié)果相對應(yīng).作為巖藻多糖的特征基團之一，硫酸根含量對于功效的影響有待進一步證明.

3 結(jié) 論

對中國山東威海海域新西蘭部分海域采摘的裙帶菜樣品進行多糖提取和重金屬成分分析，并對所提取的粗多糖進行ATR紅外光譜掃描和理化指標(biāo)檢測.結(jié)果表明：中國山東威海與新西蘭沿海地區(qū)裙帶菜樣品就理化指標(biāo)及功效成分而言有一定的差異.例如，在中國山東威海地區(qū)所采集的樣品中粗多糖含量略低于在新西蘭沿海所采集含量，而其重金屬污染更嚴(yán)重，具體污染原因以及進一步治理辦法還待研究.總體而言，新西蘭海域裙帶菜樣品中的孢子部分中粗多糖含量最高，粗多糖中多為硫酸酯多糖（巖藻多糖），硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%～16%，重金屬污染程度不高，可以選為研究對象進一步開展實驗探究.

在實驗過程中還發(fā)現(xiàn)對于裙帶菜樣品，所適用的重金屬含量檢測方法是ICP-MS法.該方法的檢出限低，靈敏度高，精密度良好，線性動態(tài)范圍寬，分析周期較短，比傳統(tǒng)的原子吸收法更適合對多種元素同時進行大批量分析.

參考文獻：

[1] 邢剛.即食裙帶菜產(chǎn)品的開發(fā) [D].大連：大連工業(yè)大學(xué)，2013.

XING G.Dovelopment of instant Undaria pinnatifida products [D].Dalian：Dalian University of Technology，2013.

[2] WANG S，LI Y，WHITE W，et al.Extracts from New Zealand Undaria pinnatifida containing fucoxanthin as potential functional biomaterials against cancer in vitro [J].Journal of Functional Biomaterials，2014，5（2）：29-42.

[3] 程仕偉，陳超男，馮志彬，等.海帶巖藻多糖的水提制備及其抗氧化活性研究 [J].食品科學(xué)，2010，31（6）：101-104.

CHENG S W，CHEN C N，F(xiàn)ENG Z B，et al.Water extraction and antioxidant activity of fucoid an from laminaria japonica [J].Food Science，2010，31（6）：101-104.

[4] 夏朝紅，戴奇，房韋，等.幾種多糖的紅外光譜研究 [J].武漢理工大學(xué)學(xué)報，2007，29（1）：45-47.

XIA C H，DAI Q，F(xiàn)ANG W，et al.Study on the infrared spectrum of several polysaccharides [J].Journal of Wuhan University of Technology，2007，29（1）：45-47.

[5] 俞幸幸，張茵，方辰，等.氯化鋇比濁法測定工作場所空氣中硫酸含量的方法改進 [J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，25（5）：282-283.

YU X X，ZHANG Y，F(xiàn)ANG C，et al.Improvement of determination of sulfuric acid content in workplace air by barium chloride turbidimetry [J].Preventive Medicine in Shanghai，2013，25（5）：282-283.

[6] 孫秀敏，雷敏，李璐，等.微波消解-ICP-MS法同時測定土壤中8種重（類）金屬元素 [J].分析試驗室，2014（10）：1177-1180.

SUN X M，LEI M，LI L，et al.Simultaneous determination of eight heavy metals elements in soil by microwave digestion-inductively coupled plasma mass spectrometry [J].Chinese Journal of Analysis Laboratory，2014（10）：1177-1180.

[7] 姚春毅，馬育松，賈海濤，等.微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定煤炭中鉛鎘鉻砷汞鈹 [J].冶金分析，2014（8）：22-26.

YAO C Y，MA Y S，JIA H T，et al.Simultaneous determination of eight heavy metals elements in soil by microwave digestion inductively coupled plasma mass spectrometry [J].Metallurgical Analysis，2014（8）：22-26.

[8] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量：GB 2762—2012 [S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

National Health Commission of the People′s Republic of China.National food safety standards contaminant limit in food：GB 2762—2012 [S].Beijing：Standards Press of China，2012.

[9] 張賽金，李文權(quán)，鄧永智，等.海洋微藻多糖的紅外光譜分析初探 [J].廈門大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，44（增刊1）：212-214.

ZHANG S J，LI W Q，DENG Y Z，et al.Preliminary study on the infrared spectrum analysis of marine microalgae polysaccharide [J].Jorunal of Xiamen University （Natural Science），2005，44（Suppl.1）：212-214.

[10] PEREIRA L，GHEDA S F，RIBEIRO-CLARO P J A.Analysis by vibrational spectroscopy of seaweed polysaccharides with potential use in food，pharmaceutical，and cosmetic industries [J].International Journal of Carbohydrate Chemistry，2013：537202.

[11] LIU M，LIU Y，CAO M，et al.Antibacterial activity and mechanisms of depolymerized fucoidans isolated from Laminaria japonica [J].Carbohydrate Polymers，2017，172：294-305.

[12] VISHCHUK O S，ERMAKOVA S P，ZVYAGINTSEVA T N.Sulfated polysaccharides from brown seaweeds Saccharina japonica and Undaria pinnatifida：isolation，structural characteristics and antitumor activity [J].Carbohydrate Research，2011，346（17）：2769-2776.

（責(zé)任編輯：顧浩然，馮珍珍）