山西地方自然發(fā)酵蔬菜發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性分析

康建依，洪 潔，高 逸，楊 悅，陳 孟，易欣欣，高秀芝*

（食品質(zhì)量與安全北京實驗室，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，微生態(tài)制劑關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)北京市工程實驗室，北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206）

我國作為世界蔬菜生產(chǎn)大國，蔬菜樣式多種多樣，但蔬菜深加工還在起步階段，蔬菜的鹽（泡）漬貯藏及加工是我國食品的重要發(fā)展部分。傳統(tǒng)發(fā)酵食品中蔬菜的鹽（泡）漬貯藏加工是我國最常見的蔬菜加工方法之一，并且歷史悠久，世代相傳，享譽(yù)全球[1]，其發(fā)酵產(chǎn)品不僅風(fēng)味獨特誘人，而且富含大量維生素、氨基酸和礦物質(zhì)[2]，可以在缺乏新鮮蔬菜攝入時補(bǔ)充營養(yǎng)。

在我國研究的發(fā)酵蔬菜大多為四川泡菜和東北酸菜，除此之外，在我國山西地區(qū)也有一種清爽可口的地方發(fā)酵蔬菜，俗稱為“爛腌菜”，是以新鮮蔬菜為主料，包括圓白菜、芹菜、胡蘿卜和辣椒等，以中低濃度的鹽水腌制[3]。在厭氧環(huán)境中，利用蔬菜自身附著微生物或人工添加發(fā)酵菌種進(jìn)行乳酸發(fā)酵而制成的發(fā)酵蔬菜，在保留蔬菜清香、脆嫩及美味的同時又增添酸度使其不僅風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富，又能起到助消化、解膩開胃等效果[4-5]。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品在中國飲食文化中具有很重要的地位。然而，由于缺乏對發(fā)酵過程中微生物菌群的研究，大多數(shù)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)仍然是依據(jù)經(jīng)驗，這使得發(fā)酵過程難以控制。高通量測序技術(shù)已被證明是探索復(fù)雜環(huán)境微生物和跟蹤發(fā)酵過程的有效研究手段[6]，可以更客觀地揭示傳統(tǒng)發(fā)酵食品發(fā)酵過程中微生物菌群的變化，且此技術(shù)已被應(yīng)用于泡菜整個發(fā)酵過程中微生物演替的研究。目前，尚鮮見對于山西地方特色發(fā)酵蔬菜（俗稱“爛腌菜”）細(xì)菌多樣性分析的研究報道。本研究基于高通量測序方法對地方發(fā)酵蔬菜不同階段微生物菌落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析，對地方發(fā)酵蔬菜化學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測分析，從而更全面地展現(xiàn)地方發(fā)酵蔬菜的微生物多樣性，為進(jìn)一步研究特色發(fā)酵蔬菜提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平板計數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；MRS培養(yǎng)基 奧博星生物技術(shù)公司；氯化鈉、亞硝酸鈉（均為分析純） 北京化工廠；對氨基苯磺酸（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十水合四硼酸鈉、二水合乙酸鋅（均為分析純） 廣東汕頭西隴化工廠；通用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Bacteria DNA Kit） 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3B型酸度計 上海雷磁儀器廠；DL-CJ-1N超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 地方自然發(fā)酵蔬菜樣品采集

在北京地區(qū)山西面館采集地方發(fā)酵蔬菜樣品，為面館自制發(fā)酵而成（面館以每周為1 個制作周期，發(fā)酵蔬菜工藝制作成熟，品質(zhì)穩(wěn)定）。發(fā)酵方法：將新鮮圓白菜、芹菜和胡蘿卜（質(zhì)量比為8∶1∶1）洗凈切絲，蔬菜、4%鹽水和老湯（多次制作發(fā)酵蔬菜的發(fā)酵液）的質(zhì)量比為10∶9∶1，混勻。將混合好的蔬菜放入壇子中，蔬菜總量約為15 kg，用石頭壓實，蓋好放置于陰涼通風(fēng)地。取未經(jīng)發(fā)酵的混合樣品為0 d（記為V0），連續(xù)發(fā)酵7 d，每天從壇子中的3 個不同位置取樣各30 g，作為平行樣品，依據(jù)取樣天數(shù)分別記為V1、V2、V3、V4、V5、V6和V7。

1.3.2 地方自然發(fā)酵蔬菜指標(biāo)測定

將25 g樣品加225 mL生理鹽水均質(zhì)2 min，10 倍梯度稀釋。根據(jù)GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[7]和GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》[8]分別對樣品中細(xì)菌總數(shù)和乳酸菌數(shù)進(jìn)行測定；采用pH計測定樣品pH值；根據(jù)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[9]對樣品中總酸進(jìn)行測定；亞硝酸鹽檢測參照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[10]，亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.110 1x－0.004，R2=0.998 1。

1.3.3 樣品總DNA提取

采用生工柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取樣品總DNA，提取步驟根據(jù)說明書進(jìn)行。以提取的總DNA為模板，采用16S rDNA V3-V4區(qū)設(shè)計引物為338F（5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’），502R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）在引物末端加上測序接頭進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，48 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共25 次循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增、檢測工作均由北京理化分析檢測中心完成。

1.3.4 高通量測序數(shù)據(jù)分析

用Illumina HiSeq 2500對16SrDNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行測序得到不同發(fā)酵時間樣品基因文庫，使用QIIME（version 1.8.0）軟件中的 UCLUST[11]對Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類、獲得操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，并且計算Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)，對樣品的微生物多樣性進(jìn)行評價，以評估當(dāng)前的測序量是否代表了主要群落的多樣性，以及樣本的大小是否合理?；诰褐gUnifrac[12]算法非加權(quán)的主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）可以實現(xiàn)多個樣品的分類。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007和SPSS 18分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并結(jié)合Duncan法多重比較，所有實驗均重復(fù)3 次，結(jié)果用 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 地方自然發(fā)酵蔬菜指標(biāo)測定結(jié)果

2.1.1 地方自然發(fā)酵蔬菜發(fā)酵過程微生物變化

地方自然發(fā)酵蔬菜在制作工藝中，前期加入地方老湯進(jìn)行發(fā)酵，原料中細(xì)菌總數(shù)和乳酸菌數(shù)較多，從圖1可知，地方自然發(fā)酵蔬菜細(xì)菌總數(shù)和乳酸菌數(shù)變化趨勢相似呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢，發(fā)酵后期菌數(shù)趨于平穩(wěn)。在第0天，由于發(fā)酵方式為自然發(fā)酵，且原料蔬菜中本身帶有部分細(xì)菌，細(xì)菌總數(shù)為4.3×107CFU/g，乳酸菌數(shù)為7.2×106CFU/g，發(fā)酵3 d，細(xì)菌總數(shù)與乳酸菌數(shù)分別為9.1×106CFU/g和7.8×106CFU/g，說明乳酸菌已成為蔬菜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌，發(fā)酵5 d，細(xì)菌總數(shù)和乳酸菌數(shù)均達(dá)到峰值分別為5.5×107CFU/g和1.6×107CFU/g，發(fā)酵后期細(xì)菌和乳酸菌的死亡速度加快，使菌落數(shù)均略有下降后趨于平穩(wěn)，細(xì)菌總數(shù)和乳酸菌數(shù)分別為1.2×107CFU/g和2.5×106CFU/g。

圖1 蔬菜發(fā)酵過程中微生物菌落數(shù)Fig. 1 Changes in microbial populations during vegetable fermentation

2.1.2 地方自然發(fā)酵蔬菜發(fā)酵過程化學(xué)指標(biāo)分析

亞硝酸鹽含量是評價發(fā)酵蔬菜安全性的重要指標(biāo)，通常接種發(fā)酵產(chǎn)生的亞硝酸鹽含量低于自然發(fā)酵[13]。在蔬菜發(fā)酵過程中，pH值和總酸對微生物生長和發(fā)酵中代謝物的產(chǎn)生有很大影響。如圖2所示，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵蔬菜的pH值逐漸降低，相應(yīng)的總酸含量逐漸上升，在發(fā)酵前期（0～2 d），pH值迅速降低，總酸含量明顯升高，亞硝酸鹽含量緩慢上升，2 d樣品的亞硝酸鹽含量達(dá)到最高值為0.41 mg/kg，發(fā)酵中后期，發(fā)酵蔬菜pH值和總酸含量變化較小且亞硝酸鹽含量緩慢降低，發(fā)酵結(jié)束后地方發(fā)酵蔬菜中的pH值為3.22，總酸含量為1.98 g/kg，亞硝酸鹽含量為0.15 mg/kg，遠(yuǎn)低于GB 2762—2017《食品中污染物限量》腌漬蔬菜亞硝酸鹽限量規(guī)定的20 mg/kg[14]。發(fā)酵前期（0～2 d）乳酸菌數(shù)逐漸下降，部分雜菌可利用蔬菜中的硝酸鹽還原生成亞硝酸鹽，使亞硝酸鹽達(dá)到最大，在發(fā)酵中期乳酸菌數(shù)的增加及穩(wěn)定的群落對蔬菜發(fā)酵過程中的其他有害微生物產(chǎn)生抑制作用，減少了亞硝酸鹽的生成[15]，此時，隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸菌的生長使乳酸含量增加，從而引起酸度變化[16]。

圖2 蔬菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽、pH值和總酸的變化Fig. 2 Changes in nitrate content, pH and total acid content during vegetable fermentation

2.2 地方自然發(fā)酵蔬菜細(xì)菌豐度和多樣性分析

通過細(xì)菌16S rDNA基因V3-V4區(qū)測序，8 個樣品產(chǎn)生408 663 條有效序列，統(tǒng)計所有樣品優(yōu)質(zhì)序列長度均為414～429 bp。所有序列依據(jù)97%的相似度進(jìn)行OTU分類。由圖3可知，隨著測序量的增加，細(xì)菌稀釋曲線接近平臺期達(dá)到飽和，表明樣品中的物種多樣性豐富程度高。

圖3 樣品的細(xì)菌稀釋曲線圖Fig. 3 Rarefaction curves for bacterial samples

表1 樣品的信息、序列豐度以及微生物多樣性Table 1 Sequence abundance and microbial diversity in samples

基于在97%相似度水平的OTU數(shù)，各樣品Alpha多樣性指數(shù)值統(tǒng)計如表1所示，發(fā)現(xiàn)V4中具有較豐富的多樣性。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)衡量物種豐度，ACE指數(shù)與OTU數(shù)結(jié)果相似。8 個樣品中的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)在0.22～2.23之間，V1～V7的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)呈反比，且V1、V7數(shù)值相差較多，V7的多樣性指數(shù)最高。另外還統(tǒng)計了OTU覆蓋率，其數(shù)值在0.999 3～0.999 7之間，結(jié)果表明，取樣合理覆蓋程度較高，能夠反映出樣品的真實情況。

2.3 地方自然發(fā)酵蔬菜細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

圖4 蔬菜發(fā)酵過程中屬水平菌群結(jié)果（A）和系統(tǒng)進(jìn)化樹（B）分析Fig. 4 Analysis of fl ora structure at genus level (A) and phylogenetic tree (B) during vegetable fermentation

地方自然發(fā)酵蔬菜的發(fā)酵過程在屬水平上的群落演替如圖4A所示，可以看出魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、泛菌屬（Pantoea）、腸桿菌屬（Enterobacter）、沙雷氏菌屬（Serratia）、環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、歐文氏菌屬（Erwinia）及不動細(xì)菌屬（Acinetobacter）等多種菌群在早期發(fā)酵階段中存在，圖4中未知菌屬（unknown）代表未得到分類學(xué)注釋的物種。一般發(fā)酵蔬菜的原料中均帶有大量微生物，包括乳酸菌、酵母菌、腸桿菌及假單胞菌等，且通過細(xì)菌和真菌共同參與發(fā)酵成成品[17]。隨著發(fā)酵時間的延長，乳桿菌屬迅速成為細(xì)菌群落的主要菌屬，V7中乳桿菌屬含量為93.5%，乳桿菌屬能夠在糖酵解途徑和發(fā)酵過程中發(fā)揮重要作用[18]。

基于屬分類學(xué)水平上豐度最高的OTU序列，進(jìn)行多重序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖4B所示，進(jìn)化樹中每條樹枝代表一個物種，樹枝長度為兩個物種間的進(jìn)化距離，即物種的差異程度，其中相同顏色屬名代表所屬于相同的門，在門水平有5 個，分別是放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteridetes）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其中變形菌門是系統(tǒng)發(fā)生樹中最大的分支，但相關(guān)性較少，變形菌門菌屬大部分來自于土壤中種植的新鮮蔬菜，厚壁菌門分支較大且相關(guān)性較高，厚壁菌門中有多種益生菌種屬，如乳桿菌屬、明串球菌屬及腸球菌屬等[19]，與屬水平相對含量圖分析相似。

2.4 地方自然發(fā)酵蔬菜細(xì)菌群落相似性分析

對樣品間進(jìn)行物種豐度信息Unifrac分析，如圖5所示，發(fā)酵蔬菜共4 次移位，其中有兩次快速移位，兩次較慢移位。第1次快速移位發(fā)生在PC1的V0～V1，顯著性約為70%，符合pH值在此階段的快速下降和屬水平相對含量的變化。第2次快速移位發(fā)生在PC2的V1～V2，可能與異型和同型發(fā)酵乳酸菌在發(fā)酵中存在交替和消長有關(guān)。PCoA圖兩次較慢移位分別發(fā)生在V2～V4和V4～V7，前者在PC2呈負(fù)相關(guān)，可能表示此期間產(chǎn)生的一些代謝物減少，后者在PC1呈正相關(guān)，結(jié)合此時代謝物與菌屬相對含量，分析表明，發(fā)酵過程趨于平穩(wěn)，與微生物乳酸菌計數(shù)的變化結(jié)果相似。

圖5 蔬菜發(fā)酵過程細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)Unifrac非加權(quán)PCoA分布圖Fig. 5 Un-weighted-unifrac analysis of bacterial community structure during vegetable fermentation

2.5 地方自然發(fā)酵蔬菜發(fā)酵過程中聚類分析

如圖6所示，不同發(fā)酵時間的8 個樣品在屬分類水平的物種豐度相似性進(jìn)行聚類分析。通過對顏色梯度及相似程度進(jìn)行分析[20]，V0與其他樣品差距較大，V3、V5、V6及V7基本接近，說明隨著發(fā)酵蔬菜的成熟，樣品之間的微生物差異性減少，物種豐度越來越相似。根據(jù)Alpha多樣性、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)顯示V0的多樣性 指數(shù)最高，V0中含量較多的屬假單胞菌屬（Pseudomonas）、地桿菌屬（Geobacter）、泛菌屬（Pantoea）、歐文氏菌屬（Erwinia）、腸桿菌屬（Enterobacter）、沙雷氏菌屬（Serratia）和拉烏爾菌屬（Raoultella）均屬于變形菌門，環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、魏斯氏菌屬（Weissella）和明串珠菌屬（Leuconostoc）屬于厚壁菌門。隨著發(fā)酵時間的延長，樣品菌屬發(fā)生較大改變。發(fā)酵初期的乳球菌屬（Lactococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、鏈球菌屬（Streptoccus）和Fructobacillus等更豐富，變形菌門菌屬減少，此階段酸度下降，但變形菌門的存在使亞硝酸鹽升高[21]，發(fā)酵中期的樣品V4中含有棒桿菌屬（Corynebacterium）、腸球菌（Enterococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）和微小桿菌屬（Exiguobacterium）可能來自于外界污染。發(fā)酵后期，蔬菜樣品的微生物多樣性相對減少，主要含有乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）及真桿菌屬（Eubacterium）[22]，均屬于厚壁菌門。

圖6 蔬菜發(fā)酵過程中聚類熱圖Fig. 6 Heat map from clustering during vegetable fermentation

3 討 論

在蔬菜發(fā)酵過程中，蔬菜附著微生物與發(fā)酵液混合，隨著發(fā)酵時間延長，乳酸菌為優(yōu)勢菌，其中會出現(xiàn)異型發(fā)酵乳酸菌和同型發(fā)酵乳酸菌交替和消長現(xiàn)象[23]，并代謝產(chǎn)生乳酸使酸度降低，發(fā)酵后期乳酸的積累使菌落總數(shù)下降。由于后期菌群結(jié)構(gòu)較相似，乳酸菌數(shù)和酸度趨于平穩(wěn)。前期加入老湯使發(fā)酵過程中乳酸菌及其代謝產(chǎn)物（有機(jī)酸）可以降解發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽，因此在發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量整體較低，燕平梅等[24]研究發(fā)現(xiàn)用泡菜老湯發(fā)酵蔬菜能夠增強(qiáng)發(fā)酵系統(tǒng)中乳酸菌種群優(yōu)勢，形成有利于乳酸菌生長的環(huán)境。Jung等[25]通過焦磷酸分析研究韓國泡菜菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)異型發(fā)酵乳酸菌是泡菜發(fā)酵過程的主要功能菌，可以提高產(chǎn)品風(fēng)味。張慶芳等[26]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的降低，原因有兩種：一為由微生物還原酶導(dǎo)致，二為微生物發(fā)酵過程產(chǎn)生有機(jī)酸引起，且酸度與亞硝酸鹽的降解有很大關(guān)系，pH 4.0時可能是酶降解和酸降解的分界點。

采用高通量技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，樣品發(fā)酵初期微生物組成差異較大，除未知菌屬外，魏斯氏菌屬和乳桿菌屬為優(yōu)勢菌屬。Jeong等[27]研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和魏斯氏菌屬（Weissella）等在蔬菜發(fā)酵過程中起主要作用。佟婷婷等[28]通過宏基因組研究泡菜母水發(fā)酵蔬菜細(xì)菌微生物多樣性的結(jié)果顯示，泡菜發(fā)酵中啟動菌為魏斯氏菌屬，發(fā)酵的關(guān)鍵菌為乳桿菌屬，與本研究結(jié)果一致，說明地方發(fā)酵蔬菜中魏斯氏菌屬在發(fā)酵的初始階段中起到重要作用。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳桿菌屬（Lactobacillus）成為發(fā)酵蔬菜中的絕對優(yōu)勢菌，與Kim[29]和張先琴[30]等研究結(jié)果一致。通過PCoA及聚類熱圖分析可進(jìn)一步了解不同發(fā)酵蔬菜樣品菌群結(jié)構(gòu)差異。本研究對地方發(fā)酵蔬菜過程中樣品，結(jié)合高通量技術(shù)和傳統(tǒng)指標(biāo)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與發(fā)酵蔬菜的指標(biāo)存在對應(yīng)關(guān)系，對于后續(xù)實驗功能菌的分純、應(yīng)用及對發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品工業(yè)化推廣提供指導(dǎo)性意見。

4 結(jié) 論

地方自然發(fā)酵蔬菜0～7 d的Shannon指數(shù)相差63%，隨著發(fā)酵進(jìn)行多樣性越豐富。0 d主要菌屬為魏斯氏菌屬和明串珠菌屬，所占比例分別為11.2%和9.9%，還包括假單胞菌屬及腸桿菌屬。5 d樣品主要菌屬為乳桿菌屬，7 d時所占比例為93.5%，還包括片球菌屬及真桿菌屬，發(fā)酵后期菌群結(jié)構(gòu)相似性較大。微生物數(shù)量和菌群均趨于穩(wěn)定，酸度和亞硝酸鹽含量穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束后（7 d）細(xì)菌總數(shù)和乳酸菌數(shù)分別為1.2×107CFU/g和2.5×106CFU/g，地方發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽含量為0.15 mg/kg，發(fā)酵結(jié)束pH值為3.22，總酸含量為1.98 g/kg，乳酸菌數(shù)與亞硝酸鹽呈彼消此長趨勢。