羅非魚魚鱗檸檬酸-蘋果酸鈣的制備及產(chǎn)物鑒定

張 玲，譚南峰，李春海,*，周惠敏，張 鐘，李 雯

（1.廣東省嶺南特色果蔬加工及應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，廣東普通高校食品科學創(chuàng)新團隊，廣東 茂名 525000；2.廣東石油化工學院生物與食品工程學院，廣東 茂名 525000）

我國是世界淡水魚生產(chǎn)大國，羅非魚是我國主要的淡水經(jīng)濟魚種，也是聯(lián)合國推薦養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，2017年我國羅非魚產(chǎn)量接近180萬 t[1-2]。魚鱗是羅非魚加工下腳料中的主要副產(chǎn)物，加工過程中會產(chǎn)生約占體質(zhì)量1%～2%的魚鱗。近年來研究發(fā)現(xiàn)，魚鱗含有豐富的蛋白質(zhì)和多種礦物質(zhì)，其中有機物占41%～55%，磷酸鈣占38%～46%，還含少量碳酸鈣、磷酸鎂、磷酸鈉等無機鹽[3-4]。但在生產(chǎn)過程中，魚鱗往往僅加工成低廉的飼料或直接視為垃圾處理掉。如果能對羅非魚魚鱗加以高值利用，既可解決環(huán)境污染問題，又可促進水產(chǎn)品加工廢棄物的綜合利用，并帶來豐厚的經(jīng)濟效益。

檸檬酸-蘋果酸鈣（calcium citrate malate，CCM）又名果酸鈣，是檸檬酸和蘋果酸與鈣離子復合構(gòu)成的鈣鹽，是一種新型的鈣營養(yǎng)強化劑，具有溶解性高、吸收利用性強、減少鐵吸收阻礙、風味良好、安全無毒等特點，還能抑制腎結(jié)石的產(chǎn)生，既可以作為食品添加劑，也可直接制成補鈣保健品，又可用于藥品中，是國際公認的優(yōu)秀鈣源，具有廣泛的開發(fā)應(yīng)用前景[5-7]。CCM可以直接用作補鈣保健品，也可作為鈣強化劑，添加到面包、餅干、糕點、糖果、奶粉及早餐食品和風味小吃中制成功能性食品，用于鈣強化飲料可以添加到牛奶、豆乳飲料等飲料中。用CCM作為鈣強化劑的飲料已在世界多個地區(qū)銷售。美國（1986年）、日本（1990年）、歐洲（1991年）已經(jīng)開始銷售。日本衛(wèi)生福利部已批準CCM作為“特殊健康食品”的原料，加拿大政府已批準CCM吞服片和咀嚼片作為醫(yī)藥上的鈣質(zhì)補充劑[8-10]。據(jù)報道，CCM具有高吸收利用性可能與其組成成分檸檬酸和蘋果酸是體內(nèi)三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物有關(guān)，隨著構(gòu)成CCM的檸檬酸和蘋果酸組分在體內(nèi)進入三羧酸循環(huán)參與代謝，CCM則緩慢地釋放出鈣離子，從而提高了CCM的吸收利用性[11]。Smith等[12]以10 名21～31 歲的女性為對象，用雙重同位素法比較CCM和碳酸鈣的吸收利用率，結(jié)果顯示，來自CCM的鈣吸收利用率為37.3%，明顯高于碳酸鈣（29.6%）的吸收利用率。

目前，關(guān)于CCM研究的重點主要集中于生產(chǎn)工藝和應(yīng)用等方面。我國已有少部分食品添加劑企業(yè)進行了CCM的試生產(chǎn)，并有小批量產(chǎn)品上市，但關(guān)于制備原料的配比、合成工藝條件與產(chǎn)品溶解度之間的關(guān)系，以及CCM結(jié)構(gòu)探討、吸收率等方面部分研究仍處于起步階段，開展相關(guān)研究具有重要的意義[5,13-14]。

魚鱗骨質(zhì)層中含有的鈣質(zhì)以羥基磷灰石[Ca10(OH)2(PO4)6]形式存在，其溶出較為困難。目前提取鈣的方法主要有酸法（包括鹽酸、乳酸、檸檬酸等）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）法和其他物理輔助法（超聲波、微波等）[15-16]。國內(nèi)脫除魚鱗中鈣的方法主要有酸法和EDTA法，這兩類方法存在反應(yīng)時間長或酸用量多等缺點，且脫除的鈣幾乎無法回收，不利于資源的經(jīng)濟型利用。近年來，超聲波技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中已顯示出巨大的優(yōu)勢，利用超聲波產(chǎn)生的強烈振動、空化效應(yīng)、攪拌作用等可以加速細胞中有效成分進入溶劑，提高提取率，縮短提取時間，節(jié)省溶劑，簡化提取操作步驟[17]。與超臨界流體萃取相比，超聲波萃取的設(shè)備更加簡單，可以提取多種化合物，無論其極性如何，因為超聲波萃取可用任何一種溶劑；與微波輔助萃取相比，超聲波萃取的步驟更少，萃取過程簡單，不易對萃取物造成污染，更安全，某些情況下的萃取速度更快[18]。

本研究以羅非魚魚鱗為原料，采用超聲輔助制備CCM，通過單因素試驗和正交試驗確定CCM的最佳制備工藝條件，并對產(chǎn)物進行掃描電鏡觀察、X射線衍射（X ray diffraction，XRD）、傅里葉紅外光譜、比表面積及孔徑分析；本方法在一定程度上可取代傳統(tǒng)的鹽酸法脫魚鱗鈣的操作，產(chǎn)品是國際公認的良好鈣源，產(chǎn)品及生產(chǎn)技術(shù)應(yīng)用空間較大。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚魚鱗由廣東百維生物科技有限公司提供。

DL-蘋果酸（食品級） 鄭州市食代添驕化工產(chǎn)品有限公司；檸檬酸（食品級） 天津市百世化工有限公司；氧化鑭（分析純） 天津市光復精細化工研究所；檸檬酸鈣（分析純） 天津市大茂化學試劑廠；蘋果酸鈣（分析純） 廣東翁江化學試劑有限公司；硝酸、鹽酸（均為分析純） 西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NRY-1102C恒溫搖床 上海南榮實驗室設(shè)備有限公司；LS-B501全自動數(shù)顯立式高壓滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；XO-120D超聲波清洗槽、XO-120D超聲波清洗機 南京先歐儀器制造有限公司；DHG-9023A鼓風干燥機 上海申光儀器儀表有限公司；YP3002電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司；SP-3801AA原子吸收分光光度儀 北京華洋儀器公司；KYKY-EM3200掃描電鏡 北京中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責任公司；PE-M1730紅外光譜儀 美國PE公司；Ultima IV組合式多功能X射線衍射儀 日本理學公司；JW-BK100A比表面積及孔徑分析儀 北京精微高博科學技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羅非魚魚鱗CCM的制備

選用干燥無腐敗變質(zhì)的未經(jīng)脫鈣處理的羅非魚魚鱗，于60 ℃鼓風干燥4～6 h，置于萬用中藥打粉機中打碎；取適量魚鱗粉，經(jīng)預煮或超聲預處理后，加入一定體積、質(zhì)量分數(shù)、質(zhì)量比的檸檬酸-蘋果酸溶液，在超聲波下控溫提取一定時間，抽濾得濾液，采用火焰原子吸收法測定得鈣率；將濾液真空濃縮達到鈣鹽介穩(wěn)區(qū)[19]，然后降溫至15～20 ℃，放置24 h左右，直到有大量鈣鹽晶體析出，分離出晶體，然后用清水反復沖洗晶體3 次，靜置后再分離晶體，最后于40 ℃真空干燥至質(zhì)量恒定。

1.3.2 魚鱗預處理方法的比較

在進行單因素試驗前，先確定羅非魚魚鱗的預處理方式。比較不經(jīng)預煮、100 ℃水煮30 min、超聲波60 ℃處理30 min、超聲波（60 ℃，30min）結(jié)合預煮（100 ℃，30 min）4 種預處理方式對魚鱗鈣提取效果的影響。其余提取條件為：溫度60 ℃、提取總時間1.75 h、液料比20∶1（mL/g）、蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比1∶1、混合酸總質(zhì)量分數(shù)8%。

1.3.3 液料比對魚鱗得鈣率的影響

選擇蘋果酸與檸檬酸總質(zhì)量分數(shù)為8%，質(zhì)量比為1∶1，60 ℃提取0.5 h的固定條件，改變提取酸液與魚鱗粉的液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），考察液料比對得鈣率的影響。

1.3.4 正交試驗

基于魚鱗前處理及單因素試驗結(jié)果，選擇混合酸總質(zhì)量分數(shù)（A）、蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比（B）、超聲溫度（C）和超聲時間（D）4 個因素，設(shè)計采用4水平5因素正交試驗，見表1，優(yōu)化超聲輔助檸檬酸、蘋果酸制備CCM的最佳工藝條件，并考察4 個因素對CCM制備的影響重要性次序。每組實驗均重復3 次，取平均值。

表1 正交試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.5 羅非魚魚鱗復合鈣產(chǎn)物的表征及鑒定

以最優(yōu)制備工藝條件下制得的羅非魚魚鱗復合鈣為樣品，對其進行表征鑒定。

1.3.5.1 紅外光譜分析

比較4 種樣品（樣品1：分析純的檸檬酸鈣；樣品2：分析純的蘋果酸鈣；樣品3：分析純的檸檬酸鈣與蘋果酸鈣物質(zhì)的量比1∶2混合物；樣品4：羅非魚魚鱗復合鈣產(chǎn)物）的紅外光譜圖，對產(chǎn)物進行紅外光譜分析。具體操作如下：將1 mg的各種樣品和約100 mg干燥的溴化鉀放入研缽中仔細研細調(diào)勻，然后把混合物轉(zhuǎn)入專用的壓片機中，邊抽氣邊加壓，制成幾乎透明的薄圓片，放入光路系統(tǒng)進行測量。

1.3.5.2 XRD分析

對4 種樣品進行XRD分析并鑒定產(chǎn)物。具體如下：采用組合式多功能XRD儀，Cu靶，管電壓40 kV，管電流40 mA，樣品壓片后檢測。

1.3.5.3 掃描電鏡觀察

先將導電膠粘接在樣品座上，再均勻地把羅非魚魚鱗復合鈣粉末撒在導電膠上面，用吸耳球吹去未粘住的粉末，再鍍上一層導電膜后上電鏡觀察。

1.3.5.4 比表面積及孔徑測定

1.3.6 鈣含量檢測方法及得鈣率的計算

鈣含量參照GB/T 5009.92—2003《食品中鈣的測定》[21]通過原子吸收法測定。

標準曲線制備：配制20 g/L的氧化鑭溶液，將1 000 μg/L鈣標準溶液分別稀釋成1、5、10、15、20、30、50 μg/L的鈣標準溶液，定容到50 mL，采用原子吸收分光光度儀檢測，繪制標準曲線。

樣品消解及鈣含量檢測：用混合酸提取魚鱗中的鈣之前，記錄提取容器質(zhì)量m1及魚鱗樣品質(zhì)量m0，提取完畢后，記錄提取容器和提取液總質(zhì)量m；用100 mL錐形瓶，裝入5.0 g提取液，加入25 mL濃硝酸并加入幾粒玻璃珠，三角瓶口放一小漏斗防止液體飛濺，置電陶爐上加熱消解，調(diào)整火力使液體保持微沸狀態(tài)，消解至液體清亮無色、剩余2～5 mL為止。再用20 g/L氧化鑭溶液稀釋定容至50 mL比色管，再從中取5 mL液體用氧化鑭溶液稀釋定容至50 mL容量瓶中，再用原子吸收分光光度儀測定吸光度，查標準曲線計算鈣的濃度，記為C（μg/mL）。得鈣率的計算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)及圖片處理

單因素及正交試驗每組實驗均重復3次，取平均值；采用SPSS Statistices 17.0對正交試驗結(jié)果進行方差分析；采用Origin 8.5進行數(shù)據(jù)圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚鱗預處理方式對得鈣率的影響

圖1 魚鱗的不同預處理條件對得鈣率的影響Fig. 1 Effect of different pretreatment conditions on calcium yield

由圖1可知，采用超聲波預處理魚鱗對鈣的提取具有促進作用，這是因為超聲波具有空化作用、機械作用、熱效應(yīng)等，能增加物質(zhì)分子運動頻率和速度，增加提取劑的穿透力，從而可以提高目標成分的浸出率[22]；而預煮處理不利于鈣的提取，這可能是因為經(jīng)過熬煮的魚鱗變得黏稠，不利于鈣的溶出，所以，后續(xù)實驗中魚鱗均不采用水煮前處理，只采用超聲輔助提取。

2.2 液料比對得鈣率的影響

圖2 液料比對得鈣率的影響Fig. 2 Effect of solvent-to-solid ratio on calcium yield

由圖2可知，在液料比為15∶1時，得鈣率上升較快，超過20∶1后，得鈣率有緩慢上升，最終幾乎趨于平衡。當液料比低于10∶1，由于水分少，提取過程中體系濃稠，不利于鈣的溶出，提取液也不易抽濾分離，會造成損失，所以液料比20∶1時較為合適。

本研究將調(diào)查對象鎖定為在南寧動物園游玩的家庭型游客。為保證被調(diào)查對象符合研究條件，研究者將調(diào)查地點定于南寧動物園大門前，被調(diào)查對象必須是從園內(nèi)游玩出園的家庭型游客，問卷由被調(diào)查者獨立完成，并通過訪談獲得被調(diào)查者的信息。調(diào)查于2017年10月24日開始至11月6日結(jié)束，共發(fā)放調(diào)查問卷220份，收回有效問卷214份，有效問卷回收率97%。

2.3 CCM制備工藝的正交試驗優(yōu)化結(jié)果

由表2可知，各個因素及其交互作用對結(jié)果影響的主次順序為混合酸總質(zhì)量分數(shù)＞超聲時間＞超聲溫度＞蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比；由表3方差分析可知，混合酸總質(zhì)量分數(shù)、超聲時間對得鈣率影響極顯著，超聲溫度對得鈣率影響顯著，而蘋果酸與檸檬酸質(zhì)量比對得鈣率影響不顯著；魚鱗得鈣的最優(yōu)組合為A3B2C4D3，即最佳制備工藝條件為蘋果酸與檸檬酸總質(zhì)量分數(shù)12%、質(zhì)量比2∶1、超聲溫度70 ℃、超聲時間1.0 h；驗證最佳組合，平行實驗3 次，取均值，最終得鈣率為18.97%，比表2中最佳組合得鈣率18.68%略高，說明正交試驗結(jié)果是可靠的。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Results and analysis of orthogonal array design

表3 正交試驗方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal array design

2.4 羅非魚魚鱗復合鈣產(chǎn)物的形貌觀察及結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 紅外光譜分析

從圖3可看出，混合物的紅外光譜圖僅為檸檬酸鈣及蘋果酸鈣兩者紅外光譜圖的簡單疊加，并無新峰出現(xiàn)。從圖4可以看出，魚鱗復合鈣產(chǎn)物與混合物紅外光譜圖明顯不同，明顯不是兩組分的疊加，魚鱗復合鈣產(chǎn)物的特征峰為3 399.94、3 324.73、2 898.53、1 683.58、1 548.58、1 452.16、825.40、597.83 cm－1，這與劉紅玲[5]研究報道的結(jié)果相近。結(jié)合圖3和圖4分析可知，蘋果酸鈣的特征峰為3 438、1 625、1 544、1 450、1 386、1 095、825、570 cm－1，這說明在魚鱗復合鈣產(chǎn)物中蘋果酸鈣的特征吸收體現(xiàn)較多較強，與李淑芳等[8]等研究結(jié)果基本相似。據(jù)文獻報道，檸檬酸、蘋果酸的羰基峰在1 739～1 700 cm－1范圍內(nèi)[23-24]，魚鱗復合鈣產(chǎn)物在1 683.58、1 548.58 cm－1處出現(xiàn)羧酸根的反對稱vas（COO—）和對稱vs（COO—）的伸縮振動吸收峰，與蘋果酸和檸檬酸羰基峰位置相比，向低波段移動，說明檸檬酸和蘋果酸兩種酸的羧基中氧原子與鈣形成了配位鍵，發(fā)生了絡(luò)合反應(yīng)；并且在570～597 cm－1內(nèi)出現(xiàn)的吸收峰可推測為Ca－O伸縮振動吸收峰[25]；從圖4還可以看出，魚鱗復合鈣產(chǎn)物中出現(xiàn)3 324.73 cm－1和2 898.53 cm－1兩個特征峰，這相對于羥基（3 400 cm－1）特征吸收峰向低波段移動并出現(xiàn)寬化現(xiàn)象，說明復合鹽中形成新的氫鍵[26-27]，這也顯示該復合鹽并不是由一定量的檸檬酸鈣和蘋果酸鈣簡單的混合在一起形成的。目前雖然還沒有CCM復合鹽的標準結(jié)構(gòu)，僅通過紅外光譜分析也還不能完全確定CCM復合鹽的具體結(jié)構(gòu)，但本實驗可以判斷魚鱗復合鈣產(chǎn)物存在與文獻報道相符的CCM結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中存在檸檬酸與蘋果酸形成的氫鍵，結(jié)構(gòu)中以蘋果酸占優(yōu)勢，推測這種鈣鹽也與文獻[5]、[8]具有類似的結(jié)構(gòu)。

圖3 檸檬酸鈣、蘋果酸鈣以及混合物的紅外圖譜比較Fig. 3 IR spectra of calcium citrate, calcium malate and their mixture

圖4 混合物與羅非魚魚鱗復合鈣產(chǎn)物的紅外圖譜比較Fig. 4 IR spectra of a mixture of calcium citrate and calcium malate and CCM

2.4.2 XRD分析

從圖5可看出，混合物的XRD圖僅為檸檬酸鈣及蘋果酸鈣兩者XRD圖的簡單疊加，并無新峰出現(xiàn)。從圖6可以看出，魚鱗復合鈣產(chǎn)物與混合物的XRD圖明顯不同，魚鱗復合鈣產(chǎn)物在0°～10°內(nèi)沒有尖銳的特征峰出現(xiàn)，但在16.66°、21.32°和3 1.54°處出現(xiàn)了3 個尖銳峰形，且特征峰的數(shù)目增多，這也說明魚鱗復合鈣鹽不是檸檬酸鈣和蘋果酸鈣兩組分的簡單疊加。

圖5 檸檬酸鈣、蘋果酸鈣以及混合物的XRD圖比較Fig. 5 XRD patterns of calcium citrate, calcium mala te and their mixture

圖6 混合物與羅非魚魚鱗復合鈣產(chǎn)物的XRD圖比較Fig. 6 XRD patterns of a mixture of calcium citrate and calcium malate and CCM

2.4.3 比表面積分析

羅非魚魚鱗復合鈣產(chǎn)物晶體氮氣物理吸-脫附等溫曲線、BET比表面曲線和孔容-孔徑綜合分布曲線分別如圖7～9所示，分析數(shù)據(jù)見表4。從圖7可以看出，羅非魚魚鱗復合鈣的氮氣物理吸-脫附等溫曲線為典型的III型吸附等溫線[28]，表明復合鈣鹽對氮氣的吸附比較微弱[29]。綜合分析，羅非魚魚鱗復合鈣孔徑為4.049 nm，單點吸附總孔體積為0.320 cm3/g，孔徑4 nm之后，孔容越來越大；T-圖法微孔（外）比表面積為385.703 m2/g。

圖7 羅非魚魚鱗復合鈣產(chǎn)物的等溫吸-脫附曲線Fig. 7 Isothermal adsorption and desorption curves of CCM

圖8 羅非魚魚鱗復合鈣產(chǎn)物的BET比表面曲線Fig. 8 T-graph curve of CCM

圖9 羅非魚魚鱗復合鈣產(chǎn)物的孔容-孔徑綜合分布圖Fig. 9 Pore volume-pore size distribution curves of CCM

表4 羅非魚魚鱗復合鈣鹽比表面積和孔隙結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 4 Specific surface area and pore structure data of CCM

2.4.4 掃描電鏡分析

羅非魚魚鱗復合鈣產(chǎn)物的掃描電鏡圖如圖10所示，可知復合鹽晶體是有棱角的六方形體。

圖10 羅非魚魚鱗鈣產(chǎn)物的掃描電鏡圖Fig. 10 SEM of CCM

3 結(jié) 論

研究確定羅非魚魚鱗只用超聲輔助提取的得鈣率相對比較高且穩(wěn)定，無需采用預煮處理；在液料比為20∶1條件下，正交試驗優(yōu)化得到魚鱗復合鈣的最佳制備工藝條件為蘋果酸與檸檬酸的總質(zhì)量分數(shù)12%、質(zhì)量比2∶1、超聲溫度70 ℃、超聲時間1.0 h，此條件下得鈣率為18.97%，高于譚文溢等[30]以草魚魚鱗制備CCM的得鈣率（8.56%）。將產(chǎn)物進行除雜、濃縮結(jié)晶，得到復合鈣鹽晶體。紅外光譜及XRD分析均顯示制備產(chǎn)物不是檸檬酸鈣與蘋果酸鈣的簡單混合物，而與CCM結(jié)構(gòu)吻合；掃描電鏡觀察到產(chǎn)物結(jié)晶呈六方形；晶體比表面積介孔測定知羅非魚魚鱗復合鈣產(chǎn)物孔徑為4.049 nm，單點吸附總孔體積為0.320 cm3/g，T-圖法微孔（外）比表面積為385.703 m2/g。

在本實驗研究基礎(chǔ)上，后續(xù)將進行3 個方面的研究：1）對羅非魚魚鱗復合鈣的溶解性（包括溫度、pH值對復合鈣的溶解度及鈣溶解量）進行系統(tǒng)研究； 2）與檸檬酸鈣、蘋果酸鈣、檸檬酸鈣與蘋果酸鈣的混合物、碳酸鈣的溶解性進行比較；3）以羅非魚魚鱗鈣為主要原料，研發(fā)一種補鈣制劑。