百合鱗莖青霉病菌對不同藥劑敏感性測定

楊士杰 占軍平

摘要 [目的]研究百合鱗莖青霉病菌對不同藥劑的敏感性。[方法]以嘧菌酯、醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑為試劑，每個試劑均設置0.01、0.10、1.00、5.00、10.00、100.00 ?μg/mL 6個濃度，采用菌絲生長速率法，將供試百合鱗莖青霉病菌單孢菌株在含藥平板上分別進行敏感性測定。[結果]醚菌酯和丙環(huán)唑?qū)Π俸削[莖青霉病菌抑制率較高，苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯抑菌率相對較低。百合鱗莖青霉病菌對醚菌酯的EC50小于敏感菌株標準值0.455 μg/mL，百合鱗莖青霉病菌對醚菌酯敏感;百合鱗莖青霉病菌對丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑的EC50分別為0.471和0.541 μg/mL，均略大于敏感菌株標準值0.455 μg/mL，介于0.455～0.911 μg/mL，百合鱗莖青霉病菌對丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑敏感性相對較低，即病菌對這2種藥劑均表現(xiàn)為低抗;百合鱗莖青霉病菌對嘧菌酯的EC50為8.185 μg/mL，大于高抗標準值3.644 μg/mL，是敏感菌株標準值0.455 μg/mL的17.98倍，即病菌表現(xiàn)為高抗。[結論]該研究為合理選用藥劑、防治百合鱗莖青霉病提供參考。

關鍵詞 百合鱗莖青霉菌;敏感性測定;醚菌酯;嘧菌酯;苯醚甲環(huán)唑;丙環(huán)唑

中圖分類號 S436.8+1文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）04-0147-03

Abstract [Objective]To study sensitivity of lily bulb penicillium to different fungicides.[Method]Using pyrimidine，ether ester，phenyl ether methyclozole，procyclazole as reagents，each reagent was set at 0.01，0.10，1.00，5.00，10.00，100.00 μg/mL concentration，using mycelial growth rate method，the sensitivity of the single spore strain of Lilium miltiorrhiza viridis was determined on the tablet containing the drug.[Result]The inhibition rate of ether ester and procyclole was higher and that ?of benzene ether mezazole and pyrimidine was lower.Through regression analysis，the EC50 of Lilium mildew was less than the standard value of 0.455 μg/mL of the sensitive strain，so the Lilium mildew was sensitive to Ethericum;The EC50 of Lilium miltiorrhiza was 0.471 and 0.541 ?μg/mL，respectively，slightly higher than the standard value of 0.455 μg/mL of sensitive strains，between 0.455 and 0.911 μg/mL，Therefore，the sensitivity of Lilium miltiorrhiza to procyclazole and diphenyl ether was relatively low，that was，the bacteria showed low resistance to both of these agents;The EC50 for pyrimidine esters was 8.185 μg/mL，which was greater than the high resistance standard value of 3.644 ?μg/mL.It was 17.98 times the sensitive strain standard value of 0.455 μg/mL，that was，the pathogen was highly resistant.[Conclusion]The study provide a reference for the rational selection of pharmaceutical and prevention and treatment of Lily bulb green mildew.

Key words Penicillium buld penicillium;Sensitivity test;Diazoate;Azoxazole;Diphenoxazole;Paclobutrazol

百合鱗莖青霉病常發(fā)生于貯藏期，該病主要危害百合鱗莖[1]。當百合鱗莖表面有該病菌且在儲藏期間遇到高溫、高濕的情況后，病菌就會大量繁殖。病菌從傷口侵入，后迅速進入鱗莖內(nèi)部，使其失去價值，造成巨大損失[2]

，貯藏后期百合逐漸衰弱也給該病蔓延創(chuàng)造了條件[3]。據(jù)統(tǒng)計，在儲藏期間百合鱗莖青霉病平均感染率在50%以上，嚴重時甚至可達100%。針對百合鱗莖青霉病這一嚴重問題，國內(nèi)不少學者對百合鱗莖青霉病進行了研究。Chauhan等[4]用風信子種球作為試材研究發(fā)現(xiàn)，在9 ℃條件下存儲，青霉病在空氣相對濕度80%時比50%發(fā)病更嚴重。

王彩霞等[5]研究發(fā)現(xiàn)當濃度50 mg/L、40 ℃時醚菌酯能有效地控制青霉病，但高濃度的醚菌酯會使百合鱗莖造成藥害。李漸鵬等[6]研究發(fā)現(xiàn)碳酸鈉、硼砂和殼聚糖組成的防腐劑對青霉病有很好的抑制效果。楊迎東等[7]采用多種農(nóng)藥試劑對青霉病進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)用50%咪鮮胺進行處理能有效地抑制青霉病。

由于多年用藥抑制青霉病，已導致百合鱗莖青霉病病菌對一些藥劑產(chǎn)生了一定程度的抗藥性，Bollen[8]將百合種球上分離出來的2個青霉菌品種Penicillium brevicompaetum和P.corymbiferum分別接種到含有苯菌靈等農(nóng)藥的培養(yǎng)基上，結果顯示這2種青霉菌對苯菌靈、甲基托布津、噻苯咪哇等化學農(nóng)藥有較強的耐藥性，且在普通瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)90 d后，耐藥性仍未減弱。為了解目前常用藥劑醚菌酯、嘧菌酯、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑?qū)η嗝共〔【拿舾袪顩r，筆者研究了百合鱗莖青霉病菌對不同藥劑的敏感性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株。

2016年從宜春市郊東門蔬菜批發(fā)市場采集百合鱗莖青霉病菌樣品，在室內(nèi)進行單孢分離純化后得到單孢菌株，通過斜面（4 ℃）和濾紙片法低溫（-20 ℃）保存在江西省宜春學院植物保護實驗室。

1.1.2 供試藥劑。

98%嘧菌酯原藥由上虞穎泰精細化工有限公司生產(chǎn);95% 醚菌酯原藥由江蘇鹽城福利德化工有限公司生產(chǎn);95%苯醚甲環(huán)唑原藥由湖北康寶泰精細化工有限公司生產(chǎn);95%丙環(huán)唑原藥由常州天擇化工有限公司生產(chǎn);以上原藥均用丙酮溶解配制成1×104 ?μg/mL的母液，放置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL ，用于百合鱗莖青霉病菌對嘧菌酯、醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑敏感性測定。

1.1.4 供試儀器及常用器皿。

SW-CJ-1B超凈工作臺，由蘇州尚田潔凈技術有限公司生產(chǎn);SYQ-DSX-280滅菌鍋，由上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn);MJP-250培養(yǎng)箱，由上海森信實驗儀器有限公司生產(chǎn);BCD-539WT冰箱，由青島海爾股份有限公司生產(chǎn);ME204G電子天平，由梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn);鑷子、挑針、打孔器、接種環(huán)、電爐、三角瓶、容器瓶、棕色廣口瓶、封口膜、直尺等為實驗室常用耗材。

1.2 試驗方法

1.2.1 含藥培養(yǎng)基的制備。將嘧菌酯稀釋成0.01、0.1、1、5、10、100 μg/mL 6個濃度置于45 ℃ PDA培養(yǎng)基中，制成含藥平板。分別將醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑稀釋成0.01、0.10、1.00、5.00、10.00、100.00 μg/mL置于PDA培養(yǎng)基中，制成含藥培養(yǎng)基平板。

1.2.2 敏感性測定。采用菌絲生長速率法[9]，將供試百合鱗莖青霉病菌單孢菌株在含藥平板上分別進行嘧菌酯、醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑的抗藥性測定。每種藥劑均設置0.01、0.10、1.00、5.00、10.00、100.00 μg/mL 6個濃度，以不加藥劑的平板為空白對照;在新鮮的百合鱗莖青霉病菌菌落邊緣打取6 mm的菌餅，接種于含藥培養(yǎng)基的平板中央，在23 ℃黑暗培養(yǎng)72 h，測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制百分率，制作抑菌率變化趨勢圖，并求出毒力回歸方程、相關系數(shù)、有效抑制中濃度（EC50值）。

抑制率=（對照菌落生長直徑-藥劑處理菌落生長直徑）/（對照菌落生長直徑-接種菌的菌餅直徑）×100%

抗性水平依據(jù)紀明山等[10]的敏感基線值進行判別，當菌株的EC50值小于0.455 μg/mL時為敏感菌株;當菌株的EC50值處于0.455～0.911 μg/mL時為低抗菌株;當菌株的EC50值處于0.911～3.644 μg/mL時為中抗菌株;當菌株的EC50值大于3.644 μg/mL時為高抗菌株。

2 結果與分析

2.1 不同試劑對百合鱗莖青霉病菌的抑菌率及抑菌趨勢 由圖1可知，醚菌酯和丙環(huán)唑?qū)Π俸削[莖青霉病菌的抑菌率相對較高，在低濃度0.01 μg/mL時二者抑菌率均在50%以上;5.00 μg/mL時二者抑菌率均在80%以上;二者抑制效果接近。相比之下，苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯對百合鱗莖青霉病菌的抑菌率相對較低，但當濃度大于5.00 μg/mL時苯醚甲環(huán)唑抑菌率明顯升高。嘧菌酯對百合鱗莖青霉病菌的抑菌率在5.00 μg/mL時一直較低，僅高濃度100.00 μg/mL時抑菌率較高。

2.2 不同試劑、不同濃度間抑菌差異性分析

根據(jù)嘧菌酯、醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑?qū)Π俸削[莖青霉病菌的抑菌率，方差分析結果表明，濃度間F值為16.13，在0.05水平上的顯著值是2.90，F(xiàn)=16.13>F0.05（5，15）=2.90，濃度間差異顯著，即6種不同濃度0.01、0.10、1.00、5.00、10.00、100.00 μg/mL對百合鱗莖青霉病菌的抑菌率差異顯著。

不同試劑間F值為11.09，在0.01水平上的顯著值是5.42，因此F=11.09>F0.01（3，15）= 5.42，不同種試劑間差異極顯著，即嘧菌酯、醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑4種不同試劑對百合鱗莖青霉病菌的抑菌率差異極顯著。

用LSD法做相互比較，經(jīng)計算得出LSD0.05=17.11%，LSD0.01=23.66%。

從表1可以看出，相鄰兩濃度間抑菌率無顯著差異，不相鄰兩濃度間抑菌率存在顯著差異，如在濃度1.00與10.00 μg/mL間和100.00與5.00 μg/mL間抑菌率存在顯著差異，濃度間相隔越大抑菌率顯著性差異也越大。

用LSD法做相互比較，經(jīng)計算得出LSD0.05=13.98%， LSD0.01=19.33%。從表2可以看出，丙環(huán)唑與醚菌酯，苯醚甲環(huán)唑與嘧菌酯間抑菌率無顯著差異，丙環(huán)唑、醚菌酯分別與苯醚甲環(huán)唑間抑菌率存在顯著差異，丙環(huán)唑、醚菌酯分別與嘧菌酯間抑菌率存在極顯著差異，且丙環(huán)唑和嘧菌酯的抑菌率顯著性更大。