胡華萍 孫磊 王艷芬 等

摘要 [目的]建立同時測定霍山黃大茶中5種兒茶素類成分及咖啡因的UPLC定量分析方法。[方法]采用梯度洗脫法同時測定EC、ECG、EGC、EGCG、GC、caffeine，選用Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm），流動相為乙腈-甲酸-水梯度洗脫，體積流量為0.2 mL/min，柱溫設(shè)為30 ℃，檢測波長210 nm。[結(jié)果]測定了霍山黃大茶中兒茶素類和咖啡因的含量，EC、ECG、caffeine、EGC、EGCG和GC分別在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r>0.999 5），平均回收率分別為98.82%、97.30%、96.96%、96.59%、98.89%和100.11%，RSD為1.0%～1.8%。[結(jié)論]該方法快速簡捷、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用做霍山黃大茶質(zhì)量分析方法。

關(guān)鍵詞 霍山黃大茶;兒茶素類;咖啡因;UPLC分析

中圖分類號 TS207.3文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）04-0202-03

Abstract [Objection]The research aimed to establish an UPLC method for determination of five elected catechins and caffeine in Huoshan Yellow Big Tea.[Method]The extracts of the tea by ultrasonic extraction was analyzed on a Waters BEH C18 column （2.1 mm × 100 mm，1.7 μm） with a mobile phase of acetonitrilewater （containing 0.5% formic acid） for gradient elution at 210 nm，flow rate was set at 0.2 mL/min.[Result]The content of catechins and caffeine in Huoshan Yellow Big Tea was determined.EC，ECG，caffeine，EGC，EGCG and GC had good linear relations in the corresponding range （r>0.999 5），and the average recoveries were 98.82%，97.30%，96.96%，96.59%，98.89%，100.11%，respectively.RSD was 1.0%-1.8%.[Conclusion]The method is quick and simple，has high sensitivity and good reproducibility，and can be used as a quality analysis method of Huoshan Yellow Big Tea.

Key words Huoshan Yellow Big Tea;Catechins;Caffeine;UPLC analysis

茶葉是山茶科植物茶[Camellia.sinensis （L.） O.Ktze]的芽葉，味苦、甘，性微寒[1]。茶葉譽為世界最為流行的健康飲料，烏龍茶、黑茶（普洱茶、茯磚茶等）在抗氧化、肝保護、降血糖等方面表現(xiàn)出較好的生理活性[2-5]。黃大茶屬于輕度發(fā)酵茶，是從綠茶發(fā)展而來的，在加工過程中需要經(jīng)過萎凋、殺青、悶黃、提香等工序，最終形成黃大茶特有的色澤油潤，黃葉黃湯，滋味濃厚甜潤，香氣焦香濃郁[7-8]。綠茶味濃，收斂性強，黃茶滋味鮮濃醇爽，究竟是黃茶在悶黃過程中濕熱條件下的高熱反應(yīng)還是微生物的參與使其生化成分會發(fā)生系列變化的緣故值得進一步的研究。該研究以霍山黃大茶（又名皖西黃大茶）為研究對象，利用UPLC色譜方法對其主要活性物質(zhì)兒茶素類及咖啡因成分進行分析，建立一種快速測定霍山黃大茶中棓兒茶酸（GC）、（-）-表沒食子酸兒茶素（EGC）、咖啡因（caffeine）、表兒茶素（EC）、（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和（-）-表兒茶素沒食子酸酯（ECG）的含量測定方法。

1 材料與方法

1.1 試材 霍山黃大茶樣品采購于安徽霍山縣亨大茶業(yè)有限公司，經(jīng)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)李葉云博士鑒定;對照品EC、ECG、caffeine、EGC、EGCG和GC均來自于武漢天植生物技術(shù)有限公司，批號依次為CFN98781、CFN99570、CFN99004、CFN97549、CFN99569、CFN99137，純度大于98%;乙腈（Tidea Co.Ltd），甲酸均為色譜純，超純水自制。

1.2 儀器 Waters Acquity UPLC 超高效液相色譜儀（ 美國Waters公司，配備Acquity UPLC QSM、Acquity UPLC Sample Manager FTN、Acquity UPLC PDA Detector 以及Empower 工作站）;FA2004型萬分之一電子分析天平（上海精科天平）;CP225D型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯）;Milli-Q 純水機（美國Millipore 公司）;KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）;Fz-02型二兩裝高速中藥粉碎機（溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠）。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備。稱取GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG 適量，精密稱定。分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度分別為0.210、0.215、0.216、0.200、0.212和0.201 mg/mL的對照品貯備液。

1.3.2 供試品溶液的制備。黃大茶粉末（50目篩）0.25 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加25 mL 70%甲醇溶液，室溫下浸泡24 h后超聲提取30 min，過濾，濾液加70%甲醇定容于50 mL容量瓶中，精密吸取5 mL濾液加70%甲醇定容至10 mL，0.22 μm濾膜濾過，即得。

1.3.3 色譜條件。色譜柱為waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;流動相為乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B）梯度洗脫，洗脫程序為0～5 min，8～14% A;5～9 min，14～22.5% A;9～15 min， 22.5% A;15～17 min，22.5～8% A;17～23 min，8% A;體積流量為0.2 mL/min;檢測波長為210 nm;柱溫為30 ℃;進樣量為2 μL。

1.3.4 線性關(guān)系考察。精密吸取“1.3.1”項下GC、ECG、EGC、EC、EGCG和caffeine對照品貯備溶液100、200、400、800、1 000、2 000 μL于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度線，搖勻。依照“1.3.3”色譜條件，記錄色譜圖，測量峰面積并記錄。以對照品質(zhì)量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)（A）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算6種對照品線性回歸方程。

1.3.5 樣品含量測定。按照“1.3.2”方法制備各批次霍山黃大茶樣品溶液，按照“1.3.3”方法進樣，用外標(biāo)法計算各物質(zhì)含量，每個樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇 試驗中嘗試采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸-水、甲醇-甲酸-水等流動相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用酸時，GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG分離度及對稱性均良好，保留時間適中。同時發(fā)現(xiàn)乙腈-甲酸-水比甲醇-甲酸-水分離度更好，最后確定的流動相條件為乙腈-0.5%甲酸水梯度洗脫，色譜圖見圖1。兒茶素類化合物分子結(jié)構(gòu)中含有多個酚羥基，加入甲酸后能有效的防止拖尾改善峰形。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 GC、ECG、EGC、EC、EGCG、caffeine的保留時間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表1。結(jié)果表明，在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗。

精密稱取霍山黃大茶0.25 g，按“1.3.2”方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣 6次，記錄色譜圖，結(jié)果表明，GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG的色譜峰峰面積的RSD值分別為0.3%、1.0%、0.8%、0.9%、1.0%、0.8%，說明該儀器精密度好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗。

稱取霍山黃大茶0.25 g，精密稱定，按“1.3.2”方法制備供試品溶液。分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h 進樣1 次，外標(biāo)法計算得樣品中GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG含量的RSD 分別為0.4%、0.8%、0.5%、0.3%、1.0%、0.9%，表明供試品溶液中6種成分在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗。

稱取霍山黃大茶0.25 g，平行6份，精密稱定，分別按“1.3.2”方法制備供試品溶液。按“1.3.3”進樣測定。計算各供試品中GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG含量的RSD值分別為0.8%、1.0%、1.1%、1.0%、0.2%、0.3%，說明該方法重復(fù)性良好，符合定量分析的要求。

2.3.4 回收率試驗。

精密稱取已知6種被測成分含量的黃大茶樣品約0.1 g，平行6份，每組分別按黃大茶中GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG含量的100%，加入對照品溶液，按“1.3.2”方法制備供試品溶液，在“1.3.3”色譜條件下進樣測定，計算回收率及其RSD。結(jié)果見表2，各成分的平均回收率為96.59%～100.11%，RSD為1.0%～1.8%，表明這6種化學(xué)成分加樣回收率符合定量分析要求。

2.4 樣品含量測定

利用上述建立的方法，對霍山亨大茶葉有限公司2016年生產(chǎn)的6批（S1～S6）霍山黃大茶中兒茶素及咖啡因進行含量測定。從測定并計算的黃大茶藥材中GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG含量（表3）可看出，霍山黃大茶中兒茶素類成分含量最高的為EGCG，這與其他類型茶葉測得的結(jié)果相吻合[8-9]。

3 討論與結(jié)論

兒茶素類化合物分子結(jié)構(gòu)中含有多個酚羥基，極性較大且顯示一定的酸性，分離存在一定的難度。因此，該研究嘗試在流動相系統(tǒng)中添加一定量的甲酸來改善其分離度，采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸-水、甲醇-甲酸-水等流動相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用酸時，GC、EGC、caffeine、EC、EGCG、ECG分離度及對稱性均良好，保留時間適中。同時發(fā)現(xiàn)乙腈-甲酸-水比甲醇-甲酸-水分離效果更好，最后最終選擇乙腈-0.5%甲酸-水系統(tǒng)梯度洗脫。兒茶素類化合物在水中的溶解性并不好，溫度和光線均能使發(fā)生氧化、聚合，通過單因素試驗，考察提取溶劑、料液比、提取方法及提取時間等因素對所測幾種化學(xué)成分的影響，最終確定供試品溶液的提取方法為冷浸24 h后，加70%甲醇，1∶50料液比，超聲提取 30 min。

黃大茶為輕發(fā)酵茶，其采摘時間與加工過程有異于其他高端茶葉，其品質(zhì)與茶樹品質(zhì)特性、采摘季節(jié)和加工工藝密切相關(guān)，其產(chǎn)生的生理活性與其內(nèi)在成分又密切相關(guān)。兒茶素類化合物是茶葉的主要化學(xué)成分[10]，為天然高效低毒的抗氧化劑，同時在抑菌和神經(jīng)保護方面表現(xiàn)出較好的活性;咖啡因是一種中樞神經(jīng)興奮劑，是茶葉中提神醒腦

的主要活性成分。試驗借助超高效液相色譜的高速、靈敏和高分離度的特性，首次建立霍山黃大茶中兒茶素類及咖啡因快速分析方法，為霍山黃大茶的質(zhì)量控制及后續(xù)的研究提供參考。

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