周婷 楊惠婷 胡計(jì)紅 朱夢(mèng)珠 洪榮欽 潘東明 佘文琴 陳桂信

摘? 要? 以日本單頭切花菊‘白扇的頂芽和帶腋芽莖段為外植體，對(duì)其組培快繁技術(shù)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：初代培養(yǎng)中，先用75%酒精消毒30 s，后用0.1%升汞溶液消毒，頂芽和帶腋芽莖段最佳消毒時(shí)間分別為3 min和4 min，初代最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，平均芽誘導(dǎo)率為100%，平均單芽數(shù)達(dá)1.69個(gè)。以無菌苗腋芽莖段進(jìn)行擴(kuò)增繁殖，其最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L，30 d后增殖系數(shù)達(dá)3.05，有效芽率65.26%，平均株高3.22 cm;瓶內(nèi)生根培養(yǎng)時(shí)，添加了NAA和IBA的1/2MS培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)生根，生根率達(dá)100%;也可瓶外生根，插穗浸蘸NAA溶液5 min后插入基質(zhì)，生根效果良好。本研究結(jié)果可以為‘白扇的大面積推廣和產(chǎn)業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)種苗提供理論與技術(shù)指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞? 單頭切花菊;‘白扇;組培快繁中圖分類號(hào)? Q813.1? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

Abstract? Using terminal buds and stems with axillary buds as the explants， the technology of tissue culture and rapid propagation of standard cut chrysanthemum ‘Baishan was studied. The best sterilization conditions of apical bud explants and axillary buds was 75% alcohol 30 s+0.1% HgCl2 for 3 min and 4 min. The best primary culture medium of ‘Baishan was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L with the best inducing effect rate 100% and average single bud induction 1.69. The optimal proliferation medium was MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L with multiplication coefficient 3.05， effective rate of bud 65.26% and average height 3.22 cm cultivated 30 d after. The 1/2MS medium supplemented with NAA and IBA could induce rooting in bottles， and the rooting rate was 100%. It could root outside bottles. The buds was inserted into the substrate after 5 minutes of immersion in the NAA solution， and the rooting condition was good. The results could be applied directly for production popularization of ‘Banshan. The results could provide theoretical and technical guidance for the large-scale promotion and industrialization of ‘Baishan and standardized production of seedlings.

Keywords? standard cut chrysanthemum; Chrysanthemum ‘Baishan; tissue culture and rapid propagation

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.014

‘白扇（Chrysanthemum‘Baishan）是優(yōu)良的白色單頭切花菊品種，主要出口至日本和韓國，是上述國家舉行葬禮和祭祖拜神的必需品。在6—9月，日本白菊市場(chǎng)基本被夏菊品種‘白扇占據(jù)，因而研究該品種的繁殖和栽培技術(shù)，特別是組培快速繁殖技術(shù)對(duì)于開拓日本夏菊市場(chǎng)具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。

我國種植的‘白扇種苗均從日本購入，由于種苗市場(chǎng)壟斷，生產(chǎn)成本高，難以進(jìn)行大規(guī)模推廣應(yīng)用?！咨葌?cè)芽易萌發(fā)開花，且多次扦插繁殖容易造成品種退化，種植者難以長期自主扦插繁殖。目前我國尚沒有關(guān)于單頭切花菊‘白扇組培與快速繁殖技術(shù)的研究，而通過本研究所建立的單頭切花菊新品種的組培快繁體系，對(duì)打破優(yōu)質(zhì)單頭菊種苗的壟斷、加速引進(jìn)的單頭切花菊優(yōu)良品種產(chǎn)業(yè)化提供優(yōu)質(zhì)種苗和技術(shù)支持，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

王蔚林[1]以2個(gè)傳統(tǒng)名貴菊花品種的葉片和花蕾為外植體進(jìn)行研究，獲得了高效再生體系。王卉等[2]對(duì)13個(gè)品種的地被菊進(jìn)行組織培養(yǎng)，并以不同的部位作為外植體進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)以莖尖及腋芽作為外植體時(shí)，均能直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，而其他部位需要經(jīng)過脫分化形成愈傷組織，再分化成新的植株。楊玉萍等[3]的研究表明，以根、葉片、葉柄為外植體分化不定芽，不定芽的誘導(dǎo)率最高。菊科植物的無菌系建立和增殖培養(yǎng)通常采用MS培養(yǎng)基或MS改良培養(yǎng)基[4]。Renou等[5]試驗(yàn)結(jié)果顯示，6-BA和NAA為菊花再生的最適生長調(diào)節(jié)劑，目前菊花組培中這2種生長調(diào)節(jié)劑的使用也較多，KT、2， 4-D、TDZ也有一些應(yīng)用。唐煥偉等[6]將無根的食用菊試管苗用生長素處理后扦插至珍珠巖中，期間注意保持空氣濕度和土壤濕度，30 d后成活率達(dá)95%。

近年來國內(nèi)外研究者利用雜交育種、基因工程等技術(shù)開發(fā)和培育了許多性狀優(yōu)良的菊科花卉新品種[7-8]。優(yōu)良的新品種既需要數(shù)量上的快速增殖，也需要性狀上的穩(wěn)定保持，可以依靠植物組培快繁技術(shù)解決這一問題。目前菊科花卉的離體快繁研究日益成熟，但也有大量研究表明，由于每個(gè)品種的基因型不同，其離體再生體系沒有普遍性[9]。因此啟動(dòng)了本研究，建立單頭切花菊‘白扇的組培快繁體系，內(nèi)容主要包括外植體的選擇和消毒、植物激素的選擇與配比、培養(yǎng)條件的調(diào)節(jié)等方面。

1? 材料與方法

1.1? 材料

單頭切花菊‘白扇原種插穗由福建省尤溪縣三葉花卉有限公司從北京延慶縣永寧盛世鼎新菊苗場(chǎng)購買，插穗經(jīng)扦插形成種苗植株，掐取長度10 cm的插穗為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2? 方法

1.2.1? 初代培養(yǎng)? 將‘白扇插穗剪去葉片，切成1～1.5 cm的莖段，用1%雕牌洗衣粉溶液浸泡后用流水沖洗90 min，再用蒸餾水沖洗2次;將頂芽和帶腋芽莖段分別轉(zhuǎn)移至消毒過的三角瓶中，移到超凈工作臺(tái)，倒入75%酒精浸泡并不斷攪動(dòng)30 s，用無菌水沖洗數(shù)次，再加入0.1%升汞溶液進(jìn)行消毒，設(shè)置5個(gè)不同時(shí)間（2、3、4、5、6 min）的消毒處理，最后用無菌水沖洗5次。將頂芽和帶腋芽莖段接種于附加不同濃度6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L）一一組合至含30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基的pH為5.8～6.0，培養(yǎng)條件：溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度2000～3000 lx，光照時(shí)間12 h/d;每瓶接種1個(gè)外植體，每個(gè)處理接種30瓶，重復(fù)3次，于接種后20 d統(tǒng)計(jì)污染率和成活率，其中污染率=污染的外植體數(shù)/接種總外植體數(shù)?100%，成活率=成活的外植體數(shù)/接種總外植體數(shù)?100%。接種后30 d統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)率、單芽總數(shù)，并觀察外植體的生長狀況，其中芽誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出芽的外植體數(shù)量/接種總外植體數(shù)?100%，單芽總數(shù)=培養(yǎng)30 d后瓶內(nèi)有效單芽總數(shù)。

1.2.2? 增殖培養(yǎng)? 由于大田插穗分化較完全，而無菌苗各個(gè)部分均十分幼嫩，故增殖培養(yǎng)不再區(qū)分頂芽和腋芽。取初代培養(yǎng)中生長狀態(tài)一致的無菌苗，切成1～1.5 cm左右的帶芽莖段，接種至不同激素濃度的增殖培養(yǎng)基中，其中6-BA的濃度為1.0、1.5、2.0 mg/L，NAA為0.05、0.10、0.15 mg/L。培養(yǎng)基分為MS、1/2MS、1/4MS三種，一一組合成L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。培養(yǎng)條件同1.2.1;每個(gè)處理接種30瓶，每瓶接種5個(gè)帶芽莖段，重復(fù)3次，接種后30 d統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)和苗的生長情況，其中增殖系數(shù)=增殖培養(yǎng)后瓶內(nèi)總芽數(shù)/接種時(shí)的總芽數(shù)，有效芽率=有效芽數(shù)（株高≥1.0 cm）/增殖30 d后瓶內(nèi)總芽數(shù)?100%，株高（cm）=試管苗基部至頂芽的長度;用Excel 2003軟件和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。將初代培養(yǎng)中生長狀態(tài)一致的無菌試管苗切成1～1.5 cm左右的帶芽莖段，轉(zhuǎn)接至最佳增殖培養(yǎng)基（MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L）中，培養(yǎng)條件同1.2.1;光照時(shí)間設(shè)置3個(gè)處理：8、12、16 h/d，每個(gè)處理接種30瓶，每瓶接種5個(gè)芽，重復(fù)3次;接種后30 d統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)、有效芽率和平均株高（計(jì)算方法同1.2.1）。

1.2.3? 瓶內(nèi)生根培養(yǎng)? 生根培養(yǎng)基配方采用兩因素（NAA/IBA）四水平設(shè)計(jì)，基本培養(yǎng)基為1/2MS，僅添加NAA（0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L）4個(gè)處理和僅添加IBA（0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L）4個(gè)處理以及空白對(duì)照;將繼代培養(yǎng)中生長狀態(tài)基本一致的無菌苗切成2 cm左右的切段，接種至生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件均同1.2.1;每個(gè)處理接種30瓶，每瓶接3個(gè)芽，重復(fù)3次，接種后20 d觀察并統(tǒng)計(jì)生根情況，瓶內(nèi)生根率=生根苗總株數(shù)/接種總株數(shù)?100%，數(shù)據(jù)處理同1.2.2。

1.2.4? 瓶外扦插生根培養(yǎng)? 分別探討生根劑配方和基質(zhì)配比對(duì)無菌苗生根的影響。選取繼代培養(yǎng)基中生長健壯、株高整齊度較高（5～6 cm）的未生根無菌苗，將培養(yǎng)瓶移到自然條件下松開瓶蓋，煉苗1 d，再開蓋加入少量無菌水，再煉苗7 d。從瓶中小心取出無菌苗，從其基部剪下，基部用NAA（50、100 mg/L）和ABT生根粉（500 mg/L）分別浸蘸5 min后，插入無菌的移栽基質(zhì)（蛭石、蛭石∶珍珠巖=1∶1、草炭土∶蛭石=2∶1、草炭土∶蛭石∶珍珠巖=2∶1∶1）中，澆透水，移到溫室中。每個(gè)處理96株。晝夜溫度為25 ℃/20 ℃，空氣濕度為90%，基質(zhì)保持水分充足，每隔3 d觀察一次，扦插后7 d統(tǒng)計(jì)扦插生根率，扦插生根率=扦插生根總株數(shù)/扦插總株數(shù)?100%。

1.2.5? 生根苗的煉苗與移栽? 分別探討不同煉苗時(shí)間和移栽基質(zhì)對(duì)生根苗的移栽效果的影響。對(duì)生根培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d后的植株進(jìn)行煉苗，對(duì)生根苗先松蓋1 d后開蓋2、4、6、8 d再移栽的方式進(jìn)行煉苗，小心清洗無菌苗根部附著的培養(yǎng)基，移栽到無菌基質(zhì)（草炭土、草炭土∶蛭石=2∶1、草炭土∶珍珠巖=2∶1、草炭土∶蛭石∶珍珠巖= 3∶1∶1）中，每個(gè)處理96株，移栽后15 d統(tǒng)計(jì)移栽成活率，移栽成活率=移栽成活總株數(shù)/移栽總株數(shù)?100%。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 初代培養(yǎng)

2.1.1? 消毒時(shí)間對(duì)外植體消毒效果的影響? 不同消毒時(shí)間對(duì)頂芽和腋芽外植體的消毒效果有明顯差異。頂芽以0.1%升汞溶液消毒3 min消毒效果最好，消毒3 min和消毒4 min的污染率均為2.2%，其中消毒3 min后頂芽的成活率最高，達(dá)到96.7%。用0.1%升汞溶液消毒6 min后，污染率為0，但由于消毒時(shí)間過長造成毒害，成活率僅為30%。用0.1%升汞溶液消毒帶腋芽莖段4 min為最佳消毒時(shí)間，此時(shí)成活率達(dá)92.2%，污染率為4.4%。消毒5 min時(shí)的污染率為1.1%，但成活率僅為82.2%。消毒6 min時(shí)的污染率為0，但成活率迅速下降至55.5%。因此，以0.1%升汞溶液為消毒劑，頂芽外植體的最佳消毒時(shí)間為3 min，帶腋芽莖段的外植體最佳消毒時(shí)間為4 min。具體情況見表1。

2.1.2? 激素配比對(duì)無菌苗誘導(dǎo)的影響? 以頂芽作為外植體接種至不同激素配比的初代培養(yǎng)基中，以探討激素的種類和濃度對(duì)無菌苗誘導(dǎo)的影響，結(jié)果見表2。接種后30 d，在所有組合培養(yǎng)基中外植體基部均會(huì)產(chǎn)生愈傷組織，但分化情況出現(xiàn)差異。當(dāng)NAA濃度為0.2、0.3 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)量較多，說明NAA濃度較高不利于頂芽的萌發(fā)和不定芽的誘導(dǎo)，容易產(chǎn)生畸形芽或玻璃化;當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，6-BA濃度在0.5～1.5 mg/L之間時(shí)，均能誘導(dǎo)出大量無菌苗，當(dāng)6-BA濃度為1.0、1.5 mg/L時(shí)，芽誘導(dǎo)率均為100%，產(chǎn)生的無菌苗健壯、葉色濃綠，基部的愈傷組織呈淺綠色，并能分化出數(shù)量較多的不定芽，其中6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)芽誘導(dǎo)率（100%）和單芽總數(shù)（1.69個(gè)）均達(dá)到最大。為了進(jìn)一步說明激素配比對(duì)外植體無菌苗誘導(dǎo)的影響，利用SPSS軟件對(duì)初代培養(yǎng)中芽誘導(dǎo)率及單芽總數(shù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。經(jīng)過整理運(yùn)算，P<0.05，即在a=0.05水平上，各組的方差具有顯著性差異。綜上所述，切花菊‘白扇的最佳初代培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

2.2? 增殖培養(yǎng)

2.2.1? 培養(yǎng)基配方對(duì)無菌苗外植體增殖培養(yǎng)的影響? 由表3可見和圖1，在所有不同配方的培養(yǎng)基中，外植體基部均產(chǎn)生少量愈傷組織，但各處理間外植體的生長情況差異明顯。處理1（6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L）、處理6（6-BA 1.5 mg/L+ NAA 0.15 mg/L）、處理8（6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L）生長速度較快，植株健壯，葉片較大且葉色濃綠，其中以處理6的長勢(shì)最好。處理3（6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L）、處理5（6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L）、處理7（6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L）的無菌苗生長速度較慢，植株低矮，且部分無菌苗底部葉片變黃。綜上所述，以‘白扇無菌苗切段作為外植體進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種至MS+6-BA 1.5 mg/L+ NAA 0.15 mg/L中增殖系數(shù)最高，為3.05。

2.2.2? 培養(yǎng)基配方對(duì)無菌苗有效芽率的影響? 由表3可見，在各處理間有效芽率差異較大，其中處理6的平均有效芽率最高，高達(dá)65.26%，處理7的有效芽率最低，僅為27.98%。通過比較R值發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中的3個(gè)因素對(duì)有效芽率的影響大小依次為：基本培養(yǎng)基>NAA>6-BA。

用SPSS軟件對(duì)有效芽率進(jìn)行分析，P>0.05，即在a=0.05水平上9組配方之間不存在顯著性差異，方差具有齊次性，因此接下來采用LSD法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。NAA和基本培養(yǎng)基對(duì)‘白扇有效芽的誘導(dǎo)率具有顯著性差異（P<0.05），6-BA對(duì)有效芽的誘導(dǎo)率不具有顯著性差異（P>0.05）。

對(duì)F值進(jìn)行對(duì)比可知，3個(gè)因素的影響力大小依次為：基本培養(yǎng)基>NAA>6-BA。

2.2.3? 光照時(shí)間對(duì)無菌苗增殖培養(yǎng)的影響

將初代培養(yǎng)得到的無菌苗切成1～1.5 cm左右的帶芽莖段，接種至最佳激素組合的增殖培養(yǎng)基中（MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L），光照時(shí)間處理為8、12、16 h/d，接種后30 d統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)、有效芽率及平均苗高。由表4可知，在3個(gè)處理中，處理2（光照12 h/d）與處理3（光照16 h/d）的無菌苗最為健壯，生長速度較快，其中處理3的增殖系數(shù)和有效芽率均達(dá)到最大值，其平均苗高達(dá)3.44 cm，與處理1（光照8 h/d）之間極差達(dá)到2.02 cm，有效芽率與處理1之間極差達(dá)23.01%。

進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較得出，各組數(shù)據(jù)方差均具有齊次性，不同光照時(shí)間對(duì)增殖系數(shù)、有效芽率及平均芽高均有顯著性影響。切花菊‘白扇增殖培養(yǎng)的最佳光照時(shí)間為16 h/d。

綜上所述，切花菊‘白扇的最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L，增殖培養(yǎng)的最佳光照時(shí)間為16 h/d。

2.3? 瓶內(nèi)生根

將增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的無根苗，切成2 cm左右的切段，接種至不同激素配比的生根培養(yǎng)基中，接種20 d后觀察并統(tǒng)計(jì)生根情況（圖2）。由表5可見，培養(yǎng)基中添加生長素，對(duì)促進(jìn)無根苗生根具有良好效果，在生根率、生根根數(shù)、根長及根系粗細(xì)程度上，均起到促進(jìn)作用，對(duì)照組CK的生根率為96.67%，而添加了生長素的培養(yǎng)基中生根率均達(dá)100%，且根系生長粗壯。對(duì)以上數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明：不同濃度的NAA之間，生根率、根數(shù)、根長均沒有顯著性差異;不同濃度的IBA之間，上述各個(gè)指標(biāo)亦均不存在顯著性差異。添加NAA的培養(yǎng)基上，根系較添加IBA的處理組粗壯，但生根根數(shù)、根長均略低于IBA處理組。綜上所述，NAA和IBA均適合進(jìn)行‘白扇無根苗的生根。

2.4? 瓶外生根培養(yǎng)

從表6可看出，無菌苗用50、100 mg/L的NAA溶液處理5 min后，扦插的成活率和生根率均達(dá)為96.9%，平均生根數(shù)分別為18.7和19.0根，用ABT生根粉500 mg/L浸蘸后，成活率和生根率均為93.8%，平均生根數(shù)為12根，略低于其他兩組處理。因此，‘白扇無菌苗的最佳瓶外扦插生根劑為NAA 50 mg/L和NAA 100 mg/L。

移栽后5 d，觀察到4種不同配比的扦插基質(zhì)中，無根苗均開始生根;移栽后7 d統(tǒng)計(jì)成活率及生根率。由表7可見，無根苗在4種扦插基質(zhì)中的生根情況存在一定差異。其中，扦插到蛭石、蛭石∶珍珠巖=1∶1的無根苗成活率和生根率最高，均為96.9%，但蛭石∶珍珠巖=1∶1這個(gè)組合的平均生根根數(shù)較多，達(dá)14根。因此，‘白扇無菌苗的最佳扦插基質(zhì)為蛭石∶珍珠巖=1∶1。

綜上所述，瓶外扦插生根的最佳處理為將5 cm左右的無根苗基部用生根劑NAA 50 mg/L或NAA 100 mg/L處理浸蘸5 min后，扦插至蛭石∶珍珠巖=1∶1的組合基質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.5? 煉苗移栽

2.5.1? 煉苗時(shí)間對(duì)生根苗移栽效果的影響? 將生根培養(yǎng)20 d左右的無菌苗移到自然條件下，分別進(jìn)行不同時(shí)間的煉苗后，移栽至草炭土∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1的基質(zhì)組合中，移栽后25 d統(tǒng)計(jì)成活率。從表8中可知，松蓋1 d后開蓋6 d的煉苗效果最好，移栽成活率達(dá)100%，松蓋1 d后開蓋2 d的成活率最低，為88.54%，這可能是由于煉苗時(shí)間過短，無菌苗沒有充足的時(shí)間適應(yīng)復(fù)雜的外界環(huán)境，導(dǎo)致移栽后部分小苗出現(xiàn)萎蔫，最終枯死。松蓋1 d后開蓋8 d的成活率為91.67%，在煉苗過程中部分培養(yǎng)基發(fā)生污染，植株根系較綿軟，移栽時(shí)易發(fā)生斷根。因此，生根苗的最佳煉苗方式為：松開瓶蓋煉苗1 d，再開蓋煉苗6 d。2.5.2? 基質(zhì)配比對(duì)生根苗移栽效果的影響? 將生根培養(yǎng)20 d左右的無菌苗移到自然條件下進(jìn)行松蓋煉苗1 d，再開蓋煉苗6 d后，移栽至4種基質(zhì)配比的基質(zhì)中，移栽后20 d統(tǒng)計(jì)成活率和觀察小苗的生長狀態(tài)（圖3）。由表9可見，生根苗在草炭土∶蛭石=2∶1、草炭土∶珍珠巖=2∶1和草炭土∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1這3種移栽基質(zhì)中的成活率均為100%，其中草炭土∶蛭石∶珍珠巖= 3∶1∶1這個(gè)組合小苗的生長情況最佳，恢復(fù)迅速，且頂端有新葉長出，葉片大，葉色翠綠。4種移栽基質(zhì)中，草炭土的移栽效果最差，成活率為93.75%，在移栽過程中出現(xiàn)無菌苗易倒伏的情況。因此，生根苗的最佳移栽基質(zhì)為草炭土∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1。

綜合以上分析，生根苗的最佳移栽方式為：先松開瓶蓋煉苗1 d，再開蓋煉苗6 d，清洗掉根系上附著的瓊脂，最后移栽到草炭土∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1的基質(zhì)中。

3? 討論

組培快繁具有繁殖速度快、培養(yǎng)周期短、保持母本優(yōu)良性狀且不受地域、季節(jié)限制的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到花卉種苗的工廠化生產(chǎn)中，對(duì)于一些繁殖系數(shù)低或新引進(jìn)培育的花卉品種進(jìn)行組培快繁，可以短期內(nèi)獲得大量基因型一致的優(yōu)質(zhì)苗木[10-11]。

菊科植物常用的再生體系有2種，分別為誘導(dǎo)外植體直接分化不定芽成為新植株和誘導(dǎo)愈傷組織再分化這2種途徑。大多數(shù)的研究者認(rèn)為，由莖段或葉片作為外植體直接誘導(dǎo)不定芽，能較好的保持原有的遺傳性狀，避免變異和嵌合體的發(fā)生。Shinoyama等[12]研究表明通過愈傷組織途徑建立再生體系需要143～180 d，而不定芽直接誘導(dǎo)再生體系僅需80～120 d，且愈傷誘導(dǎo)體系比不定芽誘導(dǎo)體系的再生率低。本研究采用直接分化不定芽的方法，以‘白扇的頂芽和腋芽為外植體建立無菌株系，得出如下結(jié)果：頂芽外植體的最佳消毒條件為75%酒精30 s+0.1%升汞溶液消毒3 min;帶腋芽莖段的最佳消毒條件為75%酒精30 s+0.1%升汞溶液消毒4 min;在初代培養(yǎng)中，以頂芽誘導(dǎo)無菌苗或不定芽的效果比帶腋芽莖段更好，因此，頂芽為初代培養(yǎng)的最佳外植體;‘白扇的最佳初代培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L。

在植物組織培養(yǎng)中將不同的植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行組合搭配使用，會(huì)比單獨(dú)使用效果更佳。程蕾潔[13]研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)外植體的誘導(dǎo)過程中，用不同濃度的6-BA和NAA進(jìn)行組合比單一的采用6-BA對(duì)芽的萌發(fā)率影響更大。本研究結(jié)果表明，‘白扇無菌苗的增殖培養(yǎng)的最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L。并且隨著光照時(shí)間的延長，無菌苗的株高也隨之增加，當(dāng)光照時(shí)間為16 h/d時(shí)，平均株高均高于8 h/d和12 h/d，且無菌苗生長健壯、葉面積增大，這一結(jié)果與Adams等[14]和Kuril?ik等[15]的研究結(jié)果一致。

菊科植物為較易生根的草本植物，生根周期較短，在組培快繁中一般將無根試管苗接種至添加了NAA、IBA或IAA生長素的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)試管苗不定根產(chǎn)生，再進(jìn)行馴化移栽。陳燕梅[16]、王麗華[17]等研究表明，1/2MS培養(yǎng)基較MS培養(yǎng)基、1/4MS培養(yǎng)基更利于菊科花井的生根培養(yǎng)。本研究得出，只要添加了生長素的1/2MS培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)‘白扇無根苗生根，生根率達(dá)100%。無菌苗的馴化煉苗對(duì)其出瓶成活率起到關(guān)鍵作用，煉苗可以使無菌苗植株從恒溫、恒濕、無菌、高養(yǎng)分的環(huán)境逐漸過渡到復(fù)雜的自然環(huán)境中。經(jīng)煉苗移栽，即將‘白扇生根的無菌苗經(jīng)松蓋1 d，開蓋6 d進(jìn)行煉苗，移栽到基質(zhì)為草炭土∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1的穴盤中，移栽15 d后成活率達(dá)100%;草炭土∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1為最佳移栽基質(zhì)，移栽20 d后成活率達(dá)100%，小苗恢復(fù)迅速，長勢(shì)良好。

本研究不僅開展了有根試管苗的露地移栽，還嘗試了無根苗的瓶外生根試驗(yàn)。結(jié)果表明，瓶外扦插生根的最佳處理為將5 cm左右的無根苗基部用生根劑NAA 50 mg/L或NAA 100 mg/L處理浸蘸5 min后，扦插至蛭石∶珍珠巖=1∶1的組合基質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)。無根苗直接生根可以進(jìn)一步減少移苗步驟和移栽成本，可以快速的生產(chǎn)‘白扇種苗，并且在實(shí)際應(yīng)用中可以將瓶苗直接交給切花菊生產(chǎn)企業(yè)，由生產(chǎn)者自主安排扦插時(shí)間，減少運(yùn)輸成本和能源消耗，做到種植季節(jié)種苗的持續(xù)供應(yīng)。

本研究的不足之處在于誘導(dǎo)的試管苗沒有經(jīng)過變異檢測(cè)，因此下一步的研究需要進(jìn)行田間觀察和分子鑒定，以確保繁育過程中種苗的一致性與高質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

王蔚林. 菊花再生體系的建立及用PPMADS5基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的研究[D]. 北京： 首都師范大學(xué)， 2007.

王? 卉， 劉少翔， 趙處文， 等. 地被菊組培快繁及栽培技術(shù)研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)， 1995， 35（1）： 49-51.

楊文雅. 切花多頭菊莖尖離體培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究[D]. 銀川： 寧夏大學(xué)， 2014.

楊玉萍， 李宜蕓， 李茜雯， 等. 紫錐菊葉柄高效再生體系的建立[J]. 華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2015， 47（4）： 94-97.

Renou J， Brochard P， Jalouzot R. Recovery of transgenic chrysanthemum （Dendranthema grandiflora Tzvelev） after hygromycin resistance selection[J]. Plant Science， 1993， 89（2）： 185-197.

唐煥偉， 曲彥婷， 李? 黎， 等. 食用菊花組培苗瓶外生根的研究[J]. 黑龍江科學(xué)， 2013， 4（3）： 30-31.

[7] 張冬菊. 切花菊品種遺傳多樣性研究與雜交育種[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013.

肖秀麗. 出口專用型切花菊離體快繁及生產(chǎn)應(yīng)用技術(shù)研究[D]. 泰安： 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2005.

呂晉慧. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的AP1基因轉(zhuǎn)化菊花的研究[D]. 北京： 北京林業(yè)大學(xué)， 2005.

Thorpe T A. History of plant tissue culture[J]. Molecular Biotechnology， 2006， 318（2）： 169-180.

梁稱福. 植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展與應(yīng)用概況[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究， 2005， 23（4）： 99-105.

Shinoyama H， Kazuma T， Komano M， et al. An efficient transformation system in Chrysanthemum [Dendranthema grandiflorum （Ramat.） Kitamura] for stable and non-chimeric expression of foreign genes[J]. Plant Biotechnology， 2002， 19（5）： 335-343.

程蕾潔. ‘金山 繡線菊組織培養(yǎng)再生體系的建立[D]. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué)， 2009.

Adams S R， Langton F A. Photoperiod and plant growth： A review[J]. Journal of Horticultural Science & Biotechnology， 2005， 80（1）： 2-10.

Kuril?ik A， Dapku?niene? S， Kuril?ik G， et al. Effect of the photoperiod duration on the growth of Chrysanthemum plantlets in vitro[J]. Sodininkyste? Ir Darz?ininkyste?， 2008， 27（2）： 39-46.

陳燕梅. 福建名優(yōu)菊花工廠化試管育苗關(guān)鍵技術(shù)研巧[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2013.

王麗華. 銀膠菊組培技術(shù)及玻璃化防止措施研究[D]. 雅安： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2005.