韋金菊,宋修鵬,魏春燕,張小秋, 黃偉華,顏梅新

（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心/農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530007；2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,廣西 南寧 530007）

甘蔗屬C4作物，是1年生宿根熱帶和亞熱帶草本植物。目前巴西是全球甘蔗種植面積最大的國(guó)家，其次是印度，中國(guó)居第3位。中國(guó)甘蔗種植區(qū)主要分布在廣西、云南、廣東、海南等省(自治區(qū))。廣西由于其地理優(yōu)勢(shì)和適宜的氣候條件已成為我國(guó)主要的蔗糖原材料生產(chǎn)基地，甘蔗種植面積和蔗糖產(chǎn)量居全國(guó)首位［1］。

甘蔗黑穗?。⊿ugarcane smut）是一種世界重要的甘蔗病害。該病害的發(fā)生與危害，給甘蔗產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。甘蔗黑穗病最明顯特征是病蔗梢頭具一條向下內(nèi)卷的黑色鞭狀物。黑穗鞭中央是由寄主組織構(gòu)成的心柱，外圍包著一層厚垣孢子。染病蔗種萌芽早，莖細(xì)小，葉細(xì)長(zhǎng)、淡綠，分蘗增多，分蘗后長(zhǎng)出黑穗鞭［2］。黑穗鞭散落的冬孢子在甘蔗芽、甘蔗宿根和土壤中越冬，成為次年發(fā)病的初次侵染源。宿根蔗比新植蔗發(fā)病重［3］。該病于1877年在南非納塔爾首次被發(fā)現(xiàn)［4］，1940年以前僅限于東半球甘蔗產(chǎn)區(qū)發(fā)生危害，后來該病害蔓延至西半球蔗區(qū)［3］。我國(guó)則在1932年報(bào)道廣州發(fā)生甘蔗黑穗病，隨后廣西、云南、福建、臺(tái)灣等地相繼報(bào)道該病害的發(fā)生［3，5］。曾經(jīng)一度認(rèn)為澳大利亞是唯一免受甘蔗黑穗病侵?jǐn)_的國(guó)家，但1998年在澳大利亞的Ord River irrigation Area（ORIA）蔗區(qū)發(fā)生了甘蔗黑穗病，該病通過對(duì)感病的主栽品種N:Co310和Q117的侵染迅速在澳大利亞蔓延［6］。迄今，甘蔗黑穗病已成為甘蔗生產(chǎn)上一種普遍發(fā)生的甘蔗病害。本文綜述了甘蔗黑穗病病原、遺傳多樣性、病原菌致病機(jī)理和病害防治技術(shù)等方面的研究進(jìn)展，為今后甘蔗黑穗病的深入研究和防治提供參考。

1 甘蔗黑穗病病原和生物學(xué)特性

1.1 甘蔗黑穗病病原

甘蔗黑穗病病原為Sporisorium scitamineum（原學(xué)名為Ustilago. scitaminea）［2］，屬擔(dān)子菌亞門兩型真菌，具有其他黑粉菌相似的生活史，即冬孢子萌發(fā)產(chǎn)生單倍體孢子，單倍體通過芽殖繁殖，菌落呈酵母狀，孢子成雪茄狀，不具致病性；不同遺傳交配型的單倍體細(xì)胞通過有性配合形成雙核菌絲體，菌絲在培養(yǎng)基上不能進(jìn)一步擴(kuò)展，侵染寄主植物，在寄主體內(nèi)形成冬孢子完成其生活史［7］。

1.2 病原生物學(xué)特性

該菌冬孢子萌發(fā)的溫度范圍為15～40℃，菌絲生長(zhǎng)適溫15～35℃，冬孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的最適溫為25～30℃；冬孢子的致死溫度為49～50℃，62 ℃可使其立即失活，而在冰上至少可以存活3 d；冬孢子在蔗芽、土壤、蔗葉和蔗根提取液中萌發(fā)的時(shí)間分別為3.5、6.1、4.0、4.5 h，其中蔗芽提取液最適合冬孢子萌發(fā)，培養(yǎng)6 h后20.16%的冬孢子萌發(fā)；可利用多種碳源和氮源，1.5%葡萄糖溶液和蔗糖溶液最適合冬孢子萌發(fā)；菌體可在PDA,V-8 juice agar，malt extract agar以及glucose peptone agar 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好［8-9］。Bhuiyan等［10］對(duì)甘蔗鞭黑粉菌生物學(xué)特性進(jìn)行比較系統(tǒng)研究，認(rèn)為冬孢子的菌齡、侵染環(huán)境、溫濕度及時(shí)間等是影響孢子萌發(fā)和侵染的因素。一條黑穗鞭只有60%冬孢子能存活，而且靠近黑穗鞭基部的冬孢子僅30%能萌發(fā)；冬孢子接種在水瓊脂培養(yǎng)基上分別置于20、23、25、30、36℃的溫度培養(yǎng)下均可萌發(fā)，2 h開始萌發(fā)，7 h后萌發(fā)率達(dá)到最大。甘蔗種苗浸泡在31℃冬孢子懸浮液中10 min比浸泡在環(huán)境溫度13℃條件下發(fā)病率高。

2 甘蔗鞭黑粉菌的生理小種和多樣性分析

2.1 甘蔗鞭黑粉菌生理小種

甘蔗鞭黑粉菌生理小種是其致病力分化的結(jié)果，同時(shí)也是甘蔗抗黑穗病育種的前提和基礎(chǔ)。據(jù)報(bào)道美國(guó)夏威夷存在A、B 2個(gè)生理小種，巴基斯坦存在5個(gè)生理小種,巴西至少有2個(gè)生理小種，而中國(guó)臺(tái)灣存在3個(gè)生理小種［11-12］。甘蔗鞭黑粉菌生理小種的鑒定主要通過寄主鑒別法，不同的國(guó)家或地區(qū)所采用的鑒別寄主不同。中國(guó)大陸主要參照臺(tái)灣的鑒別寄主體系，即NCo310（感小種1，抗小種2），F(xiàn)134 （感小種2，抗小種1），NCo376（免疫），F(xiàn)273 （高感）。20世紀(jì)90年代中期中國(guó)大陸地區(qū)利用該體系鑒別了2個(gè)生理小種,分別為小種1和小種2，優(yōu)勢(shì)生理小種為小種2［13-14］。沈萬(wàn)寬等［15］在分析甘蔗對(duì)黑穗病抗性中推測(cè)廣東湛江蔗區(qū)可能存在第3個(gè)生理小種，且新小種可能為優(yōu)勢(shì)小種。劉睿等［16］對(duì)來自廣西的甘蔗鞭黑粉菌菌株進(jìn)行致病力分析，認(rèn)為生理小種2 仍然是廣西蔗區(qū)的優(yōu)勢(shì)小種，并發(fā)現(xiàn)了一些具有新致病力的菌株。

2.2 甘蔗鞭黑粉菌多樣性

遺傳多樣性（Genetic diversity）狹義上指種內(nèi)不同種群之間或是一個(gè)種群內(nèi)不同個(gè)體間的遺傳多態(tài)性程度。分子遺傳標(biāo)記技術(shù)已普遍應(yīng)用于植物病原真菌遺傳多樣性的研究，甘蔗鞭黑粉菌的分子標(biāo)記研究起步較晚，ITS、RAPD、AFLP、ISSR、SSR等分子標(biāo)記先后用于甘蔗鞭黑粉菌的遺傳多樣性分析中。由于地域差異以及采取分析方法的不同，各地區(qū)的甘蔗鞭黑粉菌多樣性存在不同程度的豐富度（表1）。

表1 甘蔗鞭黑粉菌多樣性Table 1 Genetic diversity of Sporiscrium scitamineum

3 甘蔗鞭黑粉菌致病機(jī)理

3.1 甘蔗鞭黑粉菌基因組和轉(zhuǎn)錄組分析

甘蔗鞭黑粉菌全基因組序列的測(cè)定使人們對(duì)甘蔗鞭黑粉菌有了新認(rèn)識(shí)?；蚪M大小約19.8 Mb, 包含約6 636 個(gè)基因，平均每個(gè)基因長(zhǎng)度為2.98 kb。192個(gè)基因跟致病性相關(guān)，其中31個(gè)在病菌各發(fā)育階段均能表達(dá)，主要編碼能量代謝和短鏈化合物氧化還原的酶類；68個(gè)屬于分泌效應(yīng)蛋白的候選基因；另有32個(gè)基因在病菌侵染寄主不同時(shí)期表達(dá)，可能跟誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)。同時(shí)作者還分析了MAT-1 的交配型基因 a locus 和 b locus，發(fā)現(xiàn) b locus 與 U. hordei、U.maydis 和 S. reilianum 的基因結(jié)構(gòu)和方向相同［23］。Taniguti 等［24］也獲得類似結(jié)果。甘蔗鞭黑粉菌侵染早期和侵染后期（黑穗鞭的形成）兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明：13.5%基因的表達(dá)水平因侵染階段的不同而存在差異，這些表達(dá)差異基因包含有細(xì)胞壁降解酶類、蛋白酶類、脂肪酶、幾丁質(zhì)修飾和木質(zhì)素降解酶類、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶和轉(zhuǎn)錄因子，作者認(rèn)為甘蔗鞭黑粉菌在與寄主互作過程中可能會(huì)通過調(diào)控某些基因表達(dá)來逃避寄主產(chǎn)生的活性氧和有毒代謝物所形成的抗性［24］。

3.2 甘蔗鞭黑粉菌有性配合和致病機(jī)理

甘蔗鞭黑粉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的成功構(gòu)建促進(jìn)了甘蔗鞭黑粉菌分子生物學(xué)研究［25］。Yan等［26］分離和鑒定了該病菌兩個(gè)不同性系交配型MAT-1和MAT-2菌株，通過綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白分別標(biāo)記MAT-1和MAT-2菌株，監(jiān)視和跟蹤其有性配合過程、冬孢子形成、冬孢子萌發(fā)及冬孢子萌發(fā)形成小孢子的減數(shù)分裂現(xiàn)象。另外通過同源克隆獲得了甘蔗鞭黑粉菌MAT-1和MAT-2交配型b位點(diǎn)基因，并驗(yàn)證了b位點(diǎn)基因與有性配合和致病性相關(guān)。同時(shí)把病菌 b位點(diǎn)基因轉(zhuǎn)入模式真菌U. maydis中，發(fā)現(xiàn)該基因能在U.maydis中起相似功能［2］。此外，還對(duì)b位點(diǎn)基因缺失突變體和野生型進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，驗(yàn)證了淀粉/蔗糖代謝和Hog1 MAPK信號(hào)途徑對(duì)有性配合的調(diào)控的關(guān)系［27］。Lu 等［28］用 a locus 的 Mfa2作為目標(biāo)基因，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行了精準(zhǔn)敲除和敲入，建立了該菌 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系。最近，Deng等［29］證實(shí)MAP Kinase SsKpp2與甘蔗鞭黑粉菌的有性配合和菌絲形成相關(guān)。另外，Chang等［30］的研究揭示了cAMP/PKA 信號(hào)在甘蔗鞭黑粉菌中通過調(diào)高細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，促使“+”“-”兩性單倍體細(xì)胞進(jìn)行有性配合形成具有侵染力的菌絲體侵染寄主。

4 甘蔗抗病育種

4.1 常規(guī)抗病育種體系的建立

抗病育種是最有效的防治植物病害的措施。據(jù)報(bào)道在1974年之前，甘蔗的抗病育種主要是自然篩選，即在黑穗病發(fā)生嚴(yán)重的蔗區(qū)種植甘蔗品種或者品系，讓其自然發(fā)病，經(jīng)多次抗性鑒定，淘汰感病品種和品系最終篩選抗病品種［31］。然而由于該抗病育種體系存在耗時(shí)長(zhǎng)、篩選量少、試驗(yàn)地需求大、效率低等缺陷，因此有必要建立新的抗病育種體系以加快抗病育種進(jìn)程［31］。

抗性鑒定及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的建立是甘蔗抗病育種體系的關(guān)鍵?？剐澡b定分為自然接種和人工接種鑒定,關(guān)于甘蔗黑穗病人工接種方法有多種，如孢子液涂芽法［32-33］、針刺涂抹法［32-33］、孢子懸浮液浸泡法［32-33］、“+”“-”孢子混合注射法［34］等。試驗(yàn)證明針刺涂抹法可以對(duì)高感和高抗品種和品系進(jìn)行快速鑒定，然而由于發(fā)病過于嚴(yán)重可能會(huì)忽略掉具有物理抗性的品種或品系，而孢子懸浮液浸泡法則認(rèn)為更接近于甘蔗鞭黑粉菌自然侵染的狀態(tài)［32］，因此該方法被普遍采納。

關(guān)于甘蔗抗黑穗病的抗性等級(jí)各國(guó)之間存在差異，各國(guó)根據(jù)當(dāng)?shù)氐那闆r，確定甘蔗黑穗病的抗性篩選壓力。如南非、印度、臺(tái)灣等采用0～9級(jí)分類法, 菲律賓、澳大利亞、新西蘭等采用1～9級(jí)分類法,而我國(guó)在“九五” 實(shí)施后統(tǒng)一采用1～9級(jí)分類法, 將其抗性等級(jí)大致分為HR (高抗)、R (抗 )、M(中抗 )、S (感 ) 和 HS (高感 ) 等 5 種類型［13］。通常將發(fā)病率在10%～12%以下劃分為R（抗?。┑燃?jí)［32，35-36］。1974年之后各國(guó)相繼建立比較規(guī)范的甘蔗常規(guī)育種體系［32，35-36］。

4.2 抗病機(jī)理及應(yīng)用

抗性機(jī)理的研究可為甘蔗抗病育種提供科學(xué)依據(jù)，甘蔗的抗性可分為外部抗性和內(nèi)部抗性兩部分，Marques等［37］發(fā)現(xiàn)甘蔗的外部抗性與芽鱗緊、厚以及毛的濃厚等結(jié)構(gòu)有關(guān)，抗病品種芽的毛較感病品種的濃和厚；抗病品種芽在受到甘蔗鞭黑粉菌的侵染時(shí)，與感病品種相比較，會(huì)分泌更多的苯丙烷、糖蛋白、酚類等化學(xué)物質(zhì)抵抗病原菌的入侵，這樣抗病品種在芽的外部形成第一層保護(hù)層。而當(dāng)病原菌成功侵入寄主后，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析，甘蔗鞭黑粉菌侵染寄主48 h后，寄主的反應(yīng)最為活躍。與感病品種相比，抗病品種在侵染點(diǎn)附近產(chǎn)生過敏性壞死，分泌木質(zhì)素（lignin）、糖蛋白（glycoprotein）、植保素（phytoalexins）和 多胺（polyamines）等化學(xué)物質(zhì)以及誘導(dǎo) R基因表達(dá)，形成第二層保護(hù)，以抵抗病菌的進(jìn)一步侵染［37-38］。

根據(jù)抗性與病原菌在寄主中的定殖和生理生化有關(guān)，有研究者通過檢測(cè)病菌侵入早期在寄主中的定殖情況以及寄主分泌的抗性物質(zhì)進(jìn)行甘蔗抗病品種鑒定，提高抗病育種效率。Su等［39］采用定量RT-PCR測(cè)試甘蔗鞭黑粉菌在寄主中的定殖，發(fā)現(xiàn)品種的抗性與病原菌在甘蔗中的定殖能力有一定的相關(guān)性。而通過檢測(cè)寄主受甘蔗鞭黑粉菌脅迫時(shí)的生理生化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)甘蔗品種的抗性與過氧化物酶（POD）、葡聚糖酶（b-1,3-glucanase）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等成正相關(guān)。Khan等［40］采用基于RAPD的 SCAR分子標(biāo)記找到與黑穗病抗性相關(guān)的基因片段，并進(jìn)行了驗(yàn)證。分子標(biāo)記等技術(shù)應(yīng)用于甘蔗的抗病育種，將會(huì)大大提高甘蔗的抗病育種效率，甘蔗抗病育種將會(huì)進(jìn)入分子輔助育種的階段。

5 甘蔗黑穗病防治措施

甘蔗黑穗病的防治遵守“預(yù)防為主，綜合防治”的植保方針策略，而選育和種植抗病品種是最為經(jīng)濟(jì)有效的防控途徑，此外，強(qiáng)化栽培管理、合理施肥和輪作也是綜合防治的基礎(chǔ)。

5.1 抗病品種的利用

目前國(guó)內(nèi)外都在選育抗黑穗病品種，印度選育出F134、2000A241、NCo310、98A163、81A99、Co7805、93A165等 7個(gè)中抗品種［41］。我國(guó)主要的抗性品種有選三、閩70-611、云蔗71-388、云蔗81-173等［3］，目前各地都在加大抗病育種力度，加強(qiáng)抗性材料篩選和抗病品種鑒定［36，42］。

5.2 農(nóng)業(yè)綜合防治

甘蔗生產(chǎn)中盡量選用無病蔗株留種，生產(chǎn)和種植無病蔗苗，及時(shí)清除田間的病殘?bào)w和病宿根，以減少田間甘蔗鞭黑粉菌菌源。帶病蔗種經(jīng)52℃處理3～4 h或54℃處理2～4 h，對(duì)甘蔗黑穗病能起到一定的防治作用，結(jié)合殺菌劑使用，其效果更好［43］。加強(qiáng)栽培管理，合理施肥，有條件的可實(shí)行水旱輪作或者與水稻、玉米、甘薯、花生、黃豆、苜蓿等作物進(jìn)行輪作以避免病菌長(zhǎng)期侵染危害甘蔗［3］。

5.3 生物防治

使用化學(xué)農(nóng)藥防治甘蔗黑穗病的效果并不佳，且過度使用易造成農(nóng)藥殘留和污染環(huán)境等問題，而生物防治具有無農(nóng)殘、環(huán)保、可持續(xù)性等優(yōu)點(diǎn)，是很有前景的一種防治方法。Sinha等［44］在甘蔗黑穗病發(fā)病植株上找到一種串珠鐮刀菌Fusarum. moniliforme ［Gibberella fujikuroi］，該菌株能分泌毒素抑制甘蔗鞭黑粉菌的冬孢子萌發(fā)。廖詠梅等［45］從甘蔗根際土壤及甘蔗不同組織內(nèi)分離獲得多個(gè)對(duì)甘蔗鞭黑粉菌有拮抗作用的細(xì)菌菌株，主要是熒光菌和非熒光菌中的白色菌群。Jayakumar等［46］從甘蔗節(jié)間、芽、根等組織分離篩選到對(duì)甘蔗鞭黑粉菌菌絲有抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌菌株，大田小區(qū)試驗(yàn)證實(shí)其中2個(gè)內(nèi)生細(xì)菌菌株ESR 7和ESR 21防效最好，且可促進(jìn)甘蔗生長(zhǎng)。Liu等［47］從土壤中分離，獲得一株能夠阻斷甘蔗鞭黑粉菌有性配合的細(xì)菌菌株ST4。測(cè)試分析表明，葡萄糖存在的情況下可促使菌株ST4產(chǎn)生拮抗化學(xué)物質(zhì)，而蔗糖、麥芽糖和果糖等均不能支持菌株ST4分泌拮抗化學(xué)物質(zhì)。溫室試驗(yàn)與上述結(jié)果一致，溫室試驗(yàn)表明細(xì)菌接種時(shí)添加2%葡萄糖后，菌株ST4的生防作用明顯增強(qiáng)，防治效果比無糖接種的處理高77%。新近報(bào)道海洋微生物中如放線菌［48］、海黃瓜共附生細(xì)菌［49］、海綿共棲細(xì)菌［50］等對(duì)甘蔗鞭黑粉菌均有抑制作用。另外生物表面活性劑鼠李糖脂亦可抑制甘蔗鞭黑粉菌的冬孢子萌發(fā)、小孢子的生長(zhǎng)［51］；而霉酚酸（Mycophenolic Acid）除了可抑制冬孢子萌發(fā)及小孢子生長(zhǎng)外，還可抑制甘蔗鞭黑粉菌的有性配合［52］。以上微生物或化學(xué)物質(zhì)具有開發(fā)成為生物農(nóng)藥的潛力。

6 展望

因甘蔗黑穗病對(duì)我國(guó)乃至世界甘蔗產(chǎn)業(yè)的嚴(yán)重影響，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已在致病機(jī)理、抗病育種、病原-寄主互作機(jī)制研究和防控措施等方面投入了大量精力，取得一定的成果。作者認(rèn)為應(yīng)加強(qiáng)以下幾個(gè)方面的研究：（1）我國(guó)在抗病育種方面還比較落后，需加強(qiáng)抗病育種材料（野生資源）的收集、抗性評(píng)價(jià)和利用工作。全面開展主栽品種以及雜交親本材料的黑穗病抗性評(píng)價(jià)。此外，開展抗病連鎖分子標(biāo)記研究，將常規(guī)育種和生物技術(shù)育種相結(jié)合，縮短育種周期。（2）在甘蔗鞭黑粉菌致病機(jī)理方面的研究已經(jīng)獲得突破，如遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及致病基因的鑒定等；然而在致病機(jī)理方面的研究還處于起始階段，對(duì)甘蔗鞭黑粉菌有性配合和致病機(jī)制的解析和致病基因的挖掘仍有很大空間。另外，在抗病機(jī)理方面也已開展了大量研究，也取得了一些成果，但研究的深度仍然不夠?；诮M學(xué)研究和功能分析，揭示病原-寄主互作機(jī)理，挖掘關(guān)鍵基因是一項(xiàng)重要工作。（3）雖然我國(guó)在甘蔗鞭黑粉菌遺傳多樣性方面進(jìn)行了大量的研究工作，但在生理小種的類型和分布仍然不明確。因此，需加強(qiáng)甘蔗鞭黑粉菌生理小種的鑒別研究，明確其類型，為抗病育種提供科學(xué)依據(jù)。（4）開展生物防治研究，可針對(duì)甘蔗鞭黑粉菌生活史的3個(gè)靶向，即冬孢子萌發(fā)、單倍體孢子生長(zhǎng)、“+”“-”孢子有性配合3個(gè)階段進(jìn)行生防菌的篩選，可開發(fā)出多個(gè)靶向、多類型的生物農(nóng)藥。