徐 匆，羅華建，李艷芳，黃 皓，梁衛(wèi)驅(qū)，胡 珊，胡楚維，羅鴻斌

（1. 東莞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心，廣東 東莞 523086；2. 東莞市理工學(xué)院生態(tài)環(huán)境工程技術(shù)研發(fā)中心，廣東 東莞 523808）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是 Notomi等［1］在 2000 年發(fā)明的一項(xiàng)能夠在恒溫條件下快速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，此方法利用針對(duì)靶序列中6個(gè)基因區(qū)段的2對(duì)引物及BstDNA polymerase在延伸DNA鏈的同時(shí)所具有的鏈置換活性，對(duì)目的片段進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增，不需經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)時(shí)雙鏈模板DNA的變性、退火及循環(huán)變溫過(guò)程，擴(kuò)增反應(yīng)在恒溫條件（61～65℃）下幾十分鐘即可完成(環(huán)引物的引入還可進(jìn)一步縮短反應(yīng)時(shí)間)。由于其快速、靈敏、對(duì)儀器要求低等特點(diǎn)，LAMP技術(shù)一經(jīng)報(bào)道，便在食品安全、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、種植、畜牧、水產(chǎn)等諸多行業(yè)的細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等檢測(cè)領(lǐng)域得到研究與應(yīng)用［2-9］。

在傳統(tǒng)LAMP的基礎(chǔ)上，研究者陸續(xù)將其與多項(xiàng)技術(shù)聯(lián)合使用，以擴(kuò)展及增強(qiáng)LAMP技術(shù)的實(shí)用性及準(zhǔn)確度，如與AMW反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合的反轉(zhuǎn)錄LAMP［10-11］，結(jié)合內(nèi)切酶酶切技術(shù)的多重LAMP［6,12］，結(jié)合酶聯(lián)反應(yīng)的LAMPELISA［13-14］，結(jié)合實(shí)時(shí)定量等技術(shù)的多種LAMP產(chǎn)物檢測(cè)法［15-17］等。本文就LAMP擴(kuò)增技術(shù)與多種技術(shù)結(jié)合后的方法進(jìn)行總結(jié)及舉例說(shuō)明和討論，以期為相關(guān)人員提供參考。

1 可視LAMP研究

1.1 與DNA結(jié)合的染料

LAMP反應(yīng)過(guò)程不斷產(chǎn)生雙鏈DNA，而SYBR Green I是一種能夠結(jié)合在雙鏈DNA雙螺旋小溝區(qū)域的染料。游離狀態(tài)時(shí)，SYBR Green I發(fā)出微弱熒光，肉眼觀察呈橙色；與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光增強(qiáng)，肉眼觀察呈綠色。因此，SYBR Green I也被利用于LAMP產(chǎn)物的檢測(cè)。

Chen等［18］針對(duì)Maize chlorotic mottle virus（MCMV）保守的外殼蛋白序列設(shè)計(jì)了一套4條的LAMP引物，這套引物能夠在60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的檢測(cè)。對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)使用SYBR Green I檢測(cè)產(chǎn)物和使用凝膠電泳所檢測(cè)到的RNA模板量都能達(dá)到2.5×10-6μg，敏感性比RT-PCR高10倍，且在對(duì)23株野外采集的玉米樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其敏感性也高于RT-PCR。

1.2 與離子結(jié)合的染料

鈣黃綠素能夠結(jié)合LAMP反應(yīng)體系中的Mg2+，使體系顏色由黃變綠。Besuschio等［19］利用鈣黃綠色這一特點(diǎn)結(jié)合LAMP技術(shù)檢測(cè)人體血液中的克魯茲錐蟲(chóng)，根據(jù)反應(yīng)體系的顏色變化來(lái)判斷檢測(cè)結(jié)果。該法針對(duì)性地?cái)U(kuò)增高重復(fù)性的衛(wèi)星序列，能從6個(gè)分型單位的克魯茲錐蟲(chóng)擴(kuò)增DNA，且成功從添加了EDTA和肝素的克魯茲錐蟲(chóng)血液中檢測(cè)到陽(yáng)性，而在擴(kuò)增地利什曼原蟲(chóng)、布魯西氏桿菌、蘭格利氏桿菌、惡性瘧原蟲(chóng)和未感染的人類(lèi)DNA時(shí)檢測(cè)結(jié)果呈陰性，該法靈敏度可達(dá)到 1×10-2fg/μL DNA。

Irin 等［20］根據(jù) HNB（Hydroxynaphthol blue）游離的負(fù)電荷能夠與PEI正電荷結(jié)合生成藍(lán)色沉淀這一反應(yīng)開(kāi)發(fā)了一種可以進(jìn)行半定量檢測(cè)的LAMP分析裝置。該裝置將PEI固定在紙上，然后把反應(yīng)生成的LAMP產(chǎn)物滴至樣品區(qū)間，再利用洗滌液將反應(yīng)產(chǎn)物浸潤(rùn)到PEI區(qū)域，從而使得LAMP體系內(nèi)的游離HBN與PEI結(jié)合而在紙上呈現(xiàn)出藍(lán)色，根據(jù)紙上標(biāo)記的距離能夠進(jìn)行反應(yīng)模板的半定量分析（圖1［20］）。這一裝置成功檢測(cè)到4.14×103拷貝/μL的E. coli基因組DNA。

圖1 半定量檢測(cè)的LAMP分析裝置Fig. 1 LAMP analytical device for semi-quantitative detection

可視染料結(jié)合LAMP的優(yōu)勢(shì)：（1）可直接將染料添加進(jìn)入反應(yīng)體系，不需開(kāi)蓋檢測(cè)；（2）裸眼可觀察，不需借助儀器、設(shè)備。缺點(diǎn)：（1）染料的添加可能會(huì)抑制DNA合成的進(jìn)行；（2）肉眼判斷容易產(chǎn)生誤差。

2 實(shí)時(shí) LAMP研究

2.1 實(shí)時(shí)濁度LAMP研究

Mori等［21］在2003年根據(jù)LAMP反應(yīng)過(guò)程會(huì)產(chǎn)生白色焦磷酸鎂沉淀的性質(zhì)，將real-time技術(shù)與LAMP技術(shù)結(jié)合，開(kāi)發(fā)出濁度儀，在650 nm波長(zhǎng)每隔30 s檢測(cè)焦磷酸鎂沉淀，結(jié)果顯示當(dāng)DNA模板初始濃度在2×103～2×109拷貝數(shù)的范圍內(nèi)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間與拷貝數(shù)對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性相關(guān)，可用于核酸定量。LAMP實(shí)時(shí)濁度法由于實(shí)現(xiàn)了對(duì)擴(kuò)增全過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)控，比終點(diǎn)檢測(cè)法效率更高、結(jié)果判定更準(zhǔn)確、檢測(cè)成本相對(duì)低廉，被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。

Li等［4］以16S核糖體RNA基因的保守區(qū)為目的基因，使用LA-320c LAMP濁度儀（Eiken Chemical, Tokyo, Japan） 建立了檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)勞森菌的LAMP技術(shù)。LAMP的最佳反應(yīng)條件為65℃，反應(yīng)時(shí)間為60 min，通過(guò)實(shí)時(shí)渾濁度檢測(cè)和直接目視檢測(cè)兩種方法均能檢測(cè)LAMP產(chǎn)物。LAMP的檢測(cè)極限為1.4×10-1pg的DNA，與實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)極限相同，靈敏度約為常規(guī)PCR檢測(cè)限的100倍。在136份臨床標(biāo)本中，有60份標(biāo)本中的勞森菌DNA經(jīng)LAMP檢測(cè)與實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果一致，高于常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果（36.8%，50/136）。且該方法具有針對(duì)勞森菌的特異性，可作為診斷細(xì)胞內(nèi)感染的一種有效的替代方法。

游淑珠等［22］同樣采用LAMP實(shí)時(shí)濁度法針對(duì)產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌（STEC） stx1、stx2基因的特異性序列進(jìn)行檢測(cè)，LAMP反應(yīng)能夠在60 min內(nèi)完成，且對(duì)非目的菌株檢測(cè)時(shí)未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，表現(xiàn)出良好的特異性。對(duì)食品樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示此方法具有較好的實(shí)際應(yīng)用前景。

Arunrut 等［23］介紹了一種以 Laem-Singh 病毒（LSNV）為模型的單管、實(shí)時(shí)、反轉(zhuǎn)錄、環(huán)介導(dǎo)的RT-LAMP病原體檢測(cè)裝置的原型。以RNA聚合酶（RDRP）基因作靶基因，檢測(cè)LAMP擴(kuò)增后白色不溶性焦磷酸鎂沉淀副產(chǎn)物形成的渾濁度。LSNV檢測(cè)的優(yōu)化方案是將樣品管在65℃下孵育1 h，在此期間連續(xù)測(cè)量濁度，通過(guò)反應(yīng)時(shí)間測(cè)量可得到定量結(jié)果。其檢測(cè)靈敏度與常規(guī)套式逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)相當(dāng)，與其他常見(jiàn)的蝦病毒無(wú)交叉反應(yīng)。該裝置也可應(yīng)用在現(xiàn)場(chǎng)或?qū)嶒?yàn)室環(huán)境下檢測(cè)其他病原體。

2.2 實(shí)時(shí)熒光LAMP研究

2.2.1 基于熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合的實(shí)時(shí)熒光SYBR Green I、SYTO系列等染料在未和雙鏈DNA結(jié)合時(shí)僅發(fā)出微弱熒光，結(jié)合后，熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，根據(jù)這一特點(diǎn)，這些染料可被應(yīng)用于DNA雙鏈合成的監(jiān)控與檢測(cè)。

Lin等［24］對(duì)鉤端螺旋體外膜蛋白lipl41基因進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，并在體系中加入SYBR Green I，用MJ Opticon 2系統(tǒng)（MJ Research, MA, USA）對(duì)擴(kuò)增曲線(xiàn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可方便地判讀結(jié)果。該法不依賴(lài)鉤端螺旋體的分離培養(yǎng)，與其他細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng)，檢測(cè)的限約為100拷貝，與PCR和實(shí)時(shí)PCR相同。LAMP法簡(jiǎn)便易行，成本低廉，可用于對(duì)鉤端螺旋體的快速、特異診斷。

Zeng等［25］使用SYTO 9作為核酸熒光染料對(duì)株豬塞內(nèi)加谷病毒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄熒光實(shí)時(shí)LAMP檢測(cè)，最低檢測(cè)限度為1 TCID50/ mL，比PCR和實(shí)時(shí)PCR分別低100倍和10倍；研究者對(duì)118份野外樣品進(jìn)行了檢測(cè)，實(shí)時(shí)RT-LAMP、PCR、實(shí)時(shí)PCR的敏感性分別為71.2%、34.7%、64.4%，表明該方法適用于SVA的快速檢測(cè)，具有較高的特異性、靈敏度和效率。這種實(shí)時(shí)RT-LAMP將是快速檢測(cè)豬塞內(nèi)加谷病毒感染和評(píng)估豬塞內(nèi)加谷病毒對(duì)豬作用的流行病學(xué)研究的一種有用替代方法。

Seyrig等［26］認(rèn)為L(zhǎng)AMP現(xiàn)場(chǎng)診斷工具應(yīng)具有需要體積小、功耗低、功能強(qiáng)大且價(jià)格低廉的光學(xué)組件以及節(jié)省試劑的小體積反應(yīng)等特點(diǎn)，因此比較不同熒光染料的信噪比（SNR）或閾值時(shí)間（Tt）對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)診斷工具的開(kāi)發(fā)至關(guān)重要。他們對(duì)11種染料在LAMP熒光實(shí)時(shí)法中的應(yīng)用進(jìn)行了研究、評(píng)價(jià)，在所有測(cè)試的染料中，SYTO-82、SYTO-84和 SYTOX Orange的 Tt最 短， 而SYTO-81的工作濃度范圍最廣。檢測(cè)應(yīng)用時(shí)，10 min內(nèi)可檢測(cè)到10個(gè)結(jié)核分枝桿菌基因組拷貝，20 min內(nèi)檢測(cè)到10個(gè)腸道賈第鞭毛蟲(chóng)基因組拷貝，15 min內(nèi)檢測(cè)到10份金黃色葡萄球菌或腸沙門(mén)氏菌基因組拷貝。表明，反應(yīng)效率取決于染料類(lèi)型、濃度和所選聚合酶。

2.2.2 基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的實(shí)時(shí)熒光 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）原理是將熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)配合使用，隨著DNA擴(kuò)增過(guò)程，熒光與淬滅基團(tuán)之間的空間距離增大，F(xiàn)RET作用消失，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光。根據(jù)FRET原理，研究者可將基團(tuán)固定在不同的堿基序列來(lái)發(fā)揮作用。

Wang等［6］將2套基團(tuán)（HEX/BHQ-1,Cy5-BHQ-2）分別固定在針對(duì)志賀氏菌ipaH基因和沙門(mén)氏菌invA基因的FIP（Forward Inner Primer）引物兩處，并在熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)之間引入切刻內(nèi)切酶Nb.BsrDI的酶切位點(diǎn)，隨著反應(yīng)進(jìn)行，F(xiàn)IP與互補(bǔ)鏈形成雙鏈結(jié)構(gòu)，Nb.BsrDI能將連接有熒光基團(tuán)的數(shù)個(gè)堿基從原鏈中切割出來(lái)，從而在熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間形成一定的空間距離，檢測(cè)到熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)。多重酶切實(shí)時(shí)LAMP法（MERT-LAMP）能在同一反應(yīng)體系中對(duì)志賀氏菌及沙門(mén)氏菌DNA的檢出限為62.5和125 fg，對(duì)菌株的檢出限分別為5.8、6.4 CFU。在63 ℃恒溫條件下，從19株志賀氏菌和14株沙門(mén)氏菌中提取基因組DNA，使用MERT-LAMP能在最短12 min內(nèi)獲得陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)根據(jù)不同的熒光曲線(xiàn)實(shí)時(shí)識(shí)別出樣品中存在的目標(biāo)病原體。

Tanner等［27］在FIP上加入淬滅基團(tuán)（Q-FIP），并設(shè)計(jì)一條與LAMP引物中的F1c引物互補(bǔ)的攜帶有熒光基團(tuán)的Fd探針，先將FIP與Fd退火互補(bǔ)，再加入反應(yīng)體系中，DNA擴(kuò)征過(guò)程中Fd被置換出來(lái)，F(xiàn)RET效應(yīng)消失。這種方法還能夠擴(kuò)展到LAMP反應(yīng)中的外引物和內(nèi)引物上。該方法具有高度的重復(fù)性和敏感性，可檢測(cè)到少于100拷貝的人類(lèi)基因組DNA。

還有研究者利用介質(zhì)位移法（mediator displacement, MD）進(jìn)行LAMP實(shí)時(shí)熒光，Becherer等［28］在LAMP體系中引入MD引物（包括具有Medc標(biāo)簽的LoopF引物，以及與Medc互補(bǔ)的Med序列）和一條攜帶有熒光和淬滅基團(tuán)的通用報(bào)告分子（universal reporter molecules，序列內(nèi)互補(bǔ)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，且含Medc片段和熒光及淬滅基團(tuán)）。2條MD引物在反應(yīng)前處于互補(bǔ)結(jié)合狀態(tài)，隨著反應(yīng)進(jìn)行Med被BIP（Backward Inner Primer）引物置換出來(lái)，被置換出來(lái)的Med再與廣譜報(bào)告片段上的Medc區(qū)結(jié)合，破壞其環(huán)狀結(jié)構(gòu)，解除基團(tuán)間的FERT狀態(tài)（圖2［28］）。在該研究中，MD檢測(cè)技術(shù)被應(yīng)用于HIV-1的RT-LAMP檢測(cè)，并與基于分子信標(biāo)(molecular beacon)的最新檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了分析設(shè)計(jì)和性能參數(shù)的比較，結(jié)果顯示，MD的信噪比比MB檢測(cè)高3倍，突出了使用通用報(bào)告分子的優(yōu)勢(shì)。這兩種檢測(cè)技術(shù)在檢測(cè)限(MD:131copies/reaction，MB:141131copies/reaction)、重復(fù)性、再現(xiàn)性和線(xiàn)性(R2=0.94 for MD and MB)的結(jié)果類(lèi)似。但MD檢測(cè)在其簡(jiǎn)單的分析設(shè)計(jì)以及檢測(cè)時(shí)間（陽(yáng)性時(shí)間比MB短4.1 min）上都體現(xiàn)出了優(yōu)勢(shì)。在引入2套通用報(bào)告分子后，MD檢測(cè)被成功應(yīng)用在對(duì)HIV-1和HTLV-1的多重RT-LAMP以及杜克雷嗜血桿菌和梅毒螺旋體的多重LAMP檢測(cè)上。MD檢測(cè)可以與固定化的通用報(bào)告分子結(jié)合，還可以基于除了熒光外的不同信號(hào)生成方法。將來(lái)在MD技術(shù)還能夠作為一種通用的檢測(cè)技術(shù)擴(kuò)展到使用鏈置換聚合酶的擴(kuò)增方法上。

2.2.3 自我淬滅熒光 Nazarenko等［29］研究指出，熒光染料基團(tuán)連接在寡聚核糖核苷酸鏈上時(shí)，其熒光信號(hào)與DNA鏈的初級(jí)及二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，當(dāng)染料結(jié)合在引物的特定位點(diǎn)如3′末端的第二位T堿基時(shí)，熒光信號(hào)僅有正常信號(hào)的0.13。Gadkar等［30］在LAMP FIP引物3′末端的第二位T堿基處結(jié)合熒光基團(tuán)，形成自淬滅熒光，用以檢測(cè)人的Varicella-zoster病毒，敏感度和特異性分別達(dá)到96.8%及100%。

上述實(shí)時(shí)濁度及基于熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合的實(shí)時(shí)熒光相對(duì)其他實(shí)時(shí)方法而言操作簡(jiǎn)單，但僅適用于單一LAMP檢測(cè)，對(duì)于多個(gè)檢測(cè)目標(biāo)并不適用；而基于FERT的實(shí)時(shí)熒光和自淬滅熒光則可以通過(guò)使用不同熒光基團(tuán)的標(biāo)記來(lái)進(jìn)行多重LAMP檢測(cè)。其中自淬滅熒光雖然需要的DNA片段更少，但由于其原理是基于DNA的初級(jí)及二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此對(duì)引物設(shè)計(jì)要求更高，背景噪音也會(huì)相對(duì)較高?；贔ERT的實(shí)時(shí)熒光中包含了多種設(shè)計(jì)，有些設(shè)計(jì)較簡(jiǎn)單，如Wang等［6］未在體系中額引外入物新的DNA片段，僅需在FIP上5′端添加酶切位點(diǎn)及熒光、淬滅基團(tuán)，使FIP本身形成FRET；在Tanner等［27］的研究中，需額外引入1條與FIP互補(bǔ)的DNA小片段，形成FRET；而B(niǎo)echerer等［28］的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更為復(fù)雜，在體系中額外引入了2條DNA片段，但這2條DNA片段并不具有針對(duì)待檢測(cè)目的片段的特異性，MD檢測(cè)體系建立后可廣泛地與多個(gè)LAMP結(jié)合，擴(kuò)展后還能應(yīng)用于其他DNA擴(kuò)增技術(shù)，具有通用性。

3 微流控LAMP研究

3.1 傳統(tǒng)微流控LAMP研究

微流控技術(shù)是20世紀(jì)90年代在毛細(xì)管電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的［31-32］，該技術(shù)集合多門(mén)學(xué)科，能夠?qū)?fù)雜、多步驟的實(shí)驗(yàn)過(guò)程集成在單個(gè)芯片上，實(shí)現(xiàn)整個(gè)過(guò)程的集成化與微型化，具有少樣品、快檢測(cè)、高通量、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。

Kaarj等［33］開(kāi)發(fā)了一種利用反轉(zhuǎn)錄LAMP技術(shù)的蠟紙微流控芯片，對(duì)自來(lái)水、人尿和人血漿中寨卡病毒的檢測(cè)證明了該技術(shù)的可行性，檢測(cè)限低至1 拷貝/μL。該芯片對(duì)各種紙微流控芯片的紙型、孔徑和通道尺寸進(jìn)行了研究和優(yōu)化，以確保在毛細(xì)管作用驅(qū)動(dòng)流動(dòng)過(guò)程中對(duì)直接使用的生物樣品進(jìn)行適當(dāng)過(guò)濾。當(dāng)寨卡病毒的RNA流到紙微流控芯片的檢測(cè)區(qū)域，立刻添加帶有pH指示劑的RT-LAMP混合物，用玻片密封，然后放置在68 ℃的熱板上，可在15 min內(nèi)觀察到擴(kuò)增后的顏色變化（由黃紅色變?yōu)辄S色），并通過(guò)智能手機(jī)測(cè)量綠色強(qiáng)度進(jìn)行量化。該技術(shù)平臺(tái)還可用于其他黃病毒，如基孔肯亞病毒和登革熱病毒，以及其他可能快速傳播的病毒病原體的現(xiàn)場(chǎng)診斷。

3.2 數(shù)字微流控LAMP研究

在微流控基礎(chǔ)之上，數(shù)字微流控（Digital Microfluidics, DMF）技術(shù)逐步發(fā)展起來(lái)，與傳統(tǒng)微流控技術(shù)相比，具有不依賴(lài)微泵、微閥、微混合器甚至三維流體通道等元件等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于生物微全分析體系［34］。

Tushar等［35］發(fā)明了一種以LAMP反應(yīng)作為核酸擴(kuò)增手段的數(shù)字微流控核酸檢測(cè)系統(tǒng)，他們利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制備微流體裝置，試劑（油相和樣品）通過(guò)帶有流量反饋的定制組裝流量控制器（IDEX Health and Science，LLC）輸送至裝置，然后在裝置上數(shù)字化成比色皿大小的液滴（圖3）。孵化區(qū)保持在63℃，定制的共聚焦熒光光譜裝置能夠從通過(guò)設(shè)備檢測(cè)區(qū)域的液滴中連續(xù)檢測(cè)熒光，該系統(tǒng)能夠達(dá)到每分鐘9 000個(gè)液滴的處理量，且DMF-LAMP可進(jìn)一步與毛細(xì)管連接，毛細(xì)管預(yù)先加載一系列樣品塞，這些樣品塞由油15（oil15）隔離，以便在單個(gè)裝置上無(wú)縫處理多個(gè)樣品。該研究以淋病奈瑟菌16S rRNA基因中的一段為檢測(cè)的目的片段，實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的最低目標(biāo)濃度為600 拷貝/μL。該檢測(cè)限受多種因素影響，其中一個(gè)因素是中等強(qiáng)度的液滴在閾值化后，其中一部分被誤判為陰性；此外，在陰性對(duì)照組中產(chǎn)生的假陽(yáng)性非特異性擴(kuò)增（大約為百萬(wàn)分之一到十個(gè)液滴）也限制了檢測(cè)極限。這些問(wèn)題可以通過(guò)優(yōu)化LAMP反應(yīng)來(lái)解決。

圖3 數(shù)字微流控LAMP分析示意圖［30］Fig. 3 The schematic diagram of droplet digital micro-fluidic LAMP analysis［30］

Wan等［36］開(kāi)發(fā)了一種手持自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)的無(wú)熱DMF裝置用于LAMP檢測(cè)，液滴操作和實(shí)時(shí)溫度控制系統(tǒng)集成在手持設(shè)備中，控制軟件可以安裝在任何平板電腦上。檢測(cè)時(shí)將具有電潤(rùn)濕力的2 μL樣品加載到夾層結(jié)構(gòu)的DMF芯片中，能大幅降低試劑消耗。該研究以血寄生蟲(chóng)布魯氏錐蟲(chóng)為模型，將2 μL樣品加載至DMF芯片中，反應(yīng)后加入高度濃縮的SYBR Green I，以避免反應(yīng)液滴暴露在空氣中引起氣溶膠污染，每個(gè)反應(yīng)能檢測(cè)到40拷貝。這種低成本、緊湊的設(shè)備去除了用于DNA檢測(cè)的笨重光學(xué)系統(tǒng)，非常適于非實(shí)驗(yàn)室測(cè)試。

微流控LAMP的優(yōu)勢(shì)在于能在極微小的封閉空間進(jìn)行LAMP反應(yīng)及結(jié)果檢測(cè)，既能有效控制樣品、試劑的使用量，又能實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，對(duì)結(jié)果的判讀準(zhǔn)確，且能在密閉空間完成對(duì)產(chǎn)物的檢測(cè)，避免產(chǎn)物形成氣溶膠污染。

4 橫向流及電化學(xué)LAMP研究

4.1 橫向流LAMP研究

橫向流（Lateral flow detect）是一種檢測(cè)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的新方法, 包括核酸擴(kuò)增（LAMP）、分子雜交（生物素標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光素標(biāo)記的探針雜交）及橫向流檢測(cè)（通過(guò)橫向?qū)游雠c試紙條上標(biāo)記有熒光素抗體、生物素抗體及熒光素抗體抗體結(jié)合，從而在檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)上顯示出特定顏色）3個(gè)步驟［37-38］。

Wang等［37］利用LAMP結(jié)合色譜側(cè)流試紙檢測(cè)強(qiáng)壯前溝藻的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔子基因，在LAMP引物FIP上標(biāo)記生物素，同時(shí)對(duì)FIP和BIP之間的序列設(shè)計(jì)特異性探針（AC-HP），探針5′末端標(biāo)記FITC。LAMP反應(yīng)完成后，AC-HP加入生物素標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物中進(jìn)行雜交，雜交產(chǎn)物加入LFD分析緩沖液后將試紙浸入，5 min后觀察結(jié)果。整個(gè)過(guò)程可在70 min內(nèi)完成檢測(cè)，檢測(cè)限約為10 cells/mL，敏感性與SYBY Green I LAMP相似，較傳統(tǒng)PCR高出100倍。

劉露等［38］建立了草魚(yú)呼腸孤病毒S8基因的橫向流LAMP技術(shù)檢測(cè)，與Wang等［37］工作原理類(lèi)似，在內(nèi)引物FIP上標(biāo)記生物素，在探針上標(biāo)記FAM。該體系的檢測(cè)限為970 fg，完成檢測(cè)所需時(shí)間為50 min，檢測(cè)極限表現(xiàn)雖不如熒光定量PCR，但更為簡(jiǎn)單、快速、便捷。

橫向流LAMP檢測(cè)方法具有判讀方便、需設(shè)備簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，但其在反應(yīng)完成后需要開(kāi)蓋進(jìn)行雜交，這一步驟可能會(huì)引起污染，造成后續(xù)實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性。

4.2 電化學(xué)LAMP研究

電化學(xué)DNA傳感器是生物傳感器的一種，主要有基于特異序列、適體底物、小分子與結(jié)合蛋白、DNA分子的DAN傳感器［39］。

Liu等［40］開(kāi)發(fā)了一種基于回路介導(dǎo)的LAMP的實(shí)時(shí)電阻測(cè)量法，對(duì)LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行了實(shí)時(shí)電阻監(jiān)測(cè)和導(dǎo)數(shù)分析。該方法原理是LAMP反應(yīng)產(chǎn)生兩種負(fù)離子，即DNA和焦磷酸鹽，它們與正離子染料結(jié)晶紫和Mg2+結(jié)合，導(dǎo)致反應(yīng)液電阻率增加。利用專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的電阻電極實(shí)時(shí)測(cè)量艱難梭菌DNA的電阻率變化，艱難梭菌的電化學(xué)檢測(cè)可以在0.5～1.0 h內(nèi)完成，檢測(cè)限為102 CFU/mL，與PCR方法相比，具有較高的準(zhǔn)確度（95.0%）、靈敏度（91.1%）和特異性（97.3%）。

Hashimoto等［41］開(kāi)發(fā)了一種新型電化學(xué)DNA芯片，利用GspSSD DNA聚合酶對(duì)插層氧化還原化合物具有一定耐受性的特點(diǎn)，對(duì)質(zhì)粒上的細(xì)小病毒VP2基因序列進(jìn)行實(shí)時(shí)電化學(xué)檢測(cè)。以LAMP反應(yīng)體系和釕銨(Ruhex)為插層氧化還原化合物，LAMP體系反應(yīng)進(jìn)行后產(chǎn)生的DNA能夠與釕銨靜電結(jié)合，電化學(xué)信號(hào)被放大，使用Corning?LSE?數(shù)字干浴加熱器將電化學(xué)DNA芯片安裝在定制的支架上，并在65℃下加熱。通過(guò)電化學(xué)分析儀620和多化合物684（Alsco.，Ltd）線(xiàn)性?huà)呙璺卜ㄟB續(xù)測(cè)量LAMP溶液中Ruhex的電壓變化。隨著陽(yáng)性樣品的LAMP反應(yīng)，Ruhex的陰極峰值電流增加，峰值電位增加。利用這項(xiàng)技術(shù)，在103～106份目的核酸之間有良好的重復(fù)性，檢出限為10 拷貝。電化學(xué)LAMP信號(hào)靈敏，結(jié)果判讀簡(jiǎn)易，具有開(kāi)發(fā)成為DNA檢測(cè)芯片的潛力。

5 結(jié)語(yǔ)

LAMP技術(shù)的突出特點(diǎn)是能夠在恒溫條件下快速擴(kuò)增DNA片段，這一特點(diǎn)決定此技術(shù)不需要昂貴儀器，且具有比常規(guī)PCR更高的敏感性，因此在核酸檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的運(yùn)用前景［42］。對(duì)于LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)，最初的方法是DNA凝膠電泳技術(shù)［1］，但使用此技術(shù)存在兩個(gè)弊端：一是耗時(shí)，LAMP技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)之一是快速，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)將整體時(shí)間延長(zhǎng)了20～30 min；二是假陽(yáng)性，LAMP產(chǎn)物在開(kāi)蓋后易形成氣溶膠污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境，極易造成后續(xù)實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性，如能不開(kāi)蓋檢測(cè)可有效避免檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性，增強(qiáng)其準(zhǔn)確性。為了增強(qiáng)LAMP的實(shí)際應(yīng)用能力，研究者們將多種技術(shù)與其相結(jié)合，以期能夠開(kāi)發(fā)出既能發(fā)揮LAMP優(yōu)勢(shì)，又能夠避免其劣勢(shì)的DNA檢測(cè)技術(shù)。

目視LAMP費(fèi)用低，適合多環(huán)境下使用；實(shí)時(shí)LAMP、微流控LAMP以及電化學(xué)LAMP法皆避免了開(kāi)蓋檢測(cè)，有效提高了樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確度，且在通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)行程度可減少檢測(cè)時(shí)間；橫向流LAMP雖需要擴(kuò)增產(chǎn)物暴露在空氣中，但其具有可操作性強(qiáng)、便于判讀等特點(diǎn)，同樣具有實(shí)用價(jià)值。

LAMP的主要應(yīng)用方向?yàn)槿?、?dòng)物、植物病原微生物的檢測(cè)，但目前由于仍然存在短板如試劑相對(duì)昂貴、易造成假陽(yáng)性、集成檢測(cè)設(shè)備不成熟、模板需進(jìn)行較為復(fù)雜的預(yù)處理等而極少被應(yīng)用在野外檢測(cè)。因此，LAMP未來(lái)的研究、應(yīng)用發(fā)展方向可集中在研發(fā)集成式、體積小、操作便捷、通量高、易判讀、低費(fèi)用的手持式檢測(cè)儀。