劉祿，楊娜，劉智

遂寧市中心醫(yī)院1病理科，2檢驗科，四川 遂寧 629000

宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是一組與宮頸浸潤癌密切相關(guān)的特異性癌前病變，常提示正常宮頸上皮組織發(fā)展為宮頸浸潤癌的過程。從宮頸癌前病變發(fā)展為宮頸癌需要約10年時間，而85%的CINⅢ級病變最終發(fā)展為宮頸浸潤癌[1]。如能早期發(fā)現(xiàn)癌前病變，并在癌前病變階段就進行醫(yī)學干預(yù)，可明顯提高宮頸癌的治愈率。目前，宮頸薄層液基細胞學檢測（thinprep liquid-based cytology test，TCT）是篩查CIN及宮頸癌的主要方法之一，但TCT方法存在諸多缺陷，如受主觀因素的影響較大、靈敏度較低等。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)子宮頸TCT結(jié)果為陰性，而組織活檢結(jié)果為CIN，導致臨床細胞學診斷結(jié)果為假陰性[2-3]。因此，提高CIN的檢出率顯得尤為重要。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宮頸癌和CIN發(fā)生的重要危險因素[4]，持續(xù)感染高危型HPV與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近130種HPV亞型，其中，單一感染HPV高危亞型主要為HPV16、18、26、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66、68、82，這15種HPV高危亞型主要引起CINⅡ～Ⅲ級病變以及宮頸癌的發(fā)生[5]。中國不同區(qū)域的宮頸高度病變及宮頸癌多以感染高危型HPV16和HPV18為主[6]。本研究探索TCT陰性的CINⅢ級病變患者的HPV感染情況和感染亞型特點，以輔助宮頸癌前病變的篩查，降低假陽性率，同時為HPV疫苗接種提供一定的參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年7月至2016年6月于遂寧市中心醫(yī)院診治的100例TCT檢測結(jié)果為陰性且經(jīng)陰道鏡活檢判定為CINⅢ級的患者為研究組。TCT檢測時，使用特定的宮頸刷，按照相關(guān)操作規(guī)程在宮頸管和宮頸口旋轉(zhuǎn)數(shù)圈，將收集的宮頸脫落細胞送往病理科進行檢測。陰道鏡活檢在電子陰道鏡引導下，多點采樣。納入標準：①無宮頸側(cè)切或?qū)m頸全切病史；②距離研究開始的1個月內(nèi)未進行宮頸病變相關(guān)的藥物治療；③采樣及活檢前3天未使用陰道內(nèi)藥物；④均有性生活史，且采樣前3天未發(fā)生過性行為。排除標準：①妊娠期或者哺乳期婦女；②存在急性生殖道炎癥；③近期內(nèi)使用過性激素；④依從性差，不配合本研究。研究組患者的年齡為25～60歲，平均年齡為（38.89±4.31）歲；漢族75例，其他民族25例；有服藥史92例，無服藥史8例。同期另選取100例子宮頸浸潤性鱗狀細胞癌（squemous cell carcinoma，SCC）患者為對照組。對照組患者的年齡為23～62歲，平均年齡為（39.15±3.90）歲；漢族80例，其他民族20例；有服藥史87例，無服藥史13例。兩組患者的年齡、民族和服藥史比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。所有患者均對本研究知情同意并簽署知情同意書，且本研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會審核通過（L/SCSN-L023）。收集兩組患者的石蠟包埋病灶組織。

1.2 儀器與試劑

Bioer Life-Express PCR擴增儀由博日科技有限公司提供，生物恒溫雜交儀、DNA提取試劑和HPV基因分型檢測試劑均由深圳亞能生物有限公司提供。

1.3 HPV-DNA提取

無菌棉拭子插入被檢查者宮頸口，勻速用力旋轉(zhuǎn)5周后取出，置于試管中。HPV DNA采用單管多重聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-反向點雜交（reverse dot blot，RDB）技術(shù)檢測。單管PCR反應(yīng)管中含有21種特異性引物，可以同時擴增21種HPV基因型的目的片段，再將擴增產(chǎn)物與固定在膜條上的分型探針進行雜交，依據(jù)雜交信號的有無來判斷有無HPV DNA的存在。

1.4 HPV分型檢測

1.4.1 片段擴增 將無核水、PCR M ix、Taq酶、特異性引物與DNA樣本充分混勻，制備成25μl的反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5 s；變性95℃ 20 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 20 s，共進行40個循環(huán)。嚴格按照標準操作規(guī)程（standard operation procedure，SOP）進行操作。

1.4.2 導流雜交 將PCR產(chǎn)物加熱變性，之后冰上冷卻10 min。將含有特定核酸探針的薄膜固定在生物恒溫雜交儀上，生物恒溫雜交儀溫度控制溫度為45℃，將冷卻后的PCR產(chǎn)物置于薄膜上，使其流入膜內(nèi)進行雜交反應(yīng)，同時除去未結(jié)合的DNA。

1.4.3 結(jié)果判讀 將導流雜交的PCR產(chǎn)物加封閉液孵育5 min，重復(fù)2次并用封阻膜進行封阻。除去封閉液，加入酶標液后于25℃孵育3～4 min。采用緩沖液清洗掉多余的酶標液，加入底物顯色5 min，并于1 h內(nèi)判讀顯色結(jié)果，紫色實心點即為HPV對應(yīng)亞型陽性。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)-據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染情況的比較

研究組中29例患者發(fā)生HPV感染，對照組中78例患者發(fā)生HPV感染。研究組患者HPV的總感染率為29.0%（29/100），明顯低于對照組患者的78.0%（78/100），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=48.256，P＜0.01）。兩組HPV陽性患者中均是單一感染所占比例最高，二重感染所占比例次之，三重感染所占比例和四重感染所占比例最低。研究組與對照組HPV陽性患者的上述各感染所占比例比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 兩組HPV陽性患者HPV感染情況的比較[n（%）]

2.2 兩組HPV陽性患者基線特征的比較

兩組HPV陽性患者的年齡、民族、性生活史、婚姻狀況、職業(yè)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 兩組HPV陽性患者基線特征的比較

2.3 HPV高危亞型感染情況的比較

研究組與對照組HPV陽性患者中HPV16、HPV58、HPV52、HPV33和HPV18高危亞型的感染情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表3）

表3 兩組HPV陽性患者HPV高危亞型的感染情況

3 討論

隨著病毒的變異和女性社交觀念的改變，宮頸癌是中國女性婦科腫瘤中的高發(fā)疾病。由于宮頸癌的早期篩查在臨床上應(yīng)用廣泛，因此，近年來宮頸癌的發(fā)病率和病死率有所下降。CIN是宮頸癌的特異性癌前病變，能夠預(yù)示宮頸癌的發(fā)生，同時盡早地對CIN進行干預(yù)能夠逆轉(zhuǎn)宮頸癌的發(fā)生[7]。因此，早期診斷對于預(yù)防宮頸癌的發(fā)生，降低宮頸癌的發(fā)病率和病死率具有重要意義。TCT檢測是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的宮頸癌篩查方式，能夠通過鏡檢發(fā)現(xiàn)癌前病變細胞，區(qū)分炎癥與感染[8-9]。但有文獻報道，TCT檢測對于CINⅢ級病變的檢出率不高，具有較高的假陽性率，可達49.60%[10]。因此，僅依靠TCT檢測難以達到早期篩查宮頸癌的作用。高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的最主要的獨立危險因素。國內(nèi)外多篇文獻報道TCT檢測聯(lián)合HPV亞型檢測能夠提高宮頸癌的早期診斷率[11-13]。因此，本研究探討了TCT陰性的CINⅢ級患者HPV感染情況及感染亞型特點。

Xu等[6]分析了30 165例中國女性HPV陽性的宮頸癌標本，發(fā)現(xiàn)高危型HPV16感染是導致中國宮頸癌發(fā)生的最優(yōu)勢型別，HPV18、HPV52、HPV58在中國西部地區(qū)的感染率相對較高。本研究探究了TCT檢測結(jié)果為陰性的CINⅢ級患者感染HPV病毒亞型的特點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TCT陰性的CINⅢ級患者HPV的感染率為29.0%，其中，TCT陰性的CINⅢ級患者的HPV感染亞型以高危型HPV16為主，提示TCT陰性CINⅢ級漏檢HPV16的可能性更大。同時，HPV16的基因多態(tài)性較高，E7的高度突變對瘤變細胞的內(nèi)在生物代謝具有重要的影響，進而在CINⅢ級和宮頸癌的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用[14]，而這些改變在細胞形態(tài)學方面的差異難以被發(fā)現(xiàn)。其他高危型HPV依次為HPV58、HPV52、HPV33、HPV18，這與Xu等[6]的研究結(jié)果相符。HPV18在中國西南部地區(qū)的感染率僅次于HPV16，但本研究中TCT陰性的CINⅢ級患者HPV18的感染比例較低，提示TCT陰性CINⅢ級患者不易漏檢HPV18。因此，HPV16基因的高突變可能是引起TCT陰性的原因。進一步提示TCT陰性患者仍有存在HPV感染的風險，因此，應(yīng)聯(lián)合使用TCT與HPV亞型檢測，以進一步降低CINⅢ級患者的漏檢率。

近年來，許多HPV病毒多態(tài)性新位點被發(fā)現(xiàn)[14-16]。病毒多態(tài)性的產(chǎn)生原因可能是由于機體自身免疫系統(tǒng)對病毒的自然選擇，也可能是來源于多重感染過程中病毒的相互競爭。本研究發(fā)現(xiàn)TCT陰性的CINⅢ級患者的HPV感染以單一亞型感染為主，而HPV16亞型感染是單一亞型感染的主體，這與以往關(guān)于CINⅢ級患者HPV感染情況的報道結(jié)果類似[17]。在TCT陰性的CINⅢ級患者的HPV多重感染中，主要以二重感染為主，其中，HPV16聯(lián)合其他亞型感染是二重感染的主要特點。上述結(jié)果提示HPV16可能通過某種途徑誘發(fā)CIN形成，但TCT出現(xiàn)假陰性。

綜上所述，TCT陰性的CINⅢ級患者的HPV感染以單一亞型感染為主，HPV16單一感染或聯(lián)合其他亞型的多重感染是TCT陰性的CINⅢ級患者的主要特點，并推測HPV16可能因其具有病毒多態(tài)性而誘發(fā)CINⅢ級及宮頸癌的發(fā)生，造成了TCT檢測的漏診。盡管本研究發(fā)現(xiàn)了CINⅢ級患者的主要HPV感染亞型，但仍有不足之處，如本研究未明確不同HPV分型對CINⅢ級發(fā)生和發(fā)展的誘導機制，仍需進一步分析與探討，才能有效地預(yù)防、診斷及治療CINⅢ級，可將其作為下一步的研究方向。本研究提示臨床上應(yīng)更加關(guān)注TCT檢測聯(lián)合HPV亞型檢測對CINⅢ級及宮頸癌的早期診斷，尤其應(yīng)該注重HPV16亞型感染的早期預(yù)防和早期診斷。